論著

不同時(shí)間持續(xù)缺氧對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞脂肪因子基因表達(dá)的影響

肥胖是由于能量代謝平衡失調(diào)，攝入過多和/或耗能不足致使脂肪容量增多的狀態(tài)，常伴有胰島素抵抗（IR）和高胰島素血癥、血脂異常及低度炎性狀態(tài)，是發(fā)展為2型糖尿病和心血管疾病的一個(gè)最重要的危險(xiǎn)因子。大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查研究顯示，肥胖已經(jīng)成為一個(gè)全球性健康問題，其發(fā)生率呈逐年增長(zhǎng)趨勢(shì)[1]。隨著肥胖因素在代謝綜合征和心血管疾病病因中的重要作用越來(lái)越被深入地認(rèn)識(shí)，脂肪組織獲得了巨大的科研價(jià)值，其中脂肪組織的內(nèi)分泌功能紊亂在肥胖及IR中所起的作用受到越來(lái)越多的關(guān)注。脂肪因子是內(nèi)臟脂肪組織分泌的活性產(chǎn)物，脂肪細(xì)胞分泌脂肪因子失衡與代謝綜合征、2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展存在著密切的聯(lián)系。Trayhurn等[2]認(rèn)為缺氧是肥胖者脂肪因子調(diào)節(jié)紊亂的重要始動(dòng)因素，并由此誘導(dǎo)了脂肪組織炎癥反應(yīng)發(fā)生，導(dǎo)致IR的發(fā)生。本研究通過建立持續(xù)低氧脂肪細(xì)胞模型，模擬肥胖組織缺氧變化，探討不同時(shí)間持續(xù)缺氧對(duì)3T3-L1細(xì)胞表達(dá)脂肪因子水平的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 3T3-L1脂肪細(xì)胞株由加拿大AmiraKlip教授提供，Hanks液、DMEM高糖購(gòu)自美國(guó)Gibico公司，胎牛血清購(gòu)自以色列Bioind公司，胰島素、1-甲基-3-異丁基-黃嘌呤（IBMX）、地塞米松溶液購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，高純總RNA提取試劑盒、cDNA合成試劑盒購(gòu)自北京天根公司，引物購(gòu)自北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司，TOP熒光定量試劑盒 (TransStart?Top Green qPCR SuperMix、Passive Reference Dye)購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。主要儀器：細(xì)胞孵育箱、缺氧箱（芬蘭熱電公司Thermo Electron Corporation,Model3111），實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）儀為ABI7500。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞模型選用3T3-L1前脂肪細(xì)胞株。將復(fù)蘇的3T3-L1前脂肪細(xì)胞在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中，用含有10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。待觀察到細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶底壁，將細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，并每2 d換液1次，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。觀察到6孔板中細(xì)胞長(zhǎng)滿后，繼續(xù)培養(yǎng)2 d。之后加入含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基及含0.5 mmol/L IBMX、0.25μmol/L地塞米松、10mg/L胰島素的分化液，培養(yǎng)48 h，再以含10mg/L胰島素的培基培養(yǎng)48 h。隨后換用含10%FBS的高糖DMEM的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，每2 d換液1次。觀察細(xì)胞可見在誘導(dǎo)分化10～12 d后，90%以上的3T3-L1細(xì)胞內(nèi)含有大量串狀脂滴，呈脂肪細(xì)胞表型。對(duì)誘導(dǎo)分化14 d后的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)處理。

1.2.2 分組及處理 將細(xì)胞分為6組，設(shè)置常氧組和缺氧組。常氧組為對(duì)照組（缺氧0 h），置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。缺氧組為實(shí)驗(yàn)組，將細(xì)胞分別置于37℃、1%O2、5%CO2、94%N2下分別孵育4、12、24、48 h和72 h。每組6孔。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定脂肪細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子1（GLUT-1）mRNA水平 按照總RNA提取試劑盒步驟提取上述脂肪細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)確定總RNA濃度及純度。嚴(yán)格按照cDNA第一鏈合成試劑盒（20μL體系）說(shuō)明，取2μgRNA合成cDNA第一鏈。取2 μL合成的cDNA產(chǎn)物及相應(yīng)的上下游引物（表1）加入20μLTransStart?Top Green qPCR SuperMix體系內(nèi)擴(kuò)增，條件為94℃30 s，94℃5 s，60℃34 s，40個(gè)循環(huán)，β-actin作為內(nèi)參。以β-actin基因的表達(dá)量作為內(nèi)參來(lái)校正目的基因的表達(dá)量，結(jié)果數(shù)值以Ct值表示，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)做3個(gè)復(fù)孔，取平均值，結(jié)果以2-ΔΔCt表示。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

