趙 虹 張?bào)@宇 車(chē)守梅 赫丹丹 郭朝暉

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬四院神經(jīng)內(nèi)科，黑龍江 哈爾濱 150001)

目前如何預(yù)防和治療神經(jīng)退行性疾病已成為亟待解決的問(wèn)題。神經(jīng)元缺失、軸突變性是多種神經(jīng)退行性疾病的一個(gè)重要特征。煙酰胺單核苷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶NMNAT是一類(lèi)功能尚不完全明確的酶類(lèi)，該類(lèi)蛋白質(zhì)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)中大量表達(dá)。NMNAT1催化NAD的合成〔1，2〕。NAD在所有活細(xì)胞的新陳代謝中起關(guān)鍵作用，尤其是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中作為輔酶參與大量轉(zhuǎn)移反應(yīng)〔3〕，NMNAT1在NAD合成途徑中是主要酶〔4〕，軸突變性被認(rèn)為是中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病的新的治療靶點(diǎn)，而且沃勒變性是軸突變性的自我損傷過(guò)程，往往發(fā)生在軸突損傷或神經(jīng)元變性時(shí)，例如帕金森病(PD)或阿爾茨海默病(AD)〔5～7〕，沃勒變性的軸突由 NMNAT1促使 NAD 的合成得到保護(hù)〔8〕，已有研究表明在果蠅中過(guò)表達(dá)NMNAT1基因卻能夠顯著抑制和延緩軸突的退化〔9〕。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物和藥物 原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元來(lái)源于ICR小鼠(SLAC.CHINA)的胚胎，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)保護(hù)協(xié)議由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。煙酰胺轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶抑制劑FK-866購(gòu)置于美國(guó)Cayman化學(xué)制品公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA構(gòu)建 編碼小鼠NMNAT1基因的cDNA從小鼠腦cDNA庫(kù)中經(jīng)PCR擴(kuò)增得到的，所用引物:5'-ATGGACTCATCCAAGAAGACAGA-3'和5-TCACAGAGTGGAGTGGAATGGTTGTGCTTG-3'，并克隆到 PIRES2-EGFP載體(Invitrogen公司)中產(chǎn)生野生型過(guò)表達(dá)NMNAT1(NMNAT1-OE)序列。

1.2.2 shRNA plasmids的生成 專(zhuān)門(mén)針對(duì)小鼠NMNAT1 mRNA三個(gè)非重疊序列設(shè)計(jì)后構(gòu)建到H1啟動(dòng)子RNAi載體上(psuper，Oligoengine，USA)。最有效的 19-核苷酸靶序列是 5'-ACGAGTGGATCACCAATGA-3'(KD-shRNA)。非特異性對(duì)照寡核苷酸設(shè)立為無(wú)關(guān)序列作為對(duì)照，該序列為:5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'(Scr-shRNA)，含干擾序列的寡核苷酸在DNA合成過(guò)程中，末端引入BgLⅡ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)。所有序列均被測(cè)序證實(shí)正確。

1.2.3 原代神經(jīng)元的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 原代新皮層神經(jīng)元來(lái)源于剛出生小鼠(PO小鼠)的胚胎，簡(jiǎn)而言之，分離新皮層組織，在4℃含6%葡萄糖的磷酸鹽緩沖鹽水中清洗2次，然后0.3%胰蛋白酶中37℃消化10 min，并且在補(bǔ)充了B27添加劑 (Invitrogen)0.5 mmol/L左旋谷氨酸和20 mmol/L HEPES的無(wú)血清培養(yǎng)基中輕輕磨碎分離，pH7.4在體外培養(yǎng)3～6 d后，神經(jīng)元用于形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究。培養(yǎng)的神經(jīng)元通過(guò)電穿孔的方法轉(zhuǎn)染。簡(jiǎn)單地說(shuō)，一個(gè)包含質(zhì)粒，電穿孔緩沖物和神經(jīng)元的混合物移到一個(gè)容器中，用轉(zhuǎn)染試劑盒通過(guò)電穿孔技術(shù)轉(zhuǎn)染。

1.2.4 免疫印記分析 神經(jīng)元溶解在細(xì)胞溶解緩沖液中，(10 mmol/L Tris-HCl、5 mmol/L EDTA、140 mmol/L NaCl、0.2%聚乙二醇辛基苯基醚)，包含蛋白酶抑制劑的混合物中1 h，離心10 min，以合適的SDS-PAGE膠進(jìn)行蛋白電泳，轉(zhuǎn)移到PVDF(Millipore)膜上，用封閉液稀釋一抗，將已封閉的膜置于一抗溶液中4℃過(guò)夜，然后放入用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗中孵化(1∶5 000;Jackson Immuno Research)，細(xì)胞膜用熒光檢測(cè)試劑(GE，USA)檢測(cè)，小鼠的單克隆抗體和小鼠的抗β-actin抗體分別來(lái)自于Santa cruz(sc-30842)和Chemicon(MAB1501)。

