劉敏，趙健，熊克仁

（皖南醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，安徽 蕪湖 241001 E-mail：89397329＠qq.com）

眼鏡蛇是我國(guó)劇毒蛇中分布最廣的蛇種之一，其毒素是以神經(jīng)毒素為主的混合毒素。一旦咬傷，局部出現(xiàn)劇烈疼痛，腫脹明顯，以及全身多器管功能衰竭，目前仍是醫(yī)學(xué)界治療難題之一［1］。c-fos和c-jun基因均是即刻早基因的成員，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)廣泛分布，正常情況下，有著低水平的表達(dá)，在受到傷害性刺激后，表達(dá)立即增加，因此，可作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)傷害性刺激反應(yīng)的標(biāo)志物［2］。丘腦腹后外側(cè)核（ventral posterolateral thalamic nucleus，VPL）是丘腦核團(tuán)之一，是痛覺傳導(dǎo)通路上的重要中繼站，可接受脊髓灰質(zhì)后角Rexed第Ⅳ～Ⅵ板層的纖維投射，將痛覺、觸覺及傷害性刺激等信息上傳至大腦皮層SI區(qū)，從而在痛覺的調(diào)發(fā)揮重要作用［3］。本實(shí)驗(yàn)旨在探討眼鏡蛇毒中毒后大鼠VPL區(qū)c-fos、c-jun表達(dá)變化，為臨床節(jié)中治療提供一些動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究的形態(tài)學(xué)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 24只成年SD 大鼠，雌雄不限，體重250g左右，由皖南醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 主要試劑 眼鏡蛇毒（干毒）由安徽省黃山市屯溪縣毒蛇養(yǎng)殖研究所提供，c-fos抗體和c-jun抗體均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及蛇傷動(dòng)物模型的建立 將24 只SD 大鼠隨機(jī)分成3組，眼鏡蛇毒組、生理鹽水組和正常對(duì)照組，每組8只。眼鏡蛇毒組：大鼠左后肢外側(cè)常規(guī)消毒后，將干粉狀眼鏡蛇毒與生理鹽水按1∶3 稀釋，按0.5μl／kg量于左后肢外側(cè)部肌肉注射，觀察30 min后，發(fā)現(xiàn)眼鏡蛇毒組大鼠左后肢紅腫，煩躁不安，嘴唇和四肢紫紺，呼吸困難等明顯中毒癥狀即確定模型成功；生理鹽水組：在相同部位注入等量生理鹽水；正常對(duì)照組不作任何處理。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色法 用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，暴露心臟，經(jīng)左心室-升主動(dòng)脈插管4%甲醛灌注固定。取丘腦節(jié)段放入4%多聚甲醛中固定24h，石蠟包埋，組織切片，片厚5μm，切片脫蠟脫水后，滴加新鮮配制的0.3%H2O2室溫（18～25℃）7～12min；微波修復(fù)，高火加熱2min，低火12min，自然冷卻；滴加封閉液（37 ℃）1h，不洗；滴加兔抗c-fos抗體（1∶150）、兔抗c-jun抗體（1∶1200）4 ℃過夜；37 ℃復(fù)溫，滴加生物素化羊抗兔IgG（37 ℃）2h；滴加SABC（37 ℃）1h；DAB顯色10～30min；以上各步驟之后均用0.02 MPBS洗5分／次×3次。流水沖洗阻斷反應(yīng)。常規(guī)脫水、透明、封片。

1.2.3 圖片分析 每只大鼠選取相同冠狀切面切片各2張，參照王平宇的腦切片圖譜，定位后利用黑馬病理圖像分析系統(tǒng)對(duì)每張切片相同區(qū)域在高倍（400倍）視野下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞平均灰度值測(cè)量。平均灰度值降低說明表達(dá)增強(qiáng)，反之，減弱。

2 結(jié)果

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，c-fos、c-jun免疫陽(yáng)性產(chǎn)物呈棕黃色顆粒狀，主要表達(dá)于細(xì)胞膜及胞漿。正常對(duì)照組、生理鹽水組和眼鏡蛇毒組VPL 區(qū)均可見c-fos、c-jun免疫陽(yáng)性細(xì)胞，細(xì)胞輪廓清晰，呈圓形或橢圓形。三組VPL區(qū)c-fos、c-jun免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量及平均灰度值比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Fc-fos＝250.79，P ＜0.01；Fc-fos＝63.08，P ＜0.01；Fc-jun＝93.82，P ＜0.001；Fc-jun＝40.63，P ＜0.001）。生理鹽水組VPL區(qū)c-fos、c-jun免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量及平均灰度值與正常對(duì)照組相比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）；眼鏡蛇毒組VPL區(qū)c-fos、cjun免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量與正常對(duì)照組和生理鹽水組比較明顯增多（P ＜0.05），染色變深，平均灰度值明顯降低（P ＜0.05），見表1、圖1。

表1 各組大鼠VPL的c-fos、c-jun陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及平均灰度值（±s，n＝8）