1.2.4 qRT-PCR測(cè)定脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素、瘦素mRNA水平 提取脂肪細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)確定總RNA濃度及純度。嚴(yán)格按照cDNA第一鏈合成試劑盒（20μL體系）說(shuō)明，取2μgRNA合成cDNA第一鏈。取2μL合成的cDNA產(chǎn)物及相應(yīng)的上下游引物（表1）加入20μLTransStart?Top Green qPCRSuperMix體系內(nèi)擴(kuò)增，條件為94℃30 s，94℃5 s，60℃34 s，40個(gè)循環(huán)，β-actin作為內(nèi)參。以βactin基因的表達(dá)量作為內(nèi)參來(lái)校正目的基因的表達(dá)量，結(jié)果數(shù)值以Ct值來(lái)表示，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)做3個(gè)復(fù)孔，取平均值，結(jié)果以2-ΔΔCt表示。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

表1 qRT-PCR引物序列Tab 1 Geneprimer sequencesused for qRT-PCR

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析 (One-Way ANOVA)，組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同時(shí)間持續(xù)缺氧后脂肪細(xì)胞 HIF-1α、GLUT-1mRNA表達(dá)水平變化 與常氧組相比，缺氧培養(yǎng)的脂肪細(xì)胞HIF-1α、GLUT-1mRNA表達(dá)水平升高，并且在缺氧24 h達(dá)到最高水平。72 h缺氧組HIF-1α、GLUT-1mRNA表達(dá)水平與常氧組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。HIF-1αmRNA表達(dá)在4 h缺氧組為常氧組的（1.36±0.34）倍；缺氧12 h為對(duì)照組的（2.52± 0.44）倍；24 h缺氧組為對(duì)照組的（5.82±0.52）倍；缺氧48 h為常氧組的（4.27±0.39）倍；72 h缺氧組為常氧組的（1.76±0.61）倍。4 h缺氧組HIF-1αmRNA表達(dá)較常氧組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。12 h缺氧組、24 h缺氧組及48h缺氧組HIF-1αmRNA表達(dá)較常氧組及4 h缺氧組均有升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。48 h缺氧組及72 h缺氧組HIF-1αmRNA表達(dá)較24 h有所下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖1。GLUT-1mRNA表達(dá)缺氧4 h組為對(duì)照組（1.14±0.44）倍；缺氧12 h時(shí)為常氧組的（2.18±0.43）倍；缺氧24 h組為常氧組的（5.96±0.63）倍；缺氧48 h組為常氧組的（1.71±0.18）倍；72 h缺氧組為常氧組的（1.23±0.15）倍，見圖2。其中12、24、48 h缺氧組GLUT-1mRNA表達(dá)升高較常氧組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。48 h缺氧組及72 h缺氧組GLUT-1mRNA表達(dá)較24 h缺氧組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 不同時(shí)間持續(xù)缺氧孵育后脂肪細(xì)胞HIF-1α基因表達(dá)Fig 1 Theexpression of HIF-1αat different incubation timeof hypoxia in adipocytes

圖2 不同時(shí)間持續(xù)缺氧孵育后脂肪細(xì)胞GLUT-1基因表達(dá)Fig 2 The expression of GLUT-1 at different incubation time of hypoxia in adipocytes

