王丹丹，陳建中，亢春彥(鄭州大學第二附屬醫(yī)院，鄭州450014)

BMSCs來源的外泌體對小鼠乳腺癌細胞4T1增殖、侵襲的影響及機制探討

王丹丹，陳建中，亢春彥
(鄭州大學第二附屬醫(yī)院，鄭州450014)

摘要:目的觀察骨髓間充質干細胞(BMSCs)來源的外泌體(exosome)對小鼠乳腺癌細胞4T1增殖、侵襲的影響，并探討其可能機制。方法將小鼠乳腺癌細胞4T1隨機分為3組，4T1 + vehicle組僅加入400 μL無血清培養(yǎng)基，4T1 + exosome組加入400 μL由無血清培養(yǎng)基配置的exosome，4T1 + exosome +磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/Akt信號通路阻斷劑(Y294002)組加入400 μL終濃度為5 μmol/mL Y294002及400 μg/mL exosome的培養(yǎng)基。分別采用MTT法、細胞劃痕實驗、Western blotting法檢測各組細胞增殖、遷移和侵襲能力以及PI3K/Akt信號通路相關蛋白。結果4T1 + exosome組、4T1 + vehicle組、4T1 + exosome + Y294002組細胞增殖抑制率分別為0.713%± 0.050%、0.401%±0.030%、0.459%±0.800%，4T1 + exosome組分別與4T1 + vehicle組、4T1 + exosome + Y294002組比較，P均＜0.05。4T1 + exosome組、4T1 + vehicle組、4T1 + exosome + Y294002組細胞遷移距離分別為(388.0± 36.1)、(295.0±34.2)、(275.0±63.5)μm，4T1 + exosome組分別與4T1 + vehicle組、4T1 + exosome + Y294002組比較，P均＜0.05。4T1 + exosome組p-AKT、β-catenin OD值分別為0.30±0.11、0.30±0.08，4T1 + vehicle組分別為1.10±0.41、0.70±0.08，4T1 + exosome + Y294002組分別為0.40±0.13、0.30±0.07，4T1 + exosome組分別與4T1 + vehicle組、4T1 + exosome + Y294002組比較，P均＜0.05。結論BMSCs來源的exosome能夠增加小鼠乳腺癌細胞4T1的增殖、遷移及侵襲能力，其機制可能與上調PI3K/Akt信號通路有關。

關鍵詞:骨髓間充質干細胞;外泌體;乳腺腫瘤;乳腺癌; PI3K/Akt信號通路

Influence of BMSCs-derived exosome on proliferation and invasion ofmouse breast cancer cells 4T1 and themechanism

WANGdan-dan，CHEN Jian-zhong，KANG Chun-yan
(The Second Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450041，China)

Abstract:Objective To observe the influence of bonemarrowmesenchymal stem cells(BMSCs)-derived exosome on the proliferation and invasion ofmouse breast cancer cells 4T1 and to investigate themechanism.Methods Themouse breast cancer cells 4T1 were randomlydivided into three groups: 4T1 + vehicle group，4T1 + exosome group and 4T1 + exosome + Y294002(an inhibitor of PI3K/Akt signaling pathway)group.4T1 + vehicle group was added with 400 μL serum-freemedium，4T1 + exosome group was added with 400 μL serum-freemedium containing 400 μg/mL exosome and 4T1 + exosome + Y294002 group was added with 400 μL serum-freemedium containing 400 μg/mL exosome and 5 μg/mL Y294002.We used themTT，cell scratch test and Western blotting to examine the effect of BMSCs-derived exosome on the proliferation，migration and invasion abilities as well as the PI3K/Akt signaling pathway of 4T1 cells.Results The inhibition rates of cell proliferation of 4T1 + vehicle group，4T1 + exosome group and 4T1 + exosome + Y294002 group were 0.713%±0.05%，0.401%±0.03% and 0.459%±0.80%，respectively.Significantdifference was found between 4T1 + exosome group and 4T1 + vehicle group，4T1 + exosome + Y294002 group(all P＜0.05).The cellmigrationdistance of 4T1 + vehicle group，4T1 + exosome group and 4T1 + exosome + Y294002 group was(388.0±36.1)，(295.0± 34.2)and(275.0±63.5)μm，respectively.Significantdifference was found between 4T1 + exosome group and 4T1 + vehicle group，4T1 + exosome + Y294002 group(all P＜0.05).The OD values of p-AKT and β-catenin of 4T1 + exosome group were 0.3±0.11 and 0.3±0.08，they were 1.1±0.41 and 0.7±0.08 in 4T1 + vehicle group，0.4±0.13 and 0.3±0.07 in the 4T1 + exosome + Y294002 group.Significantdifference was found between 4T1 + exosome group

