白雙勇，王劍松，趙慶華

（昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院1.泌尿外科；2.婦科，昆明 650101）

·論著·

肥胖男性不育患者精子線粒體膜電位、游離脂肪酸、活性氧的關(guān)系

白雙勇1，王劍松1，趙慶華2

（昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院1.泌尿外科；2.婦科，昆明 650101）

目的探討肥胖男性不育患者精子線粒體膜電位的改變，以及線粒體膜電位與精漿中游離脂肪酸、活性氧之間的關(guān)系。方法按照研究條件，隨機(jī)整群選取正常生育男性51人（對(duì)照組）、正常體重指數(shù)不育男性36人（正常體重不育組）、超重不育男性44人（超重不育組）、肥胖不育男性45人（肥胖不育組）。精液常規(guī)分析，ELSA法檢測(cè)精漿中游離脂肪酸、活性氧，流式細(xì)胞儀檢測(cè)精子線粒體膜電位。結(jié)果線粒體膜電位正常率的比較中正常體重不育組（27.34%±13.38%）、超重不育組（28.26%±9.76%）、肥胖不育組（25.27%±7.51%）均低于對(duì)照組（35.12%±15.90%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。肥胖不育組中線粒體膜電位正常率雖然低于正常體重不育組及超重不育組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。精子線粒體膜電位正常率與精子前向運(yùn)動(dòng)率呈明顯正相關(guān)（r=0.29，P＜0.01）。精漿中游離脂肪酸與精漿中活性氧呈明顯正相關(guān)（r=0.30，P＜0.01），精漿中活性氧與精子正常線粒體膜電位呈明顯負(fù)相關(guān)（r=-0.24，P＜0.01）。結(jié)論超重及肥胖男性不育患者精漿中游離脂肪酸增高，引起活性氧增加，活性氧使得線粒體膜電位下降，最終可能導(dǎo)致精子運(yùn)動(dòng)能力下降。治療時(shí)應(yīng)考慮建議患者減少高脂餐、適當(dāng)運(yùn)動(dòng)。

肥胖；男性不育；活性氧；游離脂肪酸；線粒體膜電位

隨著全球人口肥胖率上升，肥胖對(duì)生育的影響逐漸引起人們的重視。研究顯示，肥胖可能增加男性不育率［1］。肥胖男性內(nèi)臟脂肪堆積，過(guò)多的游離脂肪酸（free fatty acid，F(xiàn)FA）在進(jìn)行氧化過(guò)程中產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS）［2］。在低水平時(shí)ROS可以調(diào)節(jié)精子生理功能，包括精子獲能、頂體反應(yīng)、線粒體鞘穩(wěn)定性和精子的運(yùn)動(dòng)性。但是過(guò)量的ROS及其代謝產(chǎn)物可能損傷DNA、脂質(zhì)、蛋白，改變酶系統(tǒng)，影響精子線粒體功能，改變精子線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP），而精子運(yùn)動(dòng)能力的維持主要依賴于線粒體提供的能量［3］。本研究目的是探討在肥胖男性精子MMP與精漿中ROS、FFA三者之間的關(guān)系，為臨床分析肥胖男性不育病因以及診治提供一定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 一般資料

本研究在昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)同意下進(jìn)行，每個(gè)參與的患者都被告知相應(yīng)的權(quán)利。在2013年3月至12月于昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院生殖中心就診的人群中隨機(jī)整群抽取男性。男性不育癥標(biāo)準(zhǔn)：有規(guī)律性生活未避孕1年而未使妻子受孕的男性。根據(jù)中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)2013年10月1日實(shí)施衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的成人體質(zhì)量判定標(biāo)準(zhǔn)，男性正常體重指數(shù)（body mass index，BMI）標(biāo)準(zhǔn)：24.00 kg/m2＞BMI≥18.5 kg/m2；超重組：28.00 kg/m2＞BMI≥24.0 kg/m2；肥胖組：BMI≥28.0 kg/m2。排除標(biāo)準(zhǔn)：與超重/肥胖無(wú)關(guān)的疾病或異常病史（包括精索靜脈曲張、隱睪癥、腫瘤、男性絕育術(shù)、睪丸扭轉(zhuǎn)）；嚴(yán)重附屬性腺炎癥；有明顯的影響生育力的毒物接觸，如農(nóng)藥廠、電焊、油漆等工作人群；嚴(yán)重少弱精癥和無(wú)精子癥。隨機(jī)整群抽取來(lái)生殖中心就診已經(jīng)生育健康一孩且BMI正常男性51人為對(duì)照組，正常BMI不育男性36人（正常體重不育組），超重不育男性44人（超重不育組），肥胖不育男性45人（肥胖不育組）。

