彭　魯, 高玲娟, 鐘天鷹

(1. 南京醫(yī)科大學(xué)附屬腦科醫(yī)院, 江蘇 南京 210029;

2. 南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京市婦幼保健院, 江蘇 南京, 210004)

膜輔助蛋白在自然流產(chǎn)中的表達(dá)及其生物學(xué)意義

彭魯1, 高玲娟2, 鐘天鷹2

(1. 南京醫(yī)科大學(xué)附屬腦科醫(yī)院, 江蘇 南京 210029;

2. 南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京市婦幼保健院, 江蘇 南京, 210004)

摘要:目的探討膜輔助蛋白(MCP)在自然流產(chǎn)中的表達(dá)及其生物學(xué)意義。方法采用Real-time PCR和免疫印跡技術(shù)檢測(cè)MCP基因的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)滋養(yǎng)層細(xì)胞的凋亡率，Transwell小室法評(píng)估滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲能力。結(jié)果MCP在自然流產(chǎn)蛻膜組織中顯著低于人工流產(chǎn)的蛻膜組織；抑制MCP基因表達(dá)顯著增加滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡，且滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲能力顯著減弱。結(jié)論MCP在滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用，并可能由此導(dǎo)致自然流產(chǎn)的發(fā)生。

關(guān)鍵詞:膜輔助蛋白; 自然流產(chǎn); 滋養(yǎng)層細(xì)胞; 凋亡

自然流產(chǎn)是產(chǎn)科常見(jiàn)病理妊娠之一，其病因復(fù)雜。除解剖、內(nèi)分泌、感染、染色體、遺傳因素外，其中40%～80% 原因不明的自然流產(chǎn)可能與免疫因素有關(guān)[1]。已有研究[2]表明，自然流產(chǎn)的發(fā)生與蛻膜組織細(xì)胞凋亡異常以及補(bǔ)體系統(tǒng)的過(guò)度激活有關(guān)，但目前對(duì)于滋養(yǎng)層細(xì)胞表面凋亡調(diào)控蛋白在蛻膜組織中的表達(dá)和內(nèi)在調(diào)節(jié)機(jī)制缺乏系統(tǒng)并深入的研究。膜輔助蛋白(MCP)是重要的補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白之一，主要功能是抑制補(bǔ)體激活,從而保護(hù)宿主細(xì)胞免受補(bǔ)體系統(tǒng)的溶解破壞[3]。本實(shí)驗(yàn)旨在探討MCP在滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡以及誘發(fā)自然流產(chǎn)中的關(guān)系及其可能的機(jī)制。

1材料與方法

1.1　材料

滋養(yǎng)層細(xì)胞株HTR-8/SVneo由杭州赫貝生物有限公司提供，siRNA由武漢晶賽公司合成。收集2009年1月—2011年12月南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京婦幼保健院30例自然流產(chǎn)及人工流產(chǎn)蛻膜組織，取材后立即置于-80°C凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2　細(xì)胞培養(yǎng)

將細(xì)胞接種于完全營(yíng)養(yǎng)液中，每50 mL培養(yǎng)瓶中含5 mL完全營(yíng)養(yǎng)液(含15%胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 U/mL鏈霉素，非必需氨基酸10 ml/L及MEM，pH 7.2)，置于37 ℃, 5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，于3 d后換液，去非貼壁細(xì)胞此后每3 d換液1次，當(dāng)傳代的細(xì)胞布滿瓶底時(shí)，3～4 d可繼續(xù)傳代。

1.3　siRNA (small interference RNA，小干涉RNA)的設(shè)計(jì)

根據(jù)Invitrogen網(wǎng)站(http: //rnaidesigner. Invitrogen. com/sirna)提供的免費(fèi)軟件設(shè)計(jì)合成MCP siRNA特異性干擾片段和陰性對(duì)照片段。從目標(biāo)基因開(kāi)放閱讀框起始密碼子“ATG”下游75至100堿基位置開(kāi)始，尋找“AA”二連序列后的19個(gè)堿基序列作為潛在的siRNA靶位點(diǎn)。選擇GC含量在35%～55%的靶基因序列作為潛在優(yōu)選，在Genebank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast分析與其他基因的同源性。將選定的序列和相應(yīng)的人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較，以排除和其他編碼序列同源的序列，確定其為特異性序列。

1.4　實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time PCR)

