宋秀三，李玉山，詹光杰

(1.恩施自治州中心醫(yī)院腫瘤科，湖北 恩施 445000； 2.湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院，湖北 恩施 445000)

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頭頂一顆珠對肝癌小鼠免疫功能影響的實驗研究

宋秀三1，李玉山2※，詹光杰2

(1.恩施自治州中心醫(yī)院腫瘤科，湖北 恩施 445000； 2.湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院，湖北 恩施 445000)

摘要：目的研究頭頂一顆珠(TTM)注射液對肝癌模型小鼠免疫功能的影響。方法建立H22小鼠肝癌模型，將造模成功的肝癌小鼠依據(jù)隨機數(shù)字表法分為模型組、氟尿嘧啶(5-FU)組、5-FU+TTM組和TTM組，每組10只。模型組、5-FU組每日按10 mg/kg腹腔注射生理鹽水及5-FU，5-FU+TTM組在注射5-FU的同時每日腹腔按7.2 g/kg注射TTM，TTM組按7.2 g/kg注射TTM。給藥5 d后測定各組胸腺、脾臟指數(shù)，檢測外周血中白細胞、淋巴細胞及CD3、CD4、CD8細胞的百分比，血清中白細胞介素2(IL-2)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)水平。結(jié)果5-FU組和TTM組的胸腺指數(shù)與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而5-FU+TTM組顯著高于模型組(P<0.05)。與模型組比較，5-FU 組外周血白細胞與淋巴細胞數(shù)量明顯減少(P<0.05)，TTM組顯著增加(P<0.05)；5-FU+TTM組白細胞數(shù)與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與5-FU組比較，TTM組白細胞與淋巴細胞數(shù)量顯著增加(P<0.05),5-FU+TTM組白細胞數(shù)量明顯增多(P<0.05)，但淋巴細胞數(shù)量變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。相對于模型組，TTM組、5-FU+TTM組及5-FU組CD3、CD4百分比顯著增加(P<0.05)，CD8百分比變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與較 5-FU+TTM組比較，TTM組、5-FU組CD3、CD4百分比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但CD8百分比顯著增加(P<0.05)。相對于模型組，TTM組、5-FU+TTM組及5-FU組IL-2、TNF-α水平顯著增加(P<0.05)；與TTM組比較，5-FU+TTM組、5-FU組IL-2水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但5-FU組TNF-α水平顯著增加(P<0.05)，5-FU+TTM組差異則無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論TTM可以促進T細胞的成熟與遷移，提高肝癌小鼠IL-2、TNF-α水平，增強機體免疫力，具有抗腫瘤功能。

關(guān)鍵詞：頭頂一顆珠；H22肝癌小鼠；免疫

頭頂一顆珠(Trillium tschonoskii Maxim，TTM)是土家族、苗族地區(qū)應(yīng)用較多的一種珍稀藥材，常被當?shù)厝朔顬椤吧袼帯?是百合科延齡草屬植物延齡草的干燥根莖與成熟的果實[1]。其含有甾體皂苷、黃酮苷及倍半萜苷等活性成分，研究表明，TTM具有抗炎鎮(zhèn)痛、改善心肺功能，提高免疫力、降壓、抗衰老等功效[2-4]。由于繁殖相對比較困難，野生資源稀少，TTM的研究與開發(fā)受到一定限制。為充分保護、開發(fā)利用這一寶貴資源，人們從不同方面對TTM進行研究。本研究對小鼠H22肝癌細胞移植瘤模型注射TTM，觀察TTM對肝癌小鼠免疫功能的影響，探討TTM抗腫瘤的作用機制。

1材料與方法

1.1實驗動物無特定病原體級昆明種雄性小鼠40只，5周齡，體質(zhì)量為16.2～23.7 g，平均(20.3±1.4) g，購自華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，常規(guī)飼養(yǎng)，生產(chǎn)許可證號： SCXK(鄂)2008-0005。