1.2 方法

1.2.1 精液分析：所有參與課題男性不育癥患者禁欲48～72 h后，通過(guò)手淫辦法獲取精液，嚴(yán)格按照世界衛(wèi)生組織2010年第5版人類精液檢驗(yàn)與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)要求，由昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院男科實(shí)驗(yàn)室工作人員按操作規(guī)程精液常規(guī)分析。

1.2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)精子MMP：制備單細(xì)胞懸液：取10萬(wàn)個(gè)精子，重懸于0.5 mL細(xì)胞培養(yǎng)液中。加入0.5 mL JC-1染色工作液（購(gòu)于碧云天生物技術(shù)公司，MMP檢測(cè)試劑盒JC-1），顛倒數(shù)次混勻。細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃孵育20 min。600 g、4℃離心3～4 min，沉淀細(xì)胞。棄上清，用JC-1染色緩沖液洗滌2次。加入1 mL JC-1染色緩沖液重懸細(xì)胞，600 g、4℃離心3～4 min，沉淀細(xì)胞，棄上清。再用適量JC-1染色緩沖液重懸后，行流式細(xì)胞儀分析。把試劑盒中提供的CCCP（10 mmol/L）推薦按照1：1 000的比例加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中，稀釋至10 μmol/L，處理細(xì)胞20 min。隨后按照下述方法裝載JC-1，進(jìn)行MMP的檢測(cè)。10 μmol/L CCCP處理20 min后線粒體的膜電位會(huì)完全喪失，JC-1染色后觀察應(yīng)呈綠色熒光。未經(jīng)10 μmol/L CCCP處理的精子為陰性對(duì)照。流式細(xì)胞儀（FACSCalibur型，美國(guó)BD公司）檢測(cè)JC-1單體時(shí)可以把激發(fā)光設(shè)置為490 nm，發(fā)射光設(shè)置為530 nm；檢測(cè)JC-1聚合物時(shí)，可以把激發(fā)光設(shè)置為525 nm，發(fā)射光設(shè)置為590 nm。綠色熒光說(shuō)明MMP下降，該細(xì)胞很可能處于細(xì)胞凋亡早期。紅色熒光說(shuō)明MMP比較正常，細(xì)胞的狀態(tài)也比較正常。

1.2.3 檢測(cè)精漿中FFA、ROS：精液相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)后，將精液標(biāo)本經(jīng)2 000 g離心25 min獲取精漿，行ELISA（上海鑫樂(lè)生物有限公司試劑盒）檢測(cè)精漿中ROS、FFA。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對(duì)應(yīng)的吸光度計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣品的吸光度在回歸方程上計(jì)算出對(duì)應(yīng)的樣品濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件導(dǎo)入數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)以表示，采用單因素方差分析比較，LSD分析各組間差異，Person相關(guān)性分析檢測(cè)各因素之間的相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同BMI組男性不育患者中精液分析、精漿中ROS、FFA、精子正常MMP率及MMP下降率比較

在精液各項(xiàng)指標(biāo)比較中，超重不育組精子活動(dòng)率高于正常體重不育組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。精漿FFA的比較中，超重不育組及肥胖不育組高于對(duì)照組及正常體重不育組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在精漿ROS水平比較中，肥胖不育組高于對(duì)照組、正常體重不育組、超重不育組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在各組精液中精子正常MMP率的比較中，3個(gè)不育組均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而3個(gè)不育組的比較中，肥胖不育組中正常MMP率雖然低于正常體重不育組及超重不育組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。在MMP下降率的比較中，3個(gè)不育組均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 BMI、精漿中ROS、FFA、精子正常MMP率、MMP下降率與精液常規(guī)各項(xiàng)指標(biāo)相關(guān)性分析

