李汛 張奇煜 嚴(yán)俊 何雯婷 周文策 張磊 孟文勃 白仲添 朱克祥 朱曉亮

（蘭州大學(xué)第一醫(yī)院普外二科·甘肅省肝膽胰外科研究所，甘肅蘭州730000）

胰腺癌（Pancreatic cancer，PC）是一種高度惡性腫瘤，5年生存率不足5%［1］，是目前預(yù)后最差的腫瘤。胰腺癌的病因尚未完全明了，大量證據(jù)表明遺傳因素和環(huán)境因素的協(xié)同作用是胰腺癌發(fā)生的主要原因［2］。資料表明，某些腫瘤相關(guān)基因的多態(tài)性與胰腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，有助于早期發(fā)現(xiàn)胰腺癌［3］。聚腺苷酸二磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶－1（polymerase－1，PARP－1）具有保持染色體結(jié)構(gòu)的完整、參與DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的功能，在維持基因組穩(wěn)定和細(xì)胞死亡過程中發(fā)揮作用。PARP－1存在多個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，目前對(duì)于PARP－1的SNPs與腫瘤的易感性的研究，主要集中生殖系腫瘤、肺癌和胃癌方面，但有關(guān)PARP－1的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）與胰腺癌易感性的關(guān)系文獻(xiàn)報(bào)道較少。本文通過檢測胰腺癌患者PARP－1基因的多態(tài)性，并與良性對(duì)照組作比較，以探討PARP－1基因SNP多態(tài)性與胰腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)關(guān)系，尋求胰腺癌早期診斷的分子標(biāo)記。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 胰腺癌組選擇2008年1月～2011年3月于蘭州大學(xué)第一醫(yī)院普外科住院患者，行手術(shù)治療并經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)胰腺癌66例，其中男性44例，女性22例。年齡36～75歲，平均（57.9±11.2）歲；對(duì)照組：選擇同期良性胰腺疾病患者85例，男性45例，女性40例，年齡22～85歲，平均年齡（56.3± 13.4）歲。并獲得其同意，調(diào)查研究對(duì)象的流行病學(xué)資料，采集以下信息：①人口學(xué)特征，如年齡、性別等。②病史及藥物使用情況。③吸煙史和飲酒史。④癌癥家族史：研究對(duì)象至少有一個(gè)直系親屬（包括父母、兄弟或姐妹）是癌癥患者，被認(rèn)為是有家族史。納入和排除標(biāo)準(zhǔn)同前述?；颊咭话阗Y料，見表1。

表1 兩組患者的一般特征比較［n（×10－2）］Table 1 The general data of the patients

1.2 方法

1.2.1 試劑及標(biāo)本 血液DNA抽提試劑盒、iPLEX反應(yīng)試劑、384－well SpectroCHIP生物芯片、HOTSTART taq酶、SAP酶、純化瓊脂等。研究對(duì)象抽靜脈血5ml（EDTA抗凝），－70℃保存。提取全血基因組DNA，用于SNP位點(diǎn)檢測。

1.2.2 PARP－1 Val 762Ala（T2444C）多態(tài)性基因檢測SNP分型 采用美國Sequenom公司的Mass ARRAYTM Analyzer技術(shù)平臺(tái)進(jìn)行SNP檢測：①設(shè)計(jì)合成引物：通過PCR擴(kuò)增、PCR引物和單堿基延伸引物均由Assay Designer（Sequenom）軟件包設(shè)計(jì)。引物合成由深圳華大生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。所有DNA樣本稀釋到5 mg／L后，取1μl，將其與0.95μl水、0.625μl PCR緩沖液（含2 mmol／L MgCl2）、1μl的2.5 mmol／L d NTP、0.4μl的25 mmol／L MgCl2、1μl PCR引物以及0.1μl HotStar Taq酶（Qiagen）混合在一起。PCR反應(yīng)條件：94℃，15min；94℃，20 s；56℃，30 s；72℃，1 min；共45個(gè)循環(huán)；最終72℃3 min。②SAP酶處理，降解擴(kuò)增用的d NTP：PCR擴(kuò)增后，剩余的d NTP將被去磷酸消化掉，反應(yīng)體系包括1.53μl水、0.17μl SAP緩沖液、0.3μl堿性磷酸酶，該反應(yīng)在37℃進(jìn)行40 min，然后85℃，5 min使酶失活。③延伸引物單堿基延伸反應(yīng)程序：堿性磷酸酶處理后，針對(duì)SNP的單堿基延伸引物在下列反應(yīng)體系中進(jìn)行：0.619μl水、0.2μl 10×iPLEX緩沖液、0.2μl終止混合物、0.041μl iPLEX酶，0.94μl的10μmol／L延伸引物.單堿基延伸反應(yīng)在下列條件下進(jìn)行：94℃，30 s；94℃，5 s；52℃，5 s；80℃，5 s；5個(gè)循環(huán)，共40個(gè)循環(huán)；最后72℃，3 min。④樹脂除鹽純化：在終止反應(yīng)物中加入6 mg陽離子交換樹脂脫鹽，混合后加入25μl離子水懸浮，離心5min（3000rpm）。⑤質(zhì)譜檢測：使用Mass ARRAY Nanodispenser將最終的分型產(chǎn)物點(diǎn)樣到一塊384孔的spectroCHIP（Sequenom）上，并用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀進(jìn)行分析，最終結(jié)果由Mass ARRAYRT軟件系統(tǒng)（版本號(hào)4.0）實(shí)時(shí)讀取，并由Mass ARRAY Typer軟件系統(tǒng)（版本號(hào)4.0）完成基因分型分析。5%的樣本隨即接受重復(fù)檢測，以驗(yàn)證檢測的重復(fù)性及穩(wěn)定性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件為SPSS 13.0，分類變量和基因分型在兩組中的分布差異用χ2檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為5%。以非條件logistic回歸計(jì)算比值比（odds ratio，OR）及其95%可信區(qū)間（confidence interval，CI）評(píng)價(jià)各基因型及單體型與胰腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。所有統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)檢測的PARP－1 Val762Ala（T2444C）有TT、CT、CC 3種基因型。以野生型TT為對(duì)照，TC基因型與胰腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增高相關(guān)（OR 2.476，95% CI：1.159～5.292，P＝0.018）；CC基因型與胰腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增高相關(guān)（OR 5.778，95%CI：2.278～ 14.657，P＜0.001）；P ARP－1 2444 C等位基因（CT＋CC）個(gè)體患胰腺癌的風(fēng)險(xiǎn)是野生型者的3.377倍（OR 3.377，95%CI：1.715～6.646（P＜0.001），見表2。

