楊君 張洪 魏丹蕓

[摘要] 目的 確定虎黃燒傷凝膠劑的制備工藝并建立其質(zhì)量控制的方法。 方法 通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)以凝膠劑的成型性和穩(wěn)定性為考察指標(biāo)，篩選出最適宜的載藥基質(zhì)。采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定該制劑中虎杖苷和鹽酸小檗堿的含量。 結(jié)果 虎黃燒傷凝膠劑的最佳基質(zhì)材料為2.5%的羥丙甲基纖維素；虎杖苷質(zhì)量濃度與峰面積的線(xiàn)性回歸方程為Y=79 415X-444 889（r=0.9994），線(xiàn)性范圍為15.6～78.0 μg/mL；鹽酸小檗堿質(zhì)量濃度與峰面積的線(xiàn)性回歸方程為Y=65 576X-583 154（r=0.9996），線(xiàn)性范圍為34.75～173.75 μg/mL；平均加樣回收率分別為99.34%、99.64%（n=6）。 結(jié)論 本研究制劑制備工藝簡(jiǎn)單，性質(zhì)穩(wěn)定，含量測(cè)定方法準(zhǔn)確可靠，重現(xiàn)性好，促進(jìn)了該制劑在臨床上的應(yīng)用。

[關(guān)鍵詞] 虎黃燒傷凝膠劑；制備；質(zhì)量控制；高效液相色譜法

[中圖分類(lèi)號(hào)] R283.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2015）02（c）-0082-05

虎黃燒傷凝膠是一種用于治療皮膚熱損傷的中藥制劑，其依據(jù)中醫(yī)理論清熱解毒、活血化瘀、通絡(luò)、收斂、去腐生肌的組方原則，篩選出以虎杖和黃連等2味藥材為處方并結(jié)合現(xiàn)代藥劑學(xué)方法研制而成。一直以來(lái)，武漢大學(xué)人民醫(yī)院自制制劑——燒傷酊，是將虎杖和黃連飲片用適量的乙醇浸泡、壓濾，待澄清后封裝而成，該藥在臨床上用于燒燙傷的治療效果明顯，但酊劑易揮發(fā)，穩(wěn)定性差，易產(chǎn)生皮膚刺激，影響使用效果。而凝膠劑在這些方面卻具有明顯的優(yōu)勢(shì)，不僅具有良好的生物相容性，且易于涂布使用，局部給藥后易吸收、穩(wěn)定性較好[1]，凝膠涂抹層可防止外來(lái)刺激和預(yù)防細(xì)菌感染，為創(chuàng)面組織的修復(fù)和再生提供有利環(huán)境[2]。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)臨床需要對(duì)常用酊劑進(jìn)行劑型改良研究，確定了虎黃燒傷凝膠劑的制備工藝，并建立了以高效液相色譜（HPLC）法同時(shí)測(cè)定該制劑中虎杖苷和鹽酸小檗堿含量的質(zhì)量控制方法，該方法簡(jiǎn)便易行，結(jié)果準(zhǔn)確，可作為該制劑質(zhì)量控制的指標(biāo)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

分析電子天平；紫外分光光度儀（島津UV-1800）；高效液相色譜儀（島津LC-20AT）；SPD-20A紫外檢測(cè)器；Agilent Extend-C18柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠(chǎng)）；精密恒溫水浴鍋（江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠(chǎng)）；超聲波清洗器（SK5200H，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；高速冷凍離心機(jī)（H-1600RW，武漢世紀(jì)超杰實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）。

1.2 試藥

虎杖苷標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111575-200502）；鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110713-201212）；虎杖（湖北天濟(jì)中藥飲片有限公司，批號(hào)：20131201）；黃連（湖北天濟(jì)中藥飲片有限公司，批號(hào)：20131253）；乙醇（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；甲醇（色譜純，Tedia company）；乙腈（色譜純，Tedia company）；三乙醇胺（AR，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；甘油（AR，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；水為實(shí)驗(yàn)室自制純化水。

凝膠藥用輔料均為藥用級(jí)別，卡波姆940、卡波姆943、卡波姆974、殼聚糖、羥丙甲基纖維素（HPMC-K4M）、羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）均購(gòu)于北京化學(xué)試劑公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 虎杖-黃連提取液的制備