2.2 不同時(shí)間持續(xù)缺氧后脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素、瘦素mRNA表達(dá)水平變化 與常氧組相比，缺氧組脂聯(lián)素mRNA的表達(dá)整體呈下降趨勢(shì)。脂聯(lián)素mRNA表達(dá)水平在4 h缺氧組為對(duì)照組的（0.87±0.20）倍；12 h缺氧組為常氧組的（0.35±0.12）倍；缺氧24 h組為常氧組的（0.21±0.09）倍；缺氧48 h組為常氧組的（0.19±0.09）倍；72 h缺氧組為常氧組的（0.61±0.18）倍。與常氧組相比較，缺氧組脂聯(lián)素mRNA表達(dá)水平下降，其中12 h缺氧組、24 h缺氧組、48 h缺氧組、72 h缺氧組mRNA的下降較對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與24 h、48 h缺氧組相比，72 h脂聯(lián)素mRNA表達(dá)有所上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖3。瘦素mRNA的表達(dá)缺氧組呈現(xiàn)高于常氧組的趨勢(shì)。瘦素mRNA在4 h缺氧組是常氧組的（2.15±0.23）倍；缺氧12 h組是常氧組的（2.64±0.37）倍；缺氧24 h組是常氧組的（5.70±0.52）倍；48 h缺氧組是常氧組的（3.19±0.31）倍；缺氧72 h是常氧組的（3.95±0.30）倍。與常氧組相比，4、12、24、48、72 h缺氧組的瘦素mRNA的表達(dá)均有升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。48 h及72 h缺氧組較24 h缺氧組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖4。

圖3 不同時(shí)間持續(xù)缺氧孵育后脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素基因表達(dá)Fig 3 Theexpression of adiponectin at different incubation time of hypoxia in adipocytes

圖4 不同時(shí)間持續(xù)缺氧孵育后脂肪細(xì)胞瘦素基因表達(dá)Fig 4 The expression of leptin at different incubation time of hypoxia in adipocytes

3 討論

近年來(lái)，隨著肥胖及其相關(guān)代謝性疾病發(fā)病率的增高，肥胖與IR關(guān)系及機(jī)制的研究已成為內(nèi)分泌與代謝病領(lǐng)域的焦點(diǎn)問題。在眾多的研究成果中，肥胖導(dǎo)致脂肪組織缺氧，造成脂肪組織的慢性炎癥狀態(tài)，進(jìn)而參與IR的發(fā)生發(fā)展這一理論得到越來(lái)越多的重視?！爸窘M織缺氧”假說(shuō)是Trayhurn等[2]在2004年提出的，他們認(rèn)為缺氧是肥胖者脂肪因子調(diào)節(jié)紊亂的重要始動(dòng)因素，并誘導(dǎo)了脂肪組織發(fā)生炎癥反應(yīng)。國(guó)外實(shí)驗(yàn)室均證明在遺傳性和營(yíng)養(yǎng)誘導(dǎo)的肥胖小鼠的內(nèi)臟脂肪組織中確實(shí)存在缺氧，并且與炎癥因子的升高和脂聯(lián)素的下降密切相關(guān)，為支持脂肪組織缺氧假說(shuō)提供了有力證據(jù)[3]。人體解剖學(xué)證實(shí)白色脂肪組織血供不豐富，相關(guān)研究證明，肥胖者白色脂肪組織中血供并未增加，新生血管不足可導(dǎo)致局部脂肪組織血供不足，造成局部缺氧[4]。另一方面，肥胖患者脂肪細(xì)胞直徑增大可達(dá)到約150～200μm[5]，氧氣在組織內(nèi)的彌散距離為120 μm[6]，增大的脂肪細(xì)胞會(huì)形成屏障阻礙氧氣在組織內(nèi)彌散，加重了脂肪組織內(nèi)的缺氧。缺氧誘導(dǎo)脂肪的炎癥因子表達(dá)水平的升高[7]，可使內(nèi)皮功能紊亂而進(jìn)一步使血供減少。內(nèi)皮功能紊亂可能阻礙了胰島素?cái)U(kuò)血管和招募毛細(xì)血管的效應(yīng)，導(dǎo)致脂肪組織血流減少，加重脂肪細(xì)胞的缺氧，介導(dǎo)肥胖者分泌脂肪因子紊亂。3T3-L1前脂肪細(xì)胞分離自小鼠胚胎(17～19 d)的Swiss3T3細(xì)胞[8]，加入誘導(dǎo)劑特異性地誘導(dǎo)分化后，顯微鏡下可見細(xì)胞間質(zhì)豐富，許多三酰甘油脂滴積聚于細(xì)胞核周圍，呈現(xiàn)典型的成熟脂肪細(xì)胞形態(tài)。3T3-L1前脂肪細(xì)胞在形態(tài)學(xué)變化、細(xì)胞生長(zhǎng)、脂質(zhì)積聚及脂肪代謝相關(guān)酶的表達(dá)都能充分展示人體脂肪細(xì)胞的特點(diǎn)，是國(guó)際上公認(rèn)的研究脂肪代謝的細(xì)胞模型。本實(shí)驗(yàn)對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞進(jìn)行不同時(shí)間持續(xù)缺氧處理，模擬肥胖狀態(tài)下脂肪組織的缺氧環(huán)境，以此來(lái)重點(diǎn)研究在肥胖中，缺氧因素對(duì)脂肪細(xì)胞表達(dá)脂聯(lián)素和瘦素的影響。