1.2實驗藥品與儀器小鼠H22細胞(上海博谷生物科技有限公司)，氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)(上海旭東海普藥業(yè)有限公司，批號：H31020593)，CD3、CD4、CD8熒光抗體(美國Beckman公司)，紅細胞裂解液及溶血素(美國Beckman公司)，白細胞介素2(interleukin 2，IL-2)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)檢測試劑盒(南京建成生物制品研究所)，其他化學(xué)試劑為國產(chǎn)分析純試劑(湖北恩施樂之塬科技公司)。精密電子天平(上海天平儀器廠)，全自動酶標儀(美國Thermo公司)，低溫冷凍離心機(美國Beckman公司)、流式細胞儀(美國Beckman公司)。

1.3TTM注射液TTM由湖北省恩施市板橋鄉(xiāng)中藥材生產(chǎn)基地提供，采用水提醇沉法制成含生藥30%(相當于生藥含量2 g/mL)的液體,用時以0.9%氯化鈉注射液稀釋成 0.4 g/mL，瓶裝密封消毒貯存于4 ℃?zhèn)溆肹4]。

1.4動物造模、分組及給藥瘤源動物為H22傳代7 d的腹水小鼠，選擇狀態(tài)好、腹水多的小鼠抽取3 mL腹水，顯微鏡下血細胞計數(shù)細胞數(shù)約為2.0×108/mL。取1 mL腹水用滅菌0.9%氯化鈉注射液配成細胞懸液，鏡下細胞計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為2.0×107/mL作為接種用瘤液。精確稱量40只無特定病原體級雄性昆明種小鼠，75%乙醇對左腋下消毒，皮下注射接種用瘤液0.2 mL[5-6]，制成肝癌模型小鼠。將造模后小鼠依據(jù)隨機數(shù)字表法分為模型組、TTM組、5-FU+TTM組及5-FU組，每組10只。模型組、5-FU組每日按10 mg/kg腹腔注射0.9%氯化鈉注射液及5-FU，5-FU+TTM組在注射5-FU的同時每日腹腔按7.2 g/kg注射TTM，TTM組按7.2 g/kg注射TTM。各組自由飲食，連續(xù)飼養(yǎng)5 d[6]。

1.5胸腺、脾臟指數(shù)測定給藥5 d后再精確稱量各組小鼠，75%乙醇消毒，眼球取血后斷頸處死，小心取出胸腺、脾臟，放入冰凍0.9%氯化鈉注射液沖洗拭干，迅速用精密分析天平稱取重量，測定胸腺、脾臟指數(shù)[胸腺、脾臟重量(mg)/體質(zhì)量(g)×10]。

1.6外周血淋巴細胞檢測在falcon進樣管中加入20 μL熒光抗體，然后加入100 μL抗凝血，低速離心室溫靜置15 min，再加入稀釋的溶血素450 μL，稍稍低速離心后靜置10 min后利用流式細胞儀對淋巴細胞進行分析[6]。

1.7血清IL-2、TNF-α檢測小心收集小鼠血液于無內(nèi)毒素、熱原的促凝管中，4 ℃，10 000 r/min離心15 min，于 -70 ℃ 保存?zhèn)溆?。血清中IL-2、TNF-α水平檢測參考試劑盒說明書采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測定法。

2結(jié)果

2.1TTM對肝癌小鼠胸腺、脾臟指數(shù)的影響5-FU組和TTM組的胸腺指數(shù)與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而5-FU+TTM組顯著高于模型組(P<0.05)，5-FU組胸腺指數(shù)與TTM組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但5-FU+TTM組則顯著增加(P<0.05)，見圖1；各組脾臟指數(shù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

圖1頭頂一顆珠(TTM)對肝癌小鼠胸腺指數(shù)的影響5-FU：5-氟尿嘧啶;a與模型組比較，P<0.05；b與TTM組比較，P<0.05

2.2TTM對肝癌小鼠外周血白細胞、淋巴細胞的影響與模型組比較，5-FU組的白細胞與淋巴細胞數(shù)量明顯減少(P<0.05)，TTM組兩種細胞數(shù)量顯著增加(P<0.05)；5-FU+TTM組白細胞數(shù)與模型組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而淋巴細胞數(shù)量明顯減少(P<0.05)；與5-FU組比較，TTM組白細胞與淋巴細胞數(shù)量顯著增加(P<0.05),5-FU+TTM 組白細胞數(shù)量明顯增多(P<0.05)，但淋巴細胞數(shù)量變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