表1 各組大鼠VPL的c-fos、c-jun陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及平均灰度值（±s，n＝8）

注：與正常對(duì)照組比較，a：P ＜0.05

c-j組別c-fos細(xì)胞數(shù)（個(gè)／400倍視野）平均灰度值正常對(duì)照組 57.75±2.12 145.91±7.75 63.63±1.69 142.92±6平均灰度值un細(xì)胞數(shù)（個(gè)／400倍視野）.11生理鹽水組 58.63±1.85 144.07±6.35 63.50±2.45 138.1±7.11眼鏡蛇毒組 78.63±2.33a 116.41±1.88a 75.75±1.98a 119.41±1.79 a

圖1 正常對(duì)照組、生理鹽水組和眼鏡蛇毒組大鼠丘腦腹后外側(cè)核c-fos和c-jun蛋白的表達(dá)（SABC法×400）

3 討論

眼鏡蛇毒是由眼鏡蛇的毒腺分泌的一種天然毒性物質(zhì)，其中含有神經(jīng)毒素和細(xì)胞毒素。當(dāng)人被眼鏡蛇咬傷后，毒液經(jīng)血液和淋巴傳送，迅速與神經(jīng)突觸結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞溶解、神經(jīng)細(xì)胞信息傳導(dǎo)阻滯，從而影響正常的神經(jīng)細(xì)胞功能。即刻早期基因c-fos和cjun，生理情況下，在神經(jīng)細(xì)胞中可有基礎(chǔ)水平的表達(dá)，主要參與神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和信息傳遞等過程，當(dāng)神經(jīng)細(xì)胞受到傷害性刺激后，表達(dá)明顯增加，這與中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的病理過程有著密切關(guān)系［4］。c-fos蛋白是神經(jīng)細(xì)胞受損程度的標(biāo)記物，表達(dá)水平的高低，能間接反映神經(jīng)元的損害程度［5］。本研究結(jié)果顯示，與正常組或生理鹽水組比較，眼鏡蛇毒組大鼠VPL區(qū)c-fos和c-jun陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增加且平均灰度值明顯下降，提示c-fos和c-jun表達(dá)顯著增強(qiáng)，說明眼鏡蛇毒可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞不同程度的功能損傷。當(dāng)神經(jīng)細(xì)胞受到外界刺激后，興奮性氨基酸或NMDA 受體等被激活，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的增加激活Ca2＋-磷脂依賴性蛋白激酶途徑，進(jìn)而快速誘導(dǎo)c-jun和c-fos轉(zhuǎn)錄，使其細(xì)胞漿中的mRNA 數(shù)量快速增加，翻譯出的Fos 和Jun 蛋白進(jìn)入胞核內(nèi)并形成異源（Fos／Jun）或同源（Fos／Jun）二聚體，與基因中的轉(zhuǎn)錄因子-1（AP-1）調(diào)節(jié)位點(diǎn)結(jié)合，從而進(jìn)一步激活靶基因，使神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)與功能出現(xiàn)改變［6-7］。資料報(bào)道，c-fos、c-jun都是促凋亡基因，腦損傷動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行c-fos、c-jun基因表達(dá)與凋亡神經(jīng)元在時(shí)程、分布和數(shù)量上的相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)c-fos和c-jun高表達(dá)區(qū)域與細(xì)胞凋亡區(qū)域一致，提示c-fos和c-jun的表達(dá)可能在腦損傷導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的過程中起一定調(diào)控作用［8］。本實(shí)驗(yàn)中眼鏡蛇毒組大鼠VPL 區(qū)c-fos和c-jun的高表達(dá)是否參與了眼鏡蛇毒中毒后引起的細(xì)胞凋亡過程的調(diào)控，有待于進(jìn)一步的研究。

大鼠的VPL是傳導(dǎo)外周神經(jīng)疼痛的核團(tuán)之一，當(dāng)外周神經(jīng)末梢受到刺激時(shí)，此信息經(jīng)痛覺傳入纖維傳至脊神經(jīng)節(jié)，再經(jīng)脊髓丘腦側(cè)束、脊髓丘系傳至VPL，最后投射到大腦皮層感覺區(qū)，產(chǎn)生痛覺。各種傷害性刺激如疼痛、創(chuàng)傷等傳入脊髓后，痛感受神經(jīng)元被激活，啟動(dòng)原癌基因c-fos合成Fos蛋白，進(jìn)而導(dǎo)致痛覺的發(fā)生［9］。最近研究顯示，減少c-fos、c-jun的表達(dá)，可抑制痛覺信息的傳遞［10］。本實(shí)驗(yàn)對(duì)大鼠注射眼鏡蛇毒造成一種傷害性刺激，通過免疫組化觀察到，眼鏡蛇毒可以上調(diào)大鼠VPL 區(qū)c-fos和c-jun 的表達(dá)，提示眼鏡蛇毒可能通過上調(diào)VPL區(qū)的c-fos和c-jun表達(dá)從而在傷害性信息的傳導(dǎo)過程中發(fā)揮重要的作用。

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