周秀梅　陳龍　邵一葉　陳英輝　施曉紅

(復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，*內(nèi)分泌科，上?！?01508)

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·論著·

microRNA-146a在LPS誘導(dǎo)的大鼠雪旺細(xì)胞損傷模型中的表達(dá)

周秀梅陳龍邵一葉陳英輝施曉紅*

(復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，*內(nèi)分泌科，上海201508)

摘要目的：探討microRNA-146a(miRNA-146a)在體外培養(yǎng)的大鼠雪旺細(xì)胞炎性反應(yīng)模型中的表達(dá)變化。方法： 采用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)建立大鼠雪旺細(xì)胞炎性反應(yīng)模型(LPS組)，加入LPS 6 h后給予環(huán)氧合酶-2(COX-2)抑制劑NS398處理，正常組僅在LPS組加入LPS時(shí)更換培養(yǎng)基。采用real-time PCR及CCK-8方法檢測(cè)miRNA-146a的表達(dá)水平及雪旺細(xì)胞的增殖能力。結(jié)果：與正常組相比，LPS組miRNA-146a的表達(dá)明顯升高(P<0.05)，而且miRNA-146a的表達(dá)隨LPS濃度升高而增加；經(jīng)1.0 μg/mL的 LPS處理6 h后給予NS398處理，miRNA-146a表達(dá)水平下降(P<0.05)。經(jīng)10 μg/mL的 LPS處理6 h后，雪旺細(xì)胞的增殖能力下降；而LPS處理6 h后加入NS398，雪旺細(xì)胞的增殖能力改善。結(jié)論：miRNA-146a參與了體外培養(yǎng)的大鼠雪旺細(xì)胞炎性反應(yīng)的調(diào)控，其表達(dá)水平在一定程度上可反應(yīng)炎性反應(yīng)的嚴(yán)重程度。

關(guān)鍵詞雪旺細(xì)胞；miRNA-146a；炎性反應(yīng)

糖尿病周圍神經(jīng)病變(diabetic peripheral neuropathy, DPN)是糖尿病患者常見(jiàn)的慢性并發(fā)癥。60%~90%的2型糖尿病患者合并周圍神經(jīng)病變，出現(xiàn)不同程度的感覺(jué)和(或)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙，嚴(yán)重時(shí)甚至可致殘，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1]。目前DPN的發(fā)生機(jī)制尚未明確，可能是機(jī)體內(nèi)多種病理生理因素綜合作用的結(jié)果[2]。近期研究[3-4]表明，DPN與炎性反應(yīng)密切相關(guān)。作為非編碼短鏈RNA，miRNA-146a參與了免疫反應(yīng)及炎性反應(yīng)的調(diào)節(jié)[5-6]，但其在DPN中的作用尚不明確。本研究在脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)誘導(dǎo)的大鼠雪旺細(xì)胞炎性反應(yīng)模型中，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time PCR)檢測(cè)了miRNA-146a的表達(dá)水平，并采用CCK-8技術(shù)檢測(cè)了雪旺細(xì)胞的增殖能力，以初步了解miRNA-146a在DPN炎性反應(yīng)中的作用。

1資料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)RSC96大鼠雪旺細(xì)胞(購(gòu)于中科院上海細(xì)胞庫(kù))的培養(yǎng)采用DMEM+10%FBS培養(yǎng)基。隔天換一次培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到95%時(shí)，用含0.25% 胰酶的消化液進(jìn)行消化傳代。將雪旺細(xì)胞按2×106個(gè)/孔接種于六孔板，培養(yǎng)24 h后，將細(xì)胞分為正常組、LPS組、NS398組。LPS組更換培養(yǎng)基后分別加入終濃度為0.1、1.0和10 μg/mL 的LPS處理細(xì)胞，同時(shí)予正常組更換等體積培養(yǎng)基；NS398組在加入1.0 μg/mL的LPS刺激6 h后加入COX-2抑制劑NS398至終濃度為 10 μmol/L(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞。