圖2頭頂一顆珠(TTM)對肝癌小鼠外周血白細胞、淋巴細胞的影響5-FU：5-氟尿嘧啶;a與模型組比較，P<0.05；b與5-FU組比較，P<0.05

2.3TTM對肝癌小鼠外周血CD3、CD4及CD8的影響與模型組比較，TTM組、5-FU+TTM組及5-FU組CD3、CD4百分比均有顯著增加(P<0.05)，CD8百分比變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與5-FU+TTM組比較，TTM組、5-FU組CD3、CD4百分比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但CD8百分比顯著增加(P<0.05)。見圖3。

圖3頭頂一顆珠(TTM)對肝癌小鼠外周血CD3、CD4及CD8的影響5-FU：5-氟尿嘧啶;a與模型組比較，P<0.05；b與5-FU+TTM組比較，P<0.05

2.4TTM對肝癌小鼠血清中IL-2、TNF-α水平的影響與模型組相比，TTM組、5-FU+TTM組及5-FU組IL-2、TNF-α水平均顯著增加(P<0.05)；與TTM組比較，5-FU+TTM組、5-FU 組IL-2水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但5-FU組TNF-α水平顯著增加(P<0.05)，5-FU+TTM組雖有增加但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖4。

圖4　頭頂一顆珠(TTM)對肝癌小鼠血清中　IL-2、TNF-α水平的影響　　IL-2：白細胞介素2；TNF-α：腫瘤壞死因子α；5-FU：5-氟尿嘧啶； a與模型組比較，P<0.05； b與TTM組比較，P<0.05

3討論

在抗腫瘤的臨床實踐中，大多數(shù)抗腫瘤化學(xué)藥物由于缺少選擇作用，患者接受放療、化療時雖然殺死了腫瘤細胞，但正常機體也受到不同程度的損傷。在腫瘤患者治療中，中醫(yī)藥不僅可以減輕不良反應(yīng)，治療效果也有明顯提升，中醫(yī)藥對腫瘤及其術(shù)后、放化療中的綜合治療具有重要的臨床意義和良好的療效，加強中藥在抗腫瘤機制方面的研究，開發(fā)和利用新型抗腫瘤中藥具有重要意義[7-8]。

胸腺、脾臟是兩個重要的免疫器官，在抗腫瘤藥物的作用下會導(dǎo)致一定質(zhì)量的變化，因此該器官質(zhì)量的變化可以作為觀察藥物對免疫影響的指標[9]。在本研究中，觀察肝癌小鼠注射TTM后對胸腺、脾臟質(zhì)量的影響，結(jié)果表明其對脾臟質(zhì)量及指數(shù)無明顯影響，但5-FU與TTM混合使用后可以顯著提高胸腺質(zhì)量和指數(shù)，胸腺能促使T細胞的分化與發(fā)育，提示TTM可以促進T細胞的成熟與遷移。

目前認為細胞免疫是機體抗腫瘤的主要免疫機制，體液免疫協(xié)同，其中T細胞介導(dǎo)的特異性免疫應(yīng)答起至關(guān)重要的作用。張立春等[10]研究認為，參麥注射液配合化療治療腫瘤可以預(yù)防白細胞減少，以減輕化療的不良反應(yīng)，同時使淋巴細胞數(shù)量增加，增強機體的免疫功能。本研究結(jié)果表明，注射TTM的肝癌小鼠白細胞及CD3、CD4、CD8數(shù)量有明顯增加，提示TTM可有效促進T淋巴細胞水平，調(diào)節(jié)機體內(nèi)免疫功能，表明中藥TTM對化療患者免疫細胞有一定的保護作用。