表2 PARP－1 Val762Ala（T2444C）基因型分布和胰腺癌危險(xiǎn)性的關(guān)系Table 2 Relation of genotype of PARP－1 Val762Ala（T2444C）and risk of pancreatic cancer

3 討論

目前普遍認(rèn)為，胰腺癌的發(fā)病同多數(shù)惡性腫瘤一樣，是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，環(huán)境致癌物及／其代謝產(chǎn)物攻擊機(jī)體細(xì)胞引起DNA損傷。當(dāng)DNA損傷不能及時(shí)有效地修復(fù)，積累到一定程度導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定性升高，引起細(xì)胞增殖和分化失控，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。研究表明DNA修復(fù)能力的差異是決定腫瘤易感性的重要因素。DNA修復(fù)基因的變異可影響DNA修復(fù)能力，從而影響腫瘤在人群中的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)［4，5］。

PARP家族共有7個(gè)成員，PARP－1是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)和研究得最清楚的一個(gè)成員。在PARP－1的17號(hào)外顯子第2444位核苷酸由T至C的轉(zhuǎn)換導(dǎo)致了第762位的氨基酸由Val突變?yōu)锳la。第762位氨基酸位于PARP－1的酶接觸反應(yīng)區(qū)，在多種物種中都是高度保守的。研究表明PAPR－1基因Val762Ala（T2444C）的多態(tài)性可增加食管癌、肺癌、胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)［7～9］。Lockett［10］研究顯示Val762Ala的Ala的Ala／Ala基因型能增加前列腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，降低酶的活性。通過數(shù)據(jù)分析，本組發(fā)現(xiàn) PARP－1 Val762Ala（T2444C）多態(tài)性與胰腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，PARP－1 2444 TC基因型個(gè)體患胰腺癌的風(fēng)險(xiǎn)是野生型TT攜帶者的2.476（OR 2.476，95%CI：1.159～5.292，P＝0.018）；CC純合突變型個(gè)體患胰腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)是野生型TT攜帶者的5.778倍（OR 5.778，95%CI：2.278～14.657，P＜0.001）；PARP－1 2444 C等位基因（CT＋CC）個(gè)體患胰腺癌的風(fēng)險(xiǎn)是野生型者的3.337倍（OR 3.337，95%CI：1.715～6.646，P＜0.001）（OR 0.382，95%CI：0.204～0.715，P＝0.002）。研究表明PARP－1Val762Ala的多態(tài)性可降低PARP－1活力的40%［11］，導(dǎo)致修復(fù)DNA損傷的能力降低，從而可能增加個(gè)體對(duì)胰腺癌發(fā)病的易感性。本研究有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量在不同地域人群中進(jìn)行深入研究和討論，最終確定PARP－Val762Ala（T2444C）能否作為胰腺癌的一個(gè)易感性標(biāo)志物。

4 結(jié)論

本文結(jié)果顯示PARP－1 Val762Ala（T2444C）單核苷酸多態(tài)性與膽管癌易感性相關(guān)，C等位基因型攜帶者患胰腺癌風(fēng)險(xiǎn)較高，PARP－1 Val762Ala（T2444C）單核苷酸多態(tài)性可作為預(yù)測胰腺癌的生物標(biāo)志物。

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