在缺氧狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)相關(guān)低氧反應(yīng)基因表達(dá)增強(qiáng)，以利于機(jī)體對(duì)于低氧產(chǎn)生適應(yīng)能力。HIF-1是由α和β亞基組成的異二聚體，α亞基、β亞基分別屬于功能單位和結(jié)構(gòu)單位。HIF-1α是最重要的氧信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，對(duì)其他因子具有調(diào)控作用，但其表達(dá)相對(duì)不穩(wěn)定，受到O2調(diào)節(jié)。研究證明，當(dāng)氧供充分時(shí)，HIF-1α發(fā)生脯氨酰羥基化和泛素化，經(jīng)過蛋白酶體途徑迅速降解。而缺氧能增加HIF-1α的穩(wěn)定性，促使HIF-1α轉(zhuǎn)位到核內(nèi)，促進(jìn)低氧目標(biāo)基因的表達(dá)[1]。受HIF-1調(diào)控的低氧反應(yīng)基因有70多種，涉及物質(zhì)代謝、細(xì)胞增生、凋亡及血管形成等方面，GLUT-1、VEGF等低氧敏感因子，在轉(zhuǎn)錄水平受HIF-1調(diào)節(jié)，成為較特異的低氧反應(yīng)標(biāo)志[9]。本研究以缺氧下HIF-1α、GLUT-1mRNA表達(dá)水平增加為依據(jù)，成功構(gòu)建持續(xù)缺氧模型。

脂聯(lián)素由ap M1基因編碼，244個(gè)氨基酸殘基組成，在循環(huán)中，以低分子量的6聚體和高分子量的12～18聚體形式存在，是非常重要的脂肪因子，在多種生理過程中起著重要作用，包括改善胰島素敏感性，血管內(nèi)皮功能保護(hù)，抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生等[3]。血漿脂聯(lián)素通過兩個(gè)不同的受體，即脂聯(lián)素受體1（adiponectin receptor，AdipoR1）和AdipoR2實(shí)現(xiàn)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，它們的廣泛表達(dá)可以誘導(dǎo)AMPK的磷酸化和激活，從而引起下游一系列分子的改變，刺激葡萄糖的利用和脂肪酸的氧化。AdipoR2基因表達(dá)增加了參與肝攝取葡萄糖所有基因的表達(dá)。此外，脂聯(lián)素和TNF-α都可由脂肪細(xì)胞分泌，并且結(jié)構(gòu)相似，因而可能存在相互拮抗作用，可通過抑制TNF-α在胰島素信號(hào)中的作用來(lái)改善IR[10]。循環(huán)中脂聯(lián)素水平較高，但肥胖患者血漿脂聯(lián)素水平卻比正常人下降，這與脂肪組織分泌的其它激素是截然相反的，提示內(nèi)臟脂肪的堆積產(chǎn)生了某些脂聯(lián)素生成的抑制因子，進(jìn)一步導(dǎo)致胰島素敏感性下降、血壓升高、動(dòng)脈粥樣硬化等[11]。在本實(shí)驗(yàn)中，我們建立不同時(shí)間持續(xù)缺氧脂肪細(xì)胞模型，研究脂肪缺氧對(duì)脂肪細(xì)胞表達(dá)脂聯(lián)素的影響。結(jié)果顯示缺氧處理的脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素表達(dá)下降，在4～48 h缺氧組中，隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)，脂聯(lián)素的降低更為明顯。缺氧72 h脂肪細(xì)胞表達(dá)脂聯(lián)素未能繼續(xù)下降，可能與細(xì)胞狀態(tài)有關(guān)，細(xì)胞對(duì)缺氧反應(yīng)敏感性較缺氧24 h及48 h差。通過以上數(shù)據(jù)可以得出：肥胖狀態(tài)下，脂肪組織缺氧是一個(gè)非常重要的脂聯(lián)素生成的抑制因子。在細(xì)胞狀態(tài)良好的前提下，缺氧時(shí)間越長(zhǎng)，脂肪組織脂聯(lián)素生成降低越明顯。