and 4T1 + vehicle group，4T1 + exosome + Y294002 group(all P＜0.05).ConclusionBMSCs-derived exosome can promote the proliferation，migration and invasion abilities ofmouse breast cancer cells 4T1，whichmay be related to the upregulation of PI3K/Akt signaling pathway.

Key words:bonemarrowmesenchymal stem cells; exosomes; breast neoplasms; breast carcinoma; PI3K/Akt signaling pathway

乳腺癌是女性常見惡性腫瘤，嚴重威脅女性健康。近年來，我國女性乳腺癌的發(fā)病率、病死率呈繼續(xù)增長態(tài)勢，控制、治療乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展刻不容緩，尋找治療乳腺癌的靶點至關重要［1］。磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/Akt信號通路在細胞生存、增殖和分化過程中起重要作用，其過度表達與乳腺癌患者較差預后及化療和(或)靶向治療耐藥有關［2］。另有研究［3］顯示，乳腺癌發(fā)生后，癌細胞能通過基質細胞衍生因子1(SDF-1)/趨化因子基質細胞衍生因子4(CXCR4)信號通路動員骨髓間充質干細胞(BMSCs)遷移至癌腫內部及周圍的微環(huán)境中;而BMSCs到達腫瘤微環(huán)境之后，能夠通過分泌外泌體(exosome)影響乳腺癌細胞的增殖、發(fā)展過程，但具體機制未知［4］。本研究觀察了BMSCs來源的exosome對小鼠乳腺癌細胞4T1增殖、侵襲的影響，并探討其可能機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物及試劑SPF級4周齡C57BL/6小鼠15只，體質量(15.0±0.3)g，均購自鄭州大學實驗動物中心，并飼養(yǎng)于鄭州大學第五附屬醫(yī)院中心實驗室動物房。小鼠乳腺癌細胞4T1由本實驗室凍存。所有實驗操作均經(jīng)過鄭州大學第二附屬醫(yī)院倫理委員會批準。細胞培養(yǎng)基(DMEM)、胎牛血清及培養(yǎng)板等購自Corning公司，抗小鼠p-Akt及β-catenin一抗購自美國Santa Cruz公司，抗GAPDH一抗購自杭州至賢公司，ECL試劑盒購自康為公司，PI3K/Akt信號通路阻滯劑(Y294002)及二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司。酶標儀(imarker)購于美國BD公司。本實驗按照要求分為3組: 4T1 + vehicle組、4T1 + exosome組及4T1 + exosome + Y294002組。

1.2小鼠乳腺癌細胞4T1的培養(yǎng)使用含10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基作為4T1細胞的培養(yǎng)液，于37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱內常規(guī)培養(yǎng)。

1.3 BMSCs分離使用梯度離心分離與差速貼壁培養(yǎng)相結合的方法進行BMSCs的分離培養(yǎng)。首先于無菌條件下取出小鼠雙髂骨、股骨和脛骨，使用PBS液沖洗后剪去骨兩末端，用吸有PBS的1mL針頭將骨髓細胞沖出至培養(yǎng)皿中，使用巴氏吸管將沖洗液反復吹打至單細胞懸液，于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱內靜止1 h，將未貼壁的細胞懸液緩慢加到等體積的Percoll分離液之上(密度1.073g/L)，3 000 r/min，30min，小心吸取中間白膜層至另一離心管，加入5倍L-DMEM培養(yǎng)基，于1 200 r/min離心5min;然后吸取云霧狀細胞層接種至培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng); 48 h后換液，之后3d換液1次;取3代BMSCs進行后續(xù)exosome的提取和純化。

