羅衛(wèi)民 郭家龍 劉華 劉斌 羅湘玉 羅玲 張軍

442000湖北省十堰市太和醫(yī)院胸心大血管外科1

430000武漢華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)內(nèi)科2

BJO對EC109細(xì)胞增殖和凋亡作用的研究

羅衛(wèi)民1郭家龍1劉華1劉斌2羅湘玉1羅玲1張軍1

442000湖北省十堰市太和醫(yī)院胸心大血管外科1

430000武漢華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)內(nèi)科2

目的：探討不同濃度的鴉膽子油乳對食管癌EC109細(xì)胞增殖和凋亡的作用。方法：利用MTT法檢測食管癌EC109細(xì)胞增殖，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)和Hoechest33342法測細(xì)胞凋亡。結(jié)果：鴉膽子油乳對管癌EC109細(xì)胞增殖和凋亡具有作用并且具有劑量依賴性作用。結(jié)論：鴉膽子可通過對細(xì)胞的形態(tài)，對細(xì)胞周期、對凋亡基因及細(xì)胞免疫功能的影響來抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。

鴉膽子油乳；食管癌細(xì)胞；細(xì)胞增殖和凋亡

鴉膽子油乳在臨床中被應(yīng)用于多種惡性腫瘤的輔助治療，但在食管癌中的作用機(jī)制尚未明確。本文研究鴉膽子油乳對食管癌細(xì)胞作用的機(jī)制，為該藥在食管癌治療中的應(yīng)用提供證據(jù)。

資料與方法

傳代培養(yǎng)食管癌EC109細(xì)胞。

實(shí)驗(yàn)分組：將生長良好的細(xì)胞分為正常細(xì)胞對照組和A、B、C 3個(gè)試驗(yàn)組，試驗(yàn)組中分別加入藥物濃度為5 μg/ mL、10 μg/mL、20 μg/mL的鴉膽子油乳，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

MTT法檢測EC9706細(xì)胞增殖：①M(fèi)TT溶液配置：稱取250 mg MTT，加50 mL PBS，在電磁力攪拌機(jī)上攪拌30 min，用直徑0.22 μm的微孔過濾器除菌，分裝，4℃保存，2周內(nèi)使用。②取對數(shù)期生長的EC109細(xì)胞1瓶，PBS洗滌2次，0.25%胰蛋白酶消化，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液配成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，接種4×103/孔濃度的細(xì)胞150 μL于96孔培養(yǎng)板，共種3塊培養(yǎng)板。置5%CO2，飽和濕度37℃溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)。③EC109細(xì)胞培養(yǎng)16 h后更換培養(yǎng)基，每孔加入180 μL DMEM培養(yǎng)液，按不同分組進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，繼續(xù)置5% CO2，飽和濕度37℃溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)。④各組EC109細(xì)胞培養(yǎng)24 h、48 h及72 h后，每孔加20 μL MTT(5 mg/mL)溫箱內(nèi)繼續(xù)孵育。4 h后，小心吸棄孔內(nèi)液體，加150 μL二甲基亞砜溶解沉淀，振蕩l0 min，溶解結(jié)晶物。⑤比色：選擇570 nm波長，空白對照調(diào)零，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔吸光度值(A值)，記錄結(jié)果，描繪MTT增殖曲線。

流式細(xì)胞術(shù)檢測EC9706細(xì)胞凋亡：①在細(xì)胞轉(zhuǎn)染72 h后，分別收集6孔板中分組培養(yǎng)的細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)液，之后常規(guī)消化細(xì)胞。細(xì)胞消化下來后，分別加入上步驟中所收集的細(xì)胞培養(yǎng)液，稍混勻，轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，1 000 g離心5 min，棄上清，收集細(xì)胞，用PBS輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。②取5～10萬重懸的細(xì)胞，1 000 g離心5 min，棄上清，加入195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液(1X)輕輕重懸細(xì)胞。③加入 5 μ L Annexin V-FITC，輕輕混勻。④20～25℃避光孵育10 min。⑤1 000 g離心5 min，棄上清，加入190 μL Annexin V-FITC結(jié)合液(1X)輕輕重懸細(xì)胞。⑥加入10 μL碘化丙啶(PI)染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置。⑦隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測，Annexin V-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。