瘦素是主要由白色脂肪組織分泌產(chǎn)生的、由ob基因編碼(位于人類基因7q32)的、166或167個(gè)氨基酸組成的分泌型蛋白質(zhì)類激素，分子量約14～16kD[12]。瘦素進(jìn)入血液循環(huán)后，通過多種組織上、多種形式的瘦素受體作用于中樞及外周多種位點(diǎn)，從而發(fā)揮調(diào)節(jié)機(jī)體能量代謝、維持正常生殖功能、促進(jìn)血管生成、提高免疫力等生理學(xué)作用。瘦素作用于其位于下丘腦的受體后，可以激活PI3K信號(hào)通路，從而增強(qiáng)脂肪酸的氧化，增加機(jī)體對(duì)葡萄糖的攝取利用；同時(shí)，瘦素可以發(fā)揮抑制食欲及刺激能量消耗的作用，因此，它是機(jī)體調(diào)控體質(zhì)量的主要的活性因子之一。另一方面，瘦素與其受體的結(jié)合還可以明顯抑制IL-1介導(dǎo)炎癥通路的表達(dá)，從而發(fā)揮強(qiáng)大的抗炎作用[13]。因此，瘦素從理論上講也被認(rèn)為是一種重要代謝相關(guān)性的保護(hù)因子。然而，研究表明，血清瘦素濃度與肥胖程度（如體質(zhì)量指數(shù)、體脂百分含量）呈顯著正相關(guān)，肥胖個(gè)體血清瘦素水平大約是正常體質(zhì)量者的2倍，是消瘦者的3倍或＞3倍，這可能是由于瘦素調(diào)節(jié)機(jī)體脂肪代謝的脫逸作用所致[14]。瘦素在脂肪組織和胰島素之間起負(fù)反饋的信號(hào)傳遞作用，由于肥胖患者的瘦素受體對(duì)瘦素不敏感，負(fù)反饋機(jī)制受到破壞，瘦素不能有效抑制胰島細(xì)胞的胰島素分泌，導(dǎo)致高胰島素血癥及IR。對(duì)于肥胖時(shí)脂肪細(xì)胞分泌瘦素升高的機(jī)制，缺氧機(jī)制發(fā)揮了重要作用，本實(shí)驗(yàn)顯示缺氧孵育脂肪細(xì)胞后瘦素mRNA表達(dá)水平較常氧條件下明顯升高，并且有一定的時(shí)間依賴性，在24 h時(shí)升高達(dá)到最大水平。

本研究團(tuán)隊(duì)主要研究肥胖-脂肪缺氧與IR之間的聯(lián)系，在以往的工作中對(duì)脂肪細(xì)胞缺氧與代謝紊亂方面的研究取得了一些成果[15-16]。本次實(shí)驗(yàn)主要模擬肥胖-脂肪缺氧時(shí)脂肪細(xì)胞持續(xù)缺氧狀態(tài)，設(shè)定不同缺氧時(shí)間，分析持續(xù)缺氧狀態(tài)對(duì)脂肪組織合成脂聯(lián)素及瘦素的影響。一方面通過HIF-1α和GLUT-1等低氧敏感因子的表達(dá)增高為依據(jù)，成功構(gòu)建了脂肪細(xì)胞缺氧模型。不同時(shí)間缺氧處理脂肪細(xì)胞后，脂肪細(xì)胞表達(dá)脂聯(lián)素下降，瘦素表達(dá)升高，提示在肥胖中脂肪組織缺氧是導(dǎo)致脂肪組織分泌脂肪因子紊亂的重要因素；另一方面，由于脂肪細(xì)胞體外培養(yǎng)的的特殊性，脂肪細(xì)胞的對(duì)外部刺激的反應(yīng)，還需要考慮到細(xì)胞本身狀態(tài)。綜合以上因素，本實(shí)驗(yàn)證明缺氧介導(dǎo)的脂肪細(xì)胞各種內(nèi)分泌功能變化，在24 h時(shí)最為明顯，這為下一步進(jìn)行肥胖-脂肪組織相關(guān)研究時(shí)脂肪細(xì)胞缺氧處理時(shí)間的選擇提供參考。預(yù)防和治療肥胖及與其密切相關(guān)的胰島素抵抗已經(jīng)成為全世界關(guān)注的難題。盡管對(duì)肥胖-胰島素抵抗的相關(guān)研究正在逐年增加，但是進(jìn)展依然緩慢。本研究團(tuán)隊(duì)主要致力于對(duì)肥胖-脂肪缺氧的機(jī)制研究，希望能夠?yàn)榉逝?胰島素抵抗等代謝問題的預(yù)防及治療提供理論依據(jù)。