1.4 BMSCs來源的exosome提取和純化取第3代間充質干細胞(MSCs)，培養(yǎng)48 h后收集上清，在800 g及2 000 g條件下分別離心5min，以去除懸浮細胞;取上清，以0.22 μm濾膜過濾，去除細胞碎片及大囊泡等;以100 000mw分子量濾膜過濾;取上清，在100 000 g、4℃離心1 h，棄去上清，使用PBS重懸;然后再在100 000 g、4℃條件下離心1 h，使用PBS再次重懸，0.22 μm濾膜過濾，待用。加入細胞培養(yǎng)液時將exosome調整為終濃度400 μg/mL。

1.5細胞增殖抑制率測算采用MTT法。使用培養(yǎng)基將4T1 + vehicle、4T1 + exosome、4T1 + exosome + Y294002組對數(shù)生長期小鼠乳腺癌細胞4T1稀釋，并按104/mL接種于96孔板，于37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁后進行干預; 4T1 + vehicle組僅加入400 μL無血清培養(yǎng)基，4T1 + exosome組加入400 μL由無血清培養(yǎng)基配置的exosome，4T1 + exosome + Y294002組加入400 μL終濃度為5 μmol/mL Y294002及400 μg/mL exosome的培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，每孔加入5mg/mL的MTT試劑20 μL，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)4 h，然后棄掉上清，每孔加入150 μLdMSO，震蕩30min，使用酶標儀于540 nm波長下測定各孔OD值，以公式［抑制率=(空白孔OD值－樣品孔OD 值)/空白孔OD值×100%］計算癌細胞增殖抑制率。

1.6細胞侵襲轉移能力檢測采用細胞劃痕實驗。取對數(shù)生長期的各組4T1細胞，以1×104/孔細胞量接種于24孔板，待細胞長到80融合%左右，使用10 μL無菌槍頭在每個孔中央劃一條橫線。4T1 +

vehicle組僅加入400 μL無血清培養(yǎng)基，4T1 + exosome組加入400 μL由無血清培養(yǎng)基配置的exosome，4T1 + exosome + Y294002組加入400 μL終濃度為5 μmol/mL Y294002及400 μg/mL exosome的培養(yǎng)基。將各組細胞在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h后，于倒置顯微鏡下采圖，觀察各組細胞從劃痕邊緣向中央遷移后剩下的距離，之后各組細胞用于后續(xù)免疫印跡分析。

1.7細胞p-AKT、β-catenin OD值測算采用Western blotting法。將1.6中各組細胞用預冷的PBS洗3次，加入適量的細胞裂解液和蛋白酶抑制劑混合物裂解細胞，于4℃條件下作用30min以上，然后在4℃、12 000 r/min高速離心20min，取上清，使用BCA法測定蛋白濃度，分裝后于－80℃保存。電泳時將樣本與上樣緩沖液混合煮沸，于12%SDS-PAGE電泳、分離，使用半干法將蛋白印記轉移至PVDF膜，使用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入一抗(抗p-Akt、β-catenin及抗GAPDH)，于4℃孵育過夜;洗膜后加入HRP標記的二抗于室溫下孵育1 h，通過ECL進行顯影。

1.8統(tǒng)計學方法采用SPSS13統(tǒng)計軟件。計量資料以珋x±s表示，組間比較采用單因素方差分析。P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1各組細胞增殖抑制率比較4T1 + exosome組、4T1 + vehicle組、4T1 + exosome + Y294002組細胞增殖抑制率分別為0.713%±0.050%、0.401% ±0.030%、0.459%±0.800%，4T1 + exosome組分別與4T1 + vehicle組、4T1 + exosome + Y294002組比較，P均＜0.05。

2.2各組細胞遷移距離比較4T1 + exosome組、4T1 + vehicle組、4T1 + exosome + Y294002組細胞遷移距離分別為(388.0±36.1)、(295.0±34.2)、(275.0±63.5)μm，4T1 + exosome組分別與4T1 + vehicle組、4T1 + exosome + Y294002組比較，P均＜0.05。