BMI與精子濃度呈正相關(guān)（r=0.17，P＜0.05），與精子正常MMP率呈負(fù)相關(guān)（r=-0.17，P＜0.05），與精子MMP下降率呈正相關(guān)（r=0.18，P＜0.05）。BMI與精漿中FFA呈明顯正相關(guān)（r=0.56，P＜0.01），與精漿中ROS呈明顯正相關(guān)（r=0.44，P＜0.01）。精子正常MMP率與精子前向運(yùn)動(dòng)率呈明顯正相關(guān)（r=0.29，P＜0.01），而精子MMP下降率與精子活動(dòng)率呈負(fù)相關(guān)（r=-0.27，P＜0.05），與精子前向運(yùn)動(dòng)率呈明顯負(fù)相關(guān)（r=-0.24，P＜0.01）。精漿中FFA與精漿中ROS呈明顯正相關(guān)（r=0.30，P＜0.01），精漿中ROS與精子正常MMP率呈明顯負(fù)相關(guān)（r=-0.24，P＜0.01）。見(jiàn)表2。

表1 不同BMI男性不育患者M(jìn)MP及精漿中ROS、FFA的比較Tab.1 Comparison of ROS，F(xiàn)FA in the seminal plasma and MMP in different BMI infertile patient groups

表2 男性不育患者中精液指標(biāo)、MMP、精漿中ROS、FFA及BMI相關(guān)性分析Tab.2 Correlation analysis of ROS，F(xiàn)FA in the seminal plasma，BMI，MMP and semen analysis

3 討論

線粒體的呼吸鏈?zhǔn)菣C(jī)體產(chǎn)生ROS的主要部位，呼吸鏈的各復(fù)合體在傳遞電子的過(guò)程中，由于將漏出的電子直接交給氧，產(chǎn)生部分被還原的氧，所以得到ROS這樣的“副產(chǎn)物”，特別O2-產(chǎn)生主要來(lái)自呼吸鏈。復(fù)合體Ⅲ中通過(guò)Q循環(huán)傳遞電子，接受單電子的半醌型QH-在內(nèi)膜中自由移動(dòng)，通過(guò)非酶促反應(yīng)直接將單個(gè)電子泄露給O2而生成O2-［5］。

肥胖患者中有較高水平的FFA，導(dǎo)致線粒體產(chǎn)生過(guò)量ROS［5］。有研究［6］發(fā)現(xiàn)在小鼠脂肪前體細(xì)胞中添加FFA，24 h后該細(xì)胞ROS明顯上升。Erdemir等［7］發(fā)現(xiàn)肥胖導(dǎo)致睪丸內(nèi)ROS增加，ROS類能使脂質(zhì)氧化、蛋白質(zhì)硝基化而損傷細(xì)胞膜和膜蛋白。羥自由基可直接引起蛋白質(zhì)、核酸等各種生物分子的氧化損傷而喪失功能，進(jìn)而破壞細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)和功能。線粒體是細(xì)胞產(chǎn)生ROS的主要部位，因此線粒體DNA、基質(zhì)中的酶最易融到ROS攻擊而損傷［8］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)肥胖不育組精漿中FFA高于對(duì)照組、正常體重不育組、超重不育組，與后3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在精漿中ROS水平比較中，肥胖不育組精漿中FFA高于對(duì)照組、正常體重不育組、超重不育組，與后3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。超重不育組精漿中ROS含量高于對(duì)照組及正常體重不育組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而正常體重不育組與對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。精漿中FFA與精漿中ROS呈明顯正相關(guān)，與前兩者研究結(jié)果相似。ROS被認(rèn)為是男性不育的重要病因，有研究發(fā)現(xiàn)［9］在30%～40%男性不育患者精漿中發(fā)現(xiàn)ROS水平增加。精子容易受到ROS攻擊，而且缺乏細(xì)胞內(nèi)酶修復(fù)系統(tǒng)，主要是由于精子膜富含多不飽和脂肪酸，易受氧的作用和損傷，出現(xiàn)脂質(zhì)過(guò)氧化，繼而快速大量ATP喪失，導(dǎo)致精子運(yùn)動(dòng)能力下降［10］。