PCR反應(yīng)體系為20 μL含1×TaqMan Universal PCR Master Mix (ABI)、0.1 μmol/L熒光標(biāo)記探針、引物各0.2 μmol/L。實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)在ABI Prime 7300定量PCR檢測(cè)儀上進(jìn)行，反應(yīng)參數(shù)為50 ℃/2 min，95 ℃/3 min, 95 ℃/15 s，60 ℃/1 min，40個(gè)循環(huán)，在60 ℃進(jìn)行單點(diǎn)熒光檢測(cè)。選擇熒光檢測(cè)模式FAM熒光，對(duì)于實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，以下公式進(jìn)行計(jì)算：2-ΔΔCT=2-(CT.gC1qR- CT.actin)Time x + (CT.gC1qR- CT.actin)Time 0.

1.5　免疫印跡

所有蛋白樣品調(diào)至等濃度后上樣，取下電泳玻璃夾板，將切好的硝酸纖維素膜置于甲醇5 min，然后置于轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡15 min；將膜從電轉(zhuǎn)槽中取出，室溫下?lián)u動(dòng)封閉60 min。將硝纖膜置于一抗稀釋液中，在搖床上37 ℃孵育2 h，將膜放進(jìn)5 mL相應(yīng)二抗稀釋液中(按相應(yīng)比例稀釋, 1∶5 000稀釋)，室溫輕搖1 h。加入顯色液，輕輕晃動(dòng)定影液定影；用自來(lái)水將經(jīng)過(guò)定影處理的X膠片洗凈，晾干。以Bio-Rad凝膠成像分析儀進(jìn)行灰度掃描，對(duì)于實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，以下公式進(jìn)行計(jì)算：目的蛋白/內(nèi)參蛋白。

1.6　細(xì)胞凋亡檢測(cè)

胰酶消化對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)節(jié)其濃度為(1～5)×106/mL, 500～1 000 r/min離心5 min, 棄去培養(yǎng)液。用預(yù)冷, 4 ℃無(wú)菌的PBS充分洗滌細(xì)胞2次，用250 μL結(jié)合緩沖液重新懸浮細(xì)胞。用100 μL的細(xì)胞懸液重懸細(xì)胞，于5 mL流式管中，加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL 20 μg/mL的PI溶液，混勻后室溫下避光孵育10～15 min。孵育后加入400 μL結(jié)合緩沖液，立即上流式細(xì)胞儀分析(實(shí)驗(yàn)必須在1 h內(nèi)完成)。流式細(xì)胞儀分析：流式細(xì)胞儀激發(fā)光波長(zhǎng)用488 nm，用一波長(zhǎng)為515 nm的帶通濾器(band pass filter)檢測(cè)FITC熒光，另一波長(zhǎng)大于560 nm的濾器檢測(cè)PI。

1.7　細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

采用 Corning公司8 μm孔徑的聚碳酯膜Transwell小室(24孔板 )，在 Transwell小室的下室中預(yù)先加600 μL含20% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基, 37 ℃平衡1 h，細(xì)胞用 PBS洗3次；消化后重懸于含10% FBS的RPM I 1 640培養(yǎng)基中，取細(xì)胞懸液100 μL加入至上室。37 ℃、 5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，取出Transwell小室，用棉棒擦凈未穿透微孔濾膜的細(xì)胞；PBS沖洗后用4%福爾馬林固定，行Giemsa染色，顯微鏡(×200)下隨機(jī)計(jì)數(shù)濾膜下表面5個(gè)視野的細(xì)胞數(shù)，以遷移細(xì)胞的數(shù)目來(lái)表示細(xì)胞的遷移能力。

1.8　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1　MCP在自然流產(chǎn)和人工流產(chǎn)蛻膜組織中的表達(dá)水平

采Real-time PCR和免疫印跡法檢測(cè)脫膜組織中MCP mRNA和蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，自然流產(chǎn)脫膜組織中MCP的mRNA和蛋白質(zhì)水平分別為(0.32±0.11)和(0.22±0.09)，較人工流產(chǎn)脫膜組織中的(0.91±0.07)和(0.62±0.12)顯著減少(P<0.05)。

2.2　沉默MCP基因?qū)ψ甜B(yǎng)層細(xì)胞凋亡及侵襲能力的影響

MCP siRNA載體和空質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染滋養(yǎng)層細(xì)胞48 h后，結(jié)果顯示， MCP siRNA組細(xì)胞凋亡細(xì)胞為(42.39±2.41)，較空載體組(10.53±1.11)顯著增多，而滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲能力為(11.1±1.2)，較空載體組(32.5±2.4)顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3討論