2.3各組細胞p-AKT、β-catenin OD值比較4T1 + exosome組p-AKT、β-catenin OD值分別為0.30± 0.11、0.30±0.08，4T1 + vehicle組分別為1.10± 0.41、0.70±0.08，4T1 + exosome + Y294002組分別為0.40±0.13、0.30±0.07，4T1 + exosome組分別與4T1 + vehicle組、4T1 + exosome + Y294002組比較，P均＜0.05。

3　討論

自20世紀80年代發(fā)現(xiàn)了PI3K家族后，國內外眾多研究已證實其在細胞生存、增殖和分化中起重要作用，作為受體酪氨酸激酶和G偶聯(lián)蛋白的下游組件，PI3K將各種生長因子和胞外信號通過產(chǎn)生磷脂轉化為胞內信號、活化Akt、β-catenin等下游通路，作用于腫瘤抑制基因、Bcl-2家族成員磷酸化相關死亡促進因子等蛋白，磷酸化而產(chǎn)生促增殖以及抗凋亡等效應［5］。人類腫瘤基因組學研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌、黑色素瘤、淋巴瘤以及肺癌等基因突變均以PI3K信號通路組件為靶點;臨床實驗證實，PI3K/ Akt信號通路的過度激活與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展存在正相關，是乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程的重要機制［6］。

乳腺癌發(fā)生后，癌細胞會分泌SDF-1。SDF-1作為一種化學趨化因子，通過與其配體CXCR4結合廣泛參與癌細胞趨化及腫瘤轉移、侵襲過程［7］。BMSCs表面高表達CXCR4，乳腺癌發(fā)生后能通過SDF-1/CXCR4信號通路促進骨髓中MSCs遷移至癌腫內及周圍，因此BMSCs一度被認為是乳腺癌靶向治療的理想載體之一;但是近期研究顯示，這些招募到癌腫內、周圍以及癌腫組織本身存在的MSCs，在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中起到了重要的促進作用。BMSCs能夠分泌IL-17b，可能通過乳腺癌細胞表面IL-17b受體刺激乳腺癌細胞增殖及其侵襲、轉移［8］。另外，乳腺癌細胞也普遍表達CXCR4［7］;位于骨髓中的BMSCs同樣會通過SDF-1/CXCR4信號通路誘導乳腺癌細胞遷移至骨髓，可能是乳腺癌免疫逃逸及骨轉移的機制之一［3］。關于BMSCs如何促進乳腺癌進展的具體機制研究尚不透徹，可能與其旁分泌及后續(xù)的免疫調節(jié)作用有關，但其分泌的exosome同樣可能調節(jié)乳腺癌細胞的增殖過程。

exosome直徑40～100 nm，包含脂類、蛋白及核酸類物質，可由BMSCs分泌，能夠特異靶定受體細胞，進而發(fā)揮交換脂類及蛋白、核酸類物質、引發(fā)下游信號事件及細胞間通訊等效應。研究［9］證實，MSCs包含的exosome能夠對乳腺癌細胞產(chǎn)生作用，并對其增殖、轉移及侵襲等作用產(chǎn)生影響，但具體機制尚需進一步探討。文獻［10～12］報道，BMSCs來源的exosome包含人類微小RNA(miRNA)總量的8.84%，這些miRNA可能參與RNA降解、mRNA合成途徑、RNA運輸?shù)然蜣D錄過程，提示BMSCs來源的exosome可能能夠通過基因水平參與乳腺癌細胞的發(fā)生發(fā)展過程。有研究［13］證實，脂肪來源的MSCs能夠通過釋放exosome顯著增加MCF7系乳腺癌細胞的侵襲性，其具體機制是否與exosome有關尚不明確。本研究顯示，4T1 + exosome組細胞增殖抑制率高于4T1 + vehicle組、4T1 + exosome +

Y294002組，細胞遷移距離長于4T1 + vehicle組、4T1 + exosome + Y294002組，證實BMSCs來源的exosome能夠通過PI3K/Akt信號通路對乳腺癌細胞的增殖、侵襲產(chǎn)生促進作用。