參考有關(guān)虎杖和黃連提取研究的文獻(xiàn)[3-7]設(shè)計(jì)L9（34）正交實(shí)驗(yàn)，以乙醇濃度、提取溫度、提取次數(shù)和料液比為可變因素，考察其不同水平對(duì)有效成分虎杖苷和鹽酸小檗堿的提取率（通過(guò)HPLC測(cè)得）影響。根據(jù)大量文獻(xiàn)資料及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采取以下方法制備虎杖-黃連提取液可使虎杖苷和鹽酸小檗堿有較高的提取率：分別取處方量虎杖粗粉15 g和黃連粗粉10 g，用65%乙醇在70℃水浴回流提取3次，每次1.5 h，料液比為1∶10（g/mL），趁熱過(guò)濾，合并提取液，60℃減壓濃縮至無(wú)醇味，用蒸餾水調(diào)至一定體積，濾過(guò)，備用。

2.2 虎黃凝膠制備工藝研究

2.2.1 基質(zhì)載藥實(shí)驗(yàn) 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)，選取卡波姆940、卡波姆934、卡波姆947、殼聚糖、HPMC-K4M和CMC-Na為基質(zhì)，分別于適量純化水中溶脹溶解，制備空白凝膠。將虎杖-黃連提取液預(yù)熱至50℃，緩慢加入空白凝膠，邊加邊攪拌，觀(guān)察藥物凝膠的成型性，結(jié)果見(jiàn)表1。

卡波姆對(duì)鹽類(lèi)敏感[8-9]，而藥物提取濃縮液中含有的鹽酸小檗堿為季銨鹽，為其凝膠渾濁原因之一。殼聚糖載藥能力差，容易產(chǎn)生水化現(xiàn)象。因此舍棄卡波姆和殼聚糖，根據(jù)表1結(jié)果對(duì)HPMC-K4M和CMC-Na作進(jìn)一步考察。

2.2.2 穩(wěn)定性考察 根據(jù)“2.2.1”項(xiàng)下結(jié)果，以HPMC-K4M和CMC-Na為載藥基質(zhì)制備藥物凝膠，在凝膠中加入潤(rùn)濕劑甘油10%，防腐劑山梨酸鉀0.2%，觀(guān)察凝膠劑在不同條件下的穩(wěn)定性，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同基質(zhì)形成凝膠劑的穩(wěn)定性考察

注：HPMC-K4M：羥丙甲基纖維素；CMC-Na：羧甲基纖維素鈉

根據(jù)表2結(jié)果，確定選用HPMC-K4M作為虎黃燒傷凝膠劑的載藥輔料。

2.2.3 虎黃燒傷凝膠劑中HPMC-K4M用量?jī)?yōu)選 以HPMC-K4M為載藥輔料制備不同HPMC-K4M含量的虎黃燒傷凝膠，根據(jù)凝膠的成型性、涂展性和穩(wěn)定性進(jìn)一步確定HPMC的最佳用量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 虎黃燒傷凝膠劑中HPMC-K4M用量?jī)?yōu)選

注：HPMC-K4M：羥丙甲基纖維素

由表3確定虎黃燒傷凝膠劑中HPMC-K4M的最佳用量為2.5%。

2.3 虎黃燒傷凝膠劑的制備

根據(jù)原有處方的藥物比例和上述凝膠劑成型工藝的研究結(jié)果，確定虎黃燒傷凝膠劑的制備方法如下：分別稱(chēng)取虎杖粗粉15 g、黃連粗粉10 g，按照“2.1”項(xiàng)下方法制備虎杖-黃連提取液（約300 mL），加山梨酸鉀1 g使溶解，得相Ⅰ；取HPMC-K4M 12.5 g，加甘油50 g混合均勻，加適量純化水溶脹溶解，靜置過(guò)夜，得相Ⅱ。將相Ⅰ預(yù)熱至50℃并緩慢加入相Ⅱ，攪拌均勻，最后補(bǔ)足蒸餾水至500 g，攪拌均勻至冷卻，得虎黃燒傷凝膠。

3 質(zhì)量控制

3.1 性狀

本制劑為質(zhì)地細(xì)膩，均勻的黃褐色半透明半固體凝膠。

3.2 檢查

取本品2 g，加20 mL純化水?dāng)嚢柚寥芙夂鬁y(cè)定pH，pH值應(yīng)為6～7。其他檢查均符合《中國(guó)藥典》2010年版二部凝膠劑項(xiàng)下有關(guān)的各項(xiàng)規(guī)定[10]。