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（2014-09-12收稿）

楊傳慧1，李 萍1，何 慶1，劉金泉2，牛文彥2

（1.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院內(nèi)分泌科，天津300052；2.天津醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)系，天津300070）

目的：探討不同時(shí)間持續(xù)缺氧孵育后脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素和瘦素表達(dá)的變化。方法：將分化成熟的3T3-L1脂肪細(xì)胞隨機(jī)分為6組，即常氧（21%O2）組和缺氧（1%O2）4、12、24、48、72 h組，實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）法測(cè)定各時(shí)間點(diǎn)脂肪細(xì)胞中缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子1（GLUT-1）、脂聯(lián)素和瘦素基因表達(dá)。結(jié)果：與常氧組相比，缺氧12、24、48 h組HIF-1α、GLUT-1mRNA表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。缺氧24 h時(shí)HIF-1α、GLUT-1mRNA達(dá)到最高。各缺氧組脂聯(lián)素mRNA在12、24、48、72 h缺氧組的表達(dá)下降，較常氧組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。各缺氧組瘦素mRNA的表達(dá)高于常氧組，并在24 h時(shí)達(dá)到最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：缺氧使脂肪細(xì)胞HIF-1α、GLUT-1、瘦素mRNA表達(dá)升高，脂聯(lián)素mRNA表達(dá)下降，各反應(yīng)在缺氧24 h時(shí)達(dá)到最大水平。

脂肪細(xì)胞；缺氧誘導(dǎo)因子1α；葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子1；缺氧；脂聯(lián)素；瘦素；肥胖；胰島素抵抗

Effectof incubation timeof hypoxia on theexpression of adipokines in the3T3-L1 adipocytes

YANGChuan-hui1,LIPing1,HEQing1,LIU Jin-quan2,NIUWen-yan2

(1.Department of Endocrinology,General Hospital,Tianjin Medical University,Tianjin 300052,China;2.Department of Immunology, Tianjin MedicalUniversity,Tianjin 300070,China)

Objective：To explore the effect of different incubation time of hypoxia on the expression of adipokines in the 3T3-L1 adipocytes.Methods:Thedifferentiated 3T3-L1 adipocyteswere randomly divided into6 groups,normoxia（21%O2）and hypoxia（1%O2）conditions for 4,12,24,48,72 h respectively.ThemRNA expressions of hypoxia inducible factor-1α (HIF-1α),glucose transporter 1 (GLUT-1),adiponectin and leptinwere detected by the qRT-PCR.Results:In 3T3-L1 adipocytes,themRNA expressionsofHIF-1αand GLUT-1 inhypoxia conditions for12 h,24h and 48 hwerehigher than normoxia-treated cells(P＜0.05);furthermore,theywerehighestin thegroup ofhypoxia-treated cells for24 h.Comparedwith thenormoxiagroup,theadiponectinmRNA expressionsof the hypoxia-treated 3T3-L1 adipocytesdecreased inallgroups(P＜0.05)except for the4h group(P＜0.05).Ttranscription levelof leptin in thehypoxia-treated cellsincreased(P＜0.05),and itreached thehighest level in the24 h hypoxiagroup.Conclusion:ThemRNA expressionsofHIF-1α,GLUT-1 and leptin of3T3-L1 adipocytes increase in the condition ofhypoxia incubation,while the levelofadiponectinmRNA decreases under hypoxia treatment.Allchangesabove reach thepeaks within the24hof hypoxia-treated 3T3-L1 adipocytes.

adipocytes;hypoxia inducible factor-1α;glucose transporter1;hypoxia;adiponectin;leptin;obesity;insulin resistance

R589.2

A

1006－8147（2015）01-0001-05

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81170740,81270144）；天津市科委科技支撐項(xiàng)目（09ZCZDSF04500）

楊傳慧(1988-)，女，碩士在讀，研究方向：內(nèi)分泌與代謝；

何慶，E-mail：hech69@hotmail.com。