1.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time PCR)應(yīng)用trizol提取RNA，用紫外分光光度計(jì)測(cè)OD值，將λ1/λ3 為1.8~2.0、λ1/λ2 為1.8~2.0的樣本采用RR718試劑盒(日本Takara公司) 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄及PCR。miRNA-146a上游引物由日本Takara公司合成，序列為5’- CATGAGAACTGAATTCCATGGGTT -3’，下游通用引物及內(nèi)參RNU6B引物包含在RR718試劑盒中。采用real-time PCR(ABI7300)擴(kuò)增目的基因，測(cè)得相應(yīng)Ct值。用相對(duì)定量分析2-ΔΔCt法計(jì)算miRNA-146a的表達(dá)水平。

1.3細(xì)胞增殖能力測(cè)定將細(xì)胞懸液加入96孔板(每孔1×104個(gè)細(xì)胞)，置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，將細(xì)胞分為正常組、LPS組、NS398組，予正常組更換新培養(yǎng)基，另外兩組更換LPS濃度為10 μg/mL的培養(yǎng)基，培養(yǎng)6 h后予NS398組加入NS398 至終濃度10 μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔加入CCK-8試劑10 μL并繼續(xù)培養(yǎng)2 h后用酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。

2結(jié)果

2.1不同濃度LPS對(duì)大鼠雪旺細(xì)胞中miRNA-146a表達(dá)的影響采用real-time PCR 檢測(cè)不同濃度LPS組和正常組miRNA-146a的表達(dá)，結(jié)果表明，與正常組相比，LPS濃度為0.1、1.0、10 μg/mL 時(shí)，大鼠雪旺細(xì)胞中miRNA-146a的表達(dá)水平均升高(分別為1.67±0.21、2.43±0.28、3.56±0.33)，并隨LPS濃度的升高而增加。LPS組與正常組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

注：與正常組比較，*P<0.05

圖1miRNA-146a在不同濃度LPS組和正常組的表達(dá)

2.2NS398對(duì)雪旺細(xì)胞增殖能力及miRNA-146a表達(dá)的影響經(jīng)10 μg/mL的LPS 處理6 h后，雪旺細(xì)胞的增殖被抑制；而LPS處理6 h后加入COX-2抑制劑NS398，雪旺細(xì)胞的增殖能力改善(圖2A)，提示NS398可以有效抑制LPS誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)。采用real-time PCR方法分析miRNA-146a表達(dá)，發(fā)現(xiàn)1.0 μg/mL的 LPS刺激雪旺細(xì)胞24 h后，miRNA-146a表達(dá)水平(2.15±0.25)較正常組升高(P<0.05)；在LPS刺激6h后給予NS398(10 μg/mL)24 h后，miRNA-146a表達(dá)水平(0.89±0.09)明顯下降(P<0.05)，見(jiàn)圖2B。結(jié)果表明，NS398可以抑制miRNA-146a的表達(dá)。

注：*與正常組比較，P<0.05；#與LPS組比較，P<0.05

3討論

研究[7]認(rèn)為，miRNAs調(diào)節(jié)著人類約1/3的基因，因此參與了機(jī)體的諸多生理、病理過(guò)程。miRNA-146a是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)，大量研究[5-6,8-9]證實(shí)miRNA-146a參與免疫及炎性反應(yīng)。人類的miRNA-146a位于第5號(hào)染色體LOC285628基因上，成熟的miRNA-146a位于第二外顯子上[5]。研究[10]發(fā)現(xiàn)，miRNA-146a在健康人的20個(gè)組織器官中均有表達(dá)，尤其在淋巴細(xì)胞含量豐富的胸腺和脾臟中高度表達(dá)，免疫細(xì)胞的成熟及激活均可誘導(dǎo)其表達(dá)。miRNA-146a的表達(dá)受系統(tǒng)特異性轉(zhuǎn)錄因子PU.1和c-ETS以及核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor Kappa B，NF-κB)、活化因子蛋白1(activator protein 1，AP1)、鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snail等的調(diào)節(jié)[11]。研究[5]表明，多種微生物成分、促炎性細(xì)胞因子，如LPS、 腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、干擾素-α(interferonα，IFN-α)等均可誘導(dǎo)miRNA-146a的表達(dá)；miRNA-146a表達(dá)與轉(zhuǎn)錄因子NF-κB密切相關(guān)。NF-κB是重要的炎性反應(yīng)調(diào)節(jié)分子，調(diào)節(jié)TNF-α、白介素-1β(interleukin1β，IL-1β)、IL-6、 IL-8的合成以及COX-2的表達(dá)，促進(jìn)Th1 細(xì)胞釋放IL-2、IL-12和IFN-γ，繼而激活巨噬細(xì)胞[12]。