3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

3.3.1 離心穩(wěn)定性 取3份10 g的樣品分別裝入規(guī)格為10 mL（外徑為15.5 mm）離心管中，以3000 r/min離心30 min，凝膠無(wú)分層現(xiàn)象。

3.3.2 耐熱耐寒試驗(yàn) 各取3份10 g裝入離心管中的樣品，分別放入50℃烘箱恒溫12 h及冰箱中-20℃冷凍12 h，凝膠無(wú)分層，且恢復(fù)至常溫后無(wú)分層，無(wú)顏色變化。

3.4 皮膚刺激性試驗(yàn)

取12只豚鼠，雌雄各半，體重均約為300 g，分為兩組，一組設(shè)為破損皮膚組，另一組設(shè)為完整皮膚組。均剃去豚鼠脊柱兩側(cè)鼠毛，兩側(cè)脫毛面積各為4 cm×4 cm。對(duì)破損皮膚組豚鼠脫毛處采用滅菌針尖劃傷處理，以見(jiàn)有血液滲出為度，兩側(cè)處理傷口損傷程度相當(dāng)。24 h后給兩組所有豚鼠脊柱右側(cè)涂抹自制虎黃燒傷凝膠劑，給左側(cè)涂抹不含藥物的空白基質(zhì)凝膠，豚鼠無(wú)尖叫、屈身、逃逸等現(xiàn)象，6 h后用棉簽蘸溫水溫和除去豚鼠皮膚上的凝膠層，觀(guān)察皮膚均無(wú)明顯紅斑和水腫，豚鼠活動(dòng)表現(xiàn)正常。

3.5 含量測(cè)定

3.5.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Extend-C18柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.05 mol/L的磷酸二氫鉀（磷酸調(diào)節(jié)pH至4.2），梯度洗脫程序：0 min（76%B）→6 min（76%B）→12 min（70%B）→15 min（40%B）→16 min（40%B）→25 min（76%B）；檢測(cè)波長(zhǎng)為324 nm；流速為1.00 mL/min；柱溫為30℃；進(jìn)樣量為20 μL。在此色譜條件下樣品各組分分離良好，虎杖苷及鹽酸小檗堿與相鄰未知色譜峰的分離度不低于1.6，理論塔板數(shù)以鹽酸小檗堿計(jì)不低于5000。對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照溶液的色譜圖見(jiàn)圖1。

時(shí)間（min）

A

時(shí)間（min）

B

時(shí)間（min）

C

A.對(duì)照品溶液；B.陰性對(duì)照溶液；C.供試品溶液；1.虎杖苷；2.鹽酸小檗堿

圖1 各溶液高效液相色譜圖

3.5.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取干燥至恒重的虎杖苷對(duì)照品3.12 mg，鹽酸小檗堿對(duì)照品6.95 mg，置于10 mL棕色容量瓶中。加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為312 μg/mL虎杖苷和695 μg/mL鹽酸小檗堿的混合對(duì)照品溶液。

3.5.3 供試品溶液的制備 精密稱(chēng)定按“2.3”項(xiàng)下方法配制而成的凝膠2.03 g，置于一個(gè)10 mL（外徑為15.5 mm）圓底連蓋離心管中，加入適量甲醇，超聲15 min后在高速離心機(jī)中以15 000 r/min離心10 min，取上清加入25 mL容量瓶中，重復(fù)此步驟3次，收集3次所得上清液，補(bǔ)足甲醇至刻度，搖勻，取適量用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得供試品溶液。

3.5.4 陰性對(duì)照溶液制備 按照處方組成，依次加入除虎杖-黃連混合提取液的其他材料制備空白基質(zhì)凝膠，并按照“3.5.3”項(xiàng)下制備供試品溶液的方法制備陰性對(duì)照品溶液。

3.5.5 線(xiàn)性關(guān)系考察 分別精密吸取對(duì)照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。分別取適量過(guò)0.45 μm濾膜，然后依次進(jìn)樣。以溶液濃度X（μg/mL）為橫坐標(biāo)，以峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。虎杖苷的回歸方程為：Y=79 415X-444 889，r=0.9994，線(xiàn)性范圍為15.6～78.0 μg/mL；鹽酸小檗堿的回歸方程為：Y=65 576X-583 154，r=0.9996，線(xiàn)性范圍為34.75～173.75 μg/mL。