PI3K/Akt信號通路為調節(jié)細胞增殖、凋亡最重要的通路之一，其在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用已被深入闡述; BMSCs能夠促進乳腺癌的進展，具體機制涉及BMSCs旁分泌、免疫調節(jié)等效應，其分泌至胞外的exosome是否參與了其促乳腺癌進展過程及具體機制尚待進一步明確。本研究顯示，4T1 + exosome組p-AKT、β-catenin OD值高于4T1 + vehicle組、4T1 + exosome + Y294002組，證實BMSCs來源的exosome能夠通過上調PI3K/Akt信號通路促進乳腺癌細胞4T1的增殖、侵襲能力，進一步解釋了BMSCs參與乳腺癌發(fā)生發(fā)展的可能機制，為干預BMSCs在乳腺癌中的作用提供了潛在的治療靶點。但BMSCs來源的exosome是否在體內產(chǎn)生同樣的作用，是否有其他信號通路參與，仍需進一步深入研究。

參考文獻:

［1］石建偉，唐智柳，蔡美玉，等.2008～2012年我國女性乳腺癌流行狀況的系統(tǒng)性綜述［J］.中國婦幼保健，2014，29(10): 1622-1626.

［2］Sylvester PW，Ayoub NM.Tocotrienols target PI3K/Akt signaling in anti-breast cancer therapy［J］.Anticancer Agentsmed Chem，2013，13(7): 1039-1047.

［3］Karnoub AE，Dash AB，Vo AP，et al.Mesenchymal stem cells within tumour stroma promote breast cancermetastasis［J］.Nature，2007，449(7162): 557-563.

［4］Onom，Kosaka N，Tominaga N，et al.Exosomes from bonemarrowmesenchymal stem cells contain amicroRNA that promotesdormancy inmetastatic breast cancer cells［J］.Sci Signal，2014，7(332): 63.

［5］張洪英，陳軍寶，盧宏柱，等.PI3K/Akt信號通路在腫瘤血管形成中的作用研究進展［J］.山東醫(yī)藥，2012，52(47): 98-100.

［6］Grunt TW，Mariani GL.Novel approaches formolecular targeted therapy of breast cancer: interfering with PI3K/AKT/mTOR signaling［J］.Curr Cancerdrug Targets，2013，13(2): 188-204.

［7］Kang H，Watkins G，Parr C，et al.Stromal cellderived factor-1: its influence on invasiveness andmigration of breast cancer cells in vitro，and its association with prognosis and survival in human breast cancer［J］.Breast Cancer Res，2005，7(4): 402-410.

［8］Goldstein RH，ReaganmR，Anderson K，et al.Human bonemarrow-derivedmscs can home to orthotopic breast cancer tumors and promote bonemetastasis［J］.Cancer Res，2010，70(24): 10044-10050.

［9］馮影，盧士紅，王昕，等.人骨髓來源間充質干細胞分泌外泌體特性研究［J］.中國實驗血液學雜志，2014，22(3): 595-599.

［10］Xu JF，Yang G，Pan XH，et al.AlteredmicroRNA expression profile in exosomesduring osteogenicdifferentiation of human bonemarrow-derivedmesenchymal stem cells［J］.PLoS One，2014，9(12): e114627.

［11］Yu B，Zhang X，Li X.Exosomesderived frommesenchymal stem cells［J］.Int Jmol Sci，2014，15(3): 4142-4157.

［12］Wang J，Hendrix A，Hernot S，et al.Bonemarrow stromal cellderived exosomes as communicators indrug resistance inmultiplemyeloma cells［J］.Blood，2014，124(4): 555-566.

［13］徐琦璘，王椋，趙春華.人脂肪來源間充質干細胞誘導人乳腺癌MCF-7細胞上皮間質轉化［J］.基礎醫(yī)學與臨床，2012，32(6): 623-627.

收稿日期:( 2015-04-23)

作者簡介:第一王丹丹(1978-)，女，本科，主治醫(yī)師，主要研究方向為乳腺癌的診治。E-mail: jasminemorning@ sina.com

文章編號:1002-266X(2015)35-0012-04

文獻標志碼:A

中圖分類號:R739.7

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.35.004