雪旺細(xì)胞為周圍神經(jīng)系統(tǒng)的膠質(zhì)細(xì)胞，除了參與髓鞘形成之外，還有營(yíng)養(yǎng)支持、促進(jìn)軸索再生等作用。雪旺細(xì)胞是一種類抗原提呈細(xì)胞，可被誘導(dǎo)產(chǎn)生主要組織相容性復(fù)合體II(major histocomatibility complex II，MHCII)及黏附分子。DPN主要的病理表現(xiàn)是髓鞘神經(jīng)纖維節(jié)段性或彌漫性皺縮及脫髓鞘。因此，本研究采用體外培養(yǎng)的大鼠雪旺細(xì)胞，觀察miRNA-146a在炎性反應(yīng)損傷的雪旺細(xì)胞中的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)隨著LPS濃度的升高，大鼠雪旺細(xì)胞中miRNA-146a的表達(dá)增加。有研究[13]報(bào)道，系統(tǒng)性紅斑狼瘡的嚴(yán)重程度與miRNA-146a表達(dá)呈正相關(guān)。膿毒血癥患者中亦有相似的報(bào)道[14]。這些結(jié)果提示，miRNA-146a表達(dá)水平或許可在一定程度上反應(yīng)體內(nèi)炎性反應(yīng)狀態(tài)。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)，COX-2抑制劑NS398能抑制LPS誘導(dǎo)的雪旺細(xì)胞增殖能力的下降，且能下調(diào)miRNA-146a的表達(dá)，而COX-2在炎性反應(yīng)中扮演重要角色，因此，我們推測(cè)NS398可能通過(guò)調(diào)節(jié)miRNA-146a的表達(dá)參與炎性反應(yīng)的調(diào)節(jié)，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

由于我們的研究結(jié)果是由體外培養(yǎng)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)獲得，故需要在動(dòng)物體內(nèi)及DPN患者中進(jìn)一步研究。明確miRNA-146a在雪旺細(xì)胞炎性反應(yīng)中的作用及其與包括COX-2在內(nèi)的炎性因子的關(guān)系，將有助于明確DPN的發(fā)病機(jī)制。

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Expression of MicroRNA-146a in LPS-Induced Injured Models of Rat Schwann Cells

ZHOUXiumeiCHENLongSHAOYiyeCHENYinghuiSHIXiaohong*DepartmentofNeurology,*DepartmentofEndocrinology,JinshanHospital,FudanUniversity,Shanghai201508,China

AbstractObjective：To investigate the expression of miRNA-146a in the inflammatory response model of rat Schwann cells (SCs) cultured in vitro. Methods:Lipopolysaccharide(LPS) was applied to induce inflammatory response model of rat SCs. The cyclooxygenase-2(COX-2) inhibitor (NS398) was added six hours after LPS had been used. In normal group, the same amount of culture medium was replaced while the LPS was applied in LPS group. The expression of miRNA-146a and the proliferative capacity of SCs were detected by real-time PCR and CCK-8 method. Results: Compared with that in the normal group, the expression levels of miRNA-146a in all LPS groups increased significantly(P<0.05), and the expression level of miRNA-146a was up-regulated in accordance with the increase of the concentration of LPS. If NS398 was added six hours after the application of 1.0 μg/mL LPS, The expression of miRNA-146a was down-regulated. Six hours after the application of 10 μg/mL LPS, the proliferative capacity of SCs declined. However, if NS398 was added six hours after the application of LPS, then the proliferative capacity of SCs improved. Conclusions: The miRNA-146a is involved in the regulation of inflammatory response in Schwann cells cultured in vitro, and its expression level may reflect the severity of inflammatory response to a certain extent.

Key WordsSchwann cells;MicroRNA-146a;Inflammatory response

通訊作者施曉紅，E-mail: shixh80301@163.com

基金項(xiàng)目：上海市金山區(qū)科委科技創(chuàng)新項(xiàng)目(編號(hào)：2014-3-05)

中圖分類號(hào)R587.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A