3.5.6 精密度實(shí)驗(yàn) 取上述對(duì)照品溶液，分別在同日內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定峰面積，計(jì)算日內(nèi)精密度。結(jié)果虎杖苷和鹽酸小檗堿的RSD分別為1.61%和1.66%。在5日內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定峰面積，計(jì)算日間精密度，結(jié)果虎杖苷和鹽酸小檗堿的RSD分別為2.13%和2.37%，表明儀器精密度良好。

3.5.7 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn) 取同一份凝膠制劑，按供試品溶液的制備方法制得6份，在上述色譜條件下測(cè)定。結(jié)果虎杖苷的平均含量為52.73 μg/mL，RSD為0.76%（n=6）；鹽酸小檗堿的平均含量為97.64 μg/mL，RSD為1.09%（n=6），表明方法重現(xiàn)性良好。

3.5.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，分別于0、2、4、6、8 h進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果表明虎杖苷和鹽酸小檗堿在8 h內(nèi)基本穩(wěn)定，虎杖苷RSD為1.3%，鹽酸小檗堿RSD為0.47%，說(shuō)明樣品在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.5.9 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 從已知含量的同一批虎黃燒傷凝膠中精密稱(chēng)取6份約1 g的樣品，分別精密加入高、中、低不同濃度的對(duì)照品溶液，按“3.5.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并分別在“3.5.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

3.5.10 樣品含量測(cè)定 從3份相同制備方法不同批次制備的虎黃燒傷凝膠中取樣，按“3.5.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，參照“3.5.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定含量并折算成每克虎黃燒傷凝膠中虎杖苷和鹽酸小檗堿的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

4 討論

制備凝膠劑，首先得選擇合適的載藥基質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)在選擇凝膠基質(zhì)時(shí)，對(duì)常用高分子材料進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)CMC-Na和HPMC均比較適合作此載藥材料，但因最終藥用制劑需加入一定量的防腐劑山梨酸鉀，而加入山梨酸鉀后HPMC穩(wěn)定性更佳，所以選擇HPMC。由HPMC制備而成的凝膠細(xì)膩均勻，釋藥快，與皮膚黏附貼合效果好，能吸收患處的組織滲出液，且具有一定的成膜性[11]，保護(hù)創(chuàng)面組織，非常適合此凝膠制備。

虎杖苷和鹽酸小檗堿在熱水中的溶解度均大于其在冷水中的溶解度，但在過(guò)熱的環(huán)境下鹽酸小檗堿不穩(wěn)定[12]，因此在凝膠制備過(guò)程中將虎杖-黃連提取液加熱到50℃使藥物活性成分充分溶解分散再加入空白基質(zhì)，形成的藥物凝膠更加均勻。

虎黃燒傷凝膠中主要活性物質(zhì)為虎杖苷和鹽酸小檗堿，因此二者的含量是該制劑質(zhì)量控制及臨床療效的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)文獻(xiàn)[10，13]考察并結(jié)合對(duì)色譜條件的實(shí)際摸索，建立HPLC法同時(shí)測(cè)定虎杖苷和鹽酸小檗堿含量的方法，提高了該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。由于兩種物質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)不同，因此分別對(duì)虎杖苷和鹽酸小檗堿的標(biāo)準(zhǔn)品甲醇溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，選取幾個(gè)二者均有較大吸收的波長(zhǎng)，如296、307、345、324 nm，在上述色譜條件下對(duì)供試品進(jìn)行分析，結(jié)果顯示在324 nm處所得HPLC圖譜各峰分離效果好，雜質(zhì)干擾少，也較好地兼顧了峰形。

隨著近些年來(lái)中藥現(xiàn)代化的發(fā)展，中藥制劑在燒燙傷的治療中顯示出其不可替代的重要性[14]。本實(shí)驗(yàn)將傳統(tǒng)中藥結(jié)合應(yīng)用新型高分子材料制備成現(xiàn)代凝膠劑，并建立可行的質(zhì)量控制方法，為虎黃燒傷凝膠的制備及質(zhì)量控制提供了方法依據(jù)，為該制劑的臨床應(yīng)用提供了質(zhì)量保證。

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（收稿日期：2014-10-29 本文編輯：衛(wèi) 軻）