線粒體正常膜電位主要是依賴于位于線粒體基質(zhì)和線粒體膜間隙內(nèi)的質(zhì)子泵，使得基質(zhì)與膜之間不同的質(zhì)子保持一定電化學(xué)梯度。當(dāng)線粒體內(nèi)ROS過(guò)度增加時(shí)，MMP下降。Ferramosca等［11］發(fā)現(xiàn)線粒體呼吸鏈的效率與精子活動(dòng)率呈正相關(guān)，而與精子不活動(dòng)率呈負(fù)相關(guān)，在其隨后的研究［12］中進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)精子活動(dòng)率不僅與線粒體呼吸鏈功能呈正相關(guān)，與ROS呈負(fù)相關(guān)，且線粒體呼吸鏈功能受到ROS的抑制作用。Mupfiga等［13］認(rèn)為MMP與精液中ROS有明顯相關(guān)性，而與精液中白細(xì)胞數(shù)量無(wú)相關(guān)性。La Vignera［14］的研究結(jié)果顯示，在超重和肥胖男性與對(duì)照組精子MMP下降率的比較中，后兩者增高。在各組精液中精子正常MMP率的比較中，正常體重不育組、超重不育組、肥胖不育組3組均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而3組不育人群的比較中，肥胖不育組正常MMP率雖然低于正常體重不育組及超重不育組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在MMP下降率的比較中，結(jié)果與正常MMP率一致。精子正常MMP率與精子前向運(yùn)動(dòng)率呈明顯正相關(guān)，而精子MMP下降率與精子活動(dòng)率呈負(fù)相關(guān)，與精子前項(xiàng)運(yùn)動(dòng)率呈明顯負(fù)相關(guān)。精漿中ROS與精子正常MMP率呈明顯負(fù)相關(guān)。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示由于超重及肥胖男性不育患者精漿中FFA增高，引起ROS增加，ROS使得MMP下降，最終可能導(dǎo)致精子運(yùn)動(dòng)能力下降。該結(jié)果對(duì)于臨床超重、肥胖男性不育的病因分析及診治提供了一定參考，在治療肥胖及超重男性不育患者時(shí)，應(yīng)該考慮改變其不良的生活、飲食習(xí)慣，減少高脂餐的攝入，適量運(yùn)動(dòng)。但由于本次研究樣本數(shù)量有限，還需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量去證實(shí)該結(jié)果。

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（編輯 陳 姜）

Relationship ofFree Fatty Acid，Reactive Oxygen Speciesand Sperm MitochondrialMembrane Potentialin Obese Male Infertility Patients

BAIShuang-yong1，WANGJian-song1，ZHAOQing-hua2
（1.Department of Urology，The Second Affiliated Hospital，Kunming Medical University，Kunming 650101，China；2.Department of Gynecology，The Second Affiliated Hospital，Kunming MedicalUniversity，Kunming 650101，China）

Objective To investigate the change ofsperm mitochondrialmembrane potentialin obese male infertility patients，and to explore the relationship of sperm mitochondrial membrane potential with the reactive oxygen species and free fatty acids in seminal plasma.MethodsAccording to the research conditions，samples were randomly selected by clustersampling from outpatient，and divided into normalbody massindex fertile men as control group（n=51），normal body mass index infertile group（n=36），overweight infertile group（n=44），and obesity infertile group（n=45）. Semen routine analysis was performed.Free fatty acid and reactive oxygen species in the seminal plasma was determined by ELSA method，sperm mitochondrial membrane potential was determined by flow cytometry.ResultsThe rate of normal sperm mitochondrial membrane potential in normal weight infertility（27.34%±13.38%），overweight infertility（28.26%±9.76%），obesity infertility group（25.27%±7.51%）were lower than the control group（35.12%±15.90%），the difference was statistically significant（P＜0.05）.Although obesity infertility group normal rate of mitochondrial membrane potential were lower than normal weight infertility group and the overweight infertility group，but there was no statistically significant difference.The rate ofsperm normalmitochondrialmembrane potentialwas positively correlated with the rate ofsperm progressive motility（r=0.29，P＜0.01）.Free fatty acid was positively correlated with reactive oxygen species in seminal plasma（r=0.30，P＜0.01），reactive oxygen species in seminal plasma was negatively correlated with sperm normal mitochondrial membrane potential（r=-0.24，P＜0.01）.ConclusionFree fatty acid was elevated in the seminal plasma of overweight and obese patients with male infertility，which causes increased reactive oxygen species，reduced mitochondrial membrane potential，and eventually lead to the decline of sperm movement ability.Patients undergoing the treatment should be advised to reduce the high fatdietand perform properexercise.

obesity；male infertility；reactive oxygen species；free fatty acid；mitochondrial membrane potential

R698

A

0258-4646（2015）07-0653-04

白雙勇（1972-），男，副主任醫(yī)師，博士研究生.

王劍松，E-mail：jiansongwang@yahoo.com

2014-12-30

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