IL-2能激活、調(diào)節(jié)免疫細胞，參與體液免疫，通過促進T細胞的增殖與分化而發(fā)揮免疫作用，TNF-α在機體內(nèi)正常情況

下水平較低，通過激活核因子κB或c-Jun氨基末端激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控肝細胞[11]，具有抑制腫瘤增殖的作用，是目前發(fā)現(xiàn)的抗腫瘤作用最強的細胞因子[5]。本研究結(jié)果表明，TTM能提高肝癌小鼠IL-2、TNF-α水平，提示TTM可增強機體免疫力，具有抗腫瘤功能。

本研究結(jié)果表明，TTM與5-FU聯(lián)用可有效提高機體免疫力，通過提高IL-2、TNF-α水平，改善脾臟微環(huán)境從而影響T細胞亞群來減輕5-FU對機體的不良影響，從而提高機體自身抗腫瘤能力，因此，TTM可作為輔助化療藥物，提高腫瘤治愈率。

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臨床研究

The Experimental Study on the Effect of Trillium tschonoskii Maxim on Immune Functions of Hepatoma-MiceSONGXiu-san1，LIYu-shan2，ZHANGGuang-jie2.(1.DepartmentofOncology,CenterHospitalofEnshiStateofHubeiProvine,Enshi445000,China；2.MedicalSchoolofHubeiMinzuUniversity,Enshi445000,China)

Abstract:ObjectiveTo study the effect of Trillium tschonoskii Maxim(TTM) injection on immune functions of mice modeled with hepatoma.MethodsH22 hepatoma-mice model was built,and the hepa-toma-mice with successful modeling were randomly divided into model group,5-FU group,5-FU+TTM group and TTM group,10 mice in each group.The model group mice and the 5-FU group mice were given physiological saline intraperitoneal injection with 10 mg/kg per day.The 5-FU+TTM group mice were given TTM intraperitoneal injection with 7.2 g/kg at the same time,and the TTM group mice were injected with 7.2 g/kg.The index of thymus and spleen,the proportion of leucocyte,lymphocyte and CD3,CD4,CD8cells in the periphearl blood,and the concentration of IL-2,TNF-α in serum after five days′ medicines were measured.ResultsThe thymus index of mice in 5-FU group and TTM group had no statistical significance and 5-FU+TTM group increased obviously compared with the model group(P<0.05);the amount of leucocyte and lymphocyte of peripheral blood in 5-FU group decreased obviously(P<0.05)and the TTM group increased obviously(P<0.05)compared with the model group;the amount of leucocyte in 5-FU+TTM group had no statistical significance compared with the model group;the amount of leucocyte and lymphocyte in TTM group increased obviously compared with 5-FU group(P<0.05); the amount of leucocyte increased obviously in 5-FU+TTM group,but the amount of lymphocyte had no statistical significance.The proportion of CD3,CD4in TTM group,5-FU+TTM group and 5-FU group increased significantly(P<0.05) and the proportion of CD8had no statistical significance compared with the model group(P>0.05).The proportion of CD3,CD4in TTM group,5-FU group had no statistical significance,but the proportion of CD8increased obviously compared with 5-FU+TTM group(P<0.05).The contents of IL-2,TNF-αin TTM group,5-FU+TTM group and 5-FU group increased obviously compared with the model group(P<0.05); compared with TTM group,the contents of IL-2 had no obvious difference and had no statistical significance (P>0.05) in 5-FU+TTM group and 5-FU group,but contents of TNF-α in 5-FU group increased obviously(P<0.05) and the contents in 5-FU+TTM group had no statistical significance(P>0.05).ConclusionTTM can advance the maturation and metastasis of T cells,improve the level of IL-2,TNF-α of mice with hepatoma,strengthen the organic immunity,thus has the effect of anti-tumor.

Key words：Trillium tschonoskii Maxim; H22 hepatoma-mice; Immunity

收稿日期：2014-10-20修回日期：2015-03-05編輯:伊姍

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.19.051

中圖分類號：R285.5 1.中英文摘要(限200左右漢字)、關(guān)鍵詞(3～5個)、題目、單位名稱及作者署名；1～3個。

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)19-3597-03