MCP又稱做補(bǔ)體抑制蛋白CD46，其染色體定位于人類(lèi)1號(hào)染色體短臂的32號(hào)區(qū)，其分子量大小約48～56 ku, 含有4個(gè)同源序列(scr)，是一種跨膜蛋白，廣泛分布于組織細(xì)胞表面。MCP作為一種重要的補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白，主要功能是作為輔助因子促進(jìn)I因子介導(dǎo)C3b，C4b的降解，抑制補(bǔ)體C3激活的聯(lián)級(jí)反應(yīng)，被認(rèn)為是抑制補(bǔ)體旁路激活的最有效的因子[4-5]。作為防止補(bǔ)體系統(tǒng)過(guò)度活躍的主要調(diào)節(jié)蛋白，補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白在防止細(xì)胞損傷過(guò)程中起著相當(dāng)大的作用。Girardi等[6]發(fā)現(xiàn)Crry基因敲除的小鼠胎兒可以導(dǎo)致小鼠死亡(小鼠Crry基因與人類(lèi)的MCP作用相似)，并認(rèn)為原因可能是補(bǔ)體沉積以及由此導(dǎo)致的胎盤(pán)感染。

妊娠的成功與否是由多重因素決定的。胎盤(pán)蛻膜作為母胎的界面，蛻膜細(xì)胞能分泌多種細(xì)胞因子，對(duì)胚胎著床、妊娠建立與維持，以及分娩發(fā)動(dòng)均起著極為重要的作用。任何破壞胎盤(pán)蛻膜細(xì)胞因子分泌平衡狀態(tài)的原因,都可能給妊娠造成不良影響,引起流產(chǎn)[7]。在本實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)自然流產(chǎn)婦女胎盤(pán)蛻膜組織中的MCP含量明顯減少，提示自然流產(chǎn)的發(fā)生可能與MCP蛋白表達(dá)降低有關(guān)，沉默MCP基因，滋養(yǎng)層系凋亡率顯著增加，且侵襲能力顯著減弱[8-10]。提示失去MCP保護(hù)的細(xì)胞更容易凋亡，自然流產(chǎn)的發(fā)生可能是由于大量胎盤(pán)胎膜組織細(xì)胞凋亡的結(jié)果[11-12]。

綜上所述，MCP有望成為評(píng)估自發(fā)性流產(chǎn)發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的一個(gè)重要指標(biāo)[13-14], 對(duì)其展開(kāi)進(jìn)一步深入研究，掌握其特點(diǎn)可能會(huì)為臨床醫(yī)生早期發(fā)現(xiàn)流產(chǎn)危險(xiǎn)，盡早采取措施保護(hù)母胎健康提供一種新的方法。

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Expression of membrane cofactor protein in

patients with spontaneous abortion and its

biological significance

PENG Lu1, GAO Lingjuan2, ZHONG Tianying2

(1.NanjingBrainHospitalAffiliatedtoNanjingMedicalUniversity,Nanjing,Jiangsu, 210002;

2.NanjingMaternalandChildHealthCareHospitalAffiliatedtoNanjingMedical

University,Nanjing,Jiangsu, 210004)

ABSTRACT:ObjectiveTo explore the expression of membrane cofactor protein (MCP) in patients with spontaneous abortion and its biological significance. MethodsThe expression of MCP mRNA and protein was detected by real-time PCR and Western blot, and meanwhile the effect of MCP on the placenta decidual tissue was measured by Transwell, and the apoptosis rate of trophoblast cell was evaluated by FCM. ResultsThe results showed that the expression of MCP on placenta decidual tissue reduced significantly in patients with spontaneous abortion, while the suppression of MCP might reduce the apoptosis rate and invasion ability of trophoblast cell. ConclusionThe expression of MCP plays an important role in apotosis of trophocyte, which might be the cause of the spontaneous abortion.

KEYWORDS:membrane cofactor protein; spontaneous abortion; trophocyte; apotosis

通信作者:高玲娟, E-mail: gaolingjuan@njmu.edu.cn

收稿日期:2015-03-09

中圖分類(lèi)號(hào):R 714.21

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1672-2353(2015)19-055-03

DOI:10.7619/jcmp.201519016