Hoechest33342法測凋亡：①取普通潔凈蓋玻片于70%乙醇中浸泡至少5 min，無菌超凈臺內(nèi)吹干或用細(xì)胞培養(yǎng)級PBS洗滌3遍，再用細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌1遍。將蓋玻片置于6孔板內(nèi)，種入細(xì)胞培養(yǎng)過夜，使約為50%～80%滿。②按不同分組進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，吸盡培養(yǎng)液，加入固定液，固定10 min。③去固定液，用PBS洗兩遍，吸盡液體。④加入終濃度10 μg/mL的Hoechst33342染色液，染色5 min。手動(dòng)晃動(dòng)數(shù)次。⑤用PBS洗2遍。⑥將貼有細(xì)胞的蓋玻片蓋于載玻片上，盡量避免氣泡。⑦熒光顯微鏡檢測。

結(jié)果

鴉膽子油乳對管癌EC109細(xì)胞增殖和凋亡具有作用。不同濃度的鴉膽子油乳具有劑量依賴性作用。

討論

鴉膽子對腫瘤細(xì)胞的作用：①鴉膽子對細(xì)胞形態(tài)的影響：鴉膽子可以使細(xì)胞變圓，胞漿濃縮，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大小不等的空泡，泡內(nèi)容物電子密度與基質(zhì)相似，細(xì)胞核不規(guī)則，染色質(zhì)邊集濃縮，呈斷裂狀，部分線粒體腫脹、空泡化，可見凋亡小體形成。②鴉膽子對細(xì)胞周期的影響：鴉膽子油乳對癌細(xì)胞G0、G1、S、G2、M期有殺傷和抑制作用，能明顯抑制腫瘤細(xì)胞DNA的合成，該藥能直接進(jìn)入癌細(xì)胞，通過影響質(zhì)膜系統(tǒng)和線粒體，使之變性壞死。③鴉膽子對bcl-2基因的影響：bax功能與bcl-2截然相反，是促進(jìn)細(xì)胞死亡的基因，兩者在細(xì)胞中常協(xié)同表達(dá)，形成同源二聚體，按其比值共同調(diào)控著細(xì)胞的凋亡過程。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)鴉膽子油乳作用后p53和Bcl-2在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)均下降。

鴉膽子對細(xì)胞免疫功能的影響：鴉膽子油乳注射液用于晚期肺癌的化療組外周CD3+、CD4+、CD8+、CD5+明顯升高。說明鴉膽子油乳注射液聯(lián)合化療比單用化療能明顯提高機(jī)體免疫功能，且可減少化療不良反應(yīng)。

綜上所述，鴉膽子可通過對細(xì)胞的形態(tài)，對細(xì)胞周期、對凋亡基因及細(xì)胞免疫功能的影響來抑制腫瘤細(xì)胞的增值。

[1]李英,徐功立,李穎,等.鴉膽子油乳誘導(dǎo)白血病U937細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究[J].中華血液學(xué)雜志,2004,25(6):381.

[2]劉悅王,禾符,庚慶吉,等.鴉膽子油乳對膀胱癌影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].中華泌尿外科雜志,2001,22(6):336-338.

[3]韓宇,楊承漢.食管癌中nm-32H1基因突變與癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系[J].新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2001, 18(4):238-239.

Research of BJO on EC109 cell proliferation and apoptosis

Luo Weimin1,Guo Jialong1,Liu Hua1,Liu Bin2,Luo Xiangyu1,Luo Ling1,Zhang Jun1
Department of Chest Big Vascular Surgery,Taihe Hospital,Shiyan City,Hubei Province 4420001
Department of Internal Medicine-Neurology,Wuhan Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology 4300002

Objective:To investigate the effect of Brucea javanica oil emulsion with different concentrations on the proliferation and apoptosis of esophageal cancer EC109 cells.Methods:We detected the proliferation of esophageal cancer cell line EC109 by used the MTT method,measured the cell apoptosis by flow cytometry and Hoechest33342 method.Results:Brucea javanica oil emulsion had the effect on proliferation and apoptosis of cancer cells EC109 tube and has a dose dependent effect.Conclusion: Brucea Javanica can through the effect of cell morphology,cell cycle,apoptosis gene and cell immune function to inhibit the proliferation of tumor cells.

Brucea javanica oil emulsion;Esophageal cancer cells;Cell proliferation and apoptosis

10.3969/j.issn.1007-614x.2015.7.2