1.2.5 免疫細(xì)胞化學(xué) 細(xì)胞固定于含4%多聚甲醛和4%蔗糖的PBS緩沖液中，用5%BSA和0.2%Triton-100在PBS緩沖液中封閉和透化后，細(xì)胞在一抗中4℃孵化一夜，然后細(xì)胞用Alexa488和Alexa568共軛二抗在室溫下清洗孵化1 h。小鼠單克隆抗-Taul(MAB2239)和小鼠單克隆抗體Map2(AB5622)購(gòu)置于Chemicon。

1.2.6 成像和圖像分析 膠片在熒光顯微鏡下掃描(尼康，日本)，分析神經(jīng)突的延長(zhǎng)和分支，關(guān)鍵是能夠成像一個(gè)單一神經(jīng)元的全部過(guò)程，并能區(qū)別它們是軸突還是樹(shù)突，對(duì)成像軸突，需要使用相對(duì)低功率放大(20×)獲得圖像，包括神經(jīng)元的成像。被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用綠色熒光GFP和軸突特異性標(biāo)記Tau-免疫雙標(biāo)神經(jīng)元軸突。Neurolucida軟件用來(lái)分析軸突的生長(zhǎng)，并且計(jì)算軸突的長(zhǎng)度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用prism5.0軟件進(jìn)行單因素方差分析以及 post-hoct-test。

圖1 在原代培養(yǎng)神經(jīng)元中NMNAT1基因的RNA干擾與過(guò)表達(dá)

圖2 在培養(yǎng)神經(jīng)元中NMNAT1對(duì)軸突形態(tài)的影響

2 結(jié)果

2.1 小鼠NMNAT1 shRNA和過(guò)表達(dá)載體在培養(yǎng)的神經(jīng)元中有效構(gòu)建 為了研究NMNAT1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的功能，設(shè)計(jì)了一個(gè)短發(fā)卡RNA(shRNA)的針對(duì)小鼠NMNAT1 mRNA的shRNA結(jié)構(gòu)(NMNAT1KD-shRNA)，設(shè)計(jì)了無(wú)針對(duì)性對(duì)照的shRNA(NMNAT1Scr-shRNA)，把每個(gè)shRNA結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的神經(jīng)元，檢驗(yàn)敲除內(nèi)源性NMNAT1蛋白的能力，Western印跡分析顯示NMNAT1-OE高表達(dá)NMNAT1(6.31±0.24)而KD-shRNA有效敲除了 NMNAT1基因(0.21±0.13，圖1)，而 ScrshRNA沒(méi)有影響到NMNAT1表達(dá)(1.71±0.21)。這些結(jié)果證明小鼠NMNAT1過(guò)表達(dá)和干擾慢病毒載體構(gòu)建在原代培養(yǎng)小鼠神經(jīng)元中是有效的。

2.2 NMNAT1對(duì)培養(yǎng)鼠神經(jīng)元軸突形態(tài)的調(diào)節(jié) 如圖2所示，用NMNAT1-OE或KD-shRNA病毒載體轉(zhuǎn)染了DIV0神經(jīng)元，并用GFP和軸突特異標(biāo)志Tau1免疫雙標(biāo)DIV0神經(jīng)元。過(guò)表達(dá)和敲除NMNAT1在軸突的總長(zhǎng)度和分支上顯示出顯著的作用(圖2)，上調(diào)NMNAT1促進(jìn)軸突的生長(zhǎng)和分支，而下調(diào)NMNAT1則有相反的作用，沒(méi)有影響神經(jīng)元的極性。添加2 nmol/L FK-866在體外也阻滯了軸突的生長(zhǎng)，這和下調(diào)NMNAT1的數(shù)據(jù)一致，結(jié)果顯示在培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元中操縱NMNAT1的表達(dá)對(duì)軸突的生長(zhǎng)有重要作用。見(jiàn)表1。

表1 在培養(yǎng)神經(jīng)元中NMNAT1對(duì)軸突形態(tài)的影響(x±s)

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)與轉(zhuǎn)染了Scr-shRNA的神經(jīng)元比較，敲除了NMNAT1的shRNA引起了軸突分支的顯著減少以及總長(zhǎng)度的減少。而且過(guò)表達(dá)NMNAT1促進(jìn)了軸突的生長(zhǎng)，這與過(guò)去報(bào)道的培養(yǎng)的脊髓背根神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)元相一致〔7〕。軸突在神經(jīng)元聯(lián)絡(luò)時(shí)發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，改變軸突結(jié)構(gòu)可能會(huì)影響信息的傳播過(guò)程，如學(xué)習(xí)和記憶〔10，11〕。本研究結(jié)果表明 NMNAT1這個(gè)神經(jīng)退行性疾病的相關(guān)蛋白在大腦中高水平表達(dá)，在體外培養(yǎng)的大腦皮層神經(jīng)元中參與促進(jìn)軸突生長(zhǎng)和復(fù)雜度的形態(tài)變化，提示NMNAT1在神經(jīng)元形態(tài)發(fā)生和神經(jīng)退行性疾病中的一個(gè)重要作用。

一項(xiàng)在果蠅的研究表明NMNAT1是作為一個(gè)伴護(hù)蛋白而起作用〔11，12〕，關(guān)于華勒氏變性的幾項(xiàng)研究顯示 NMNAT1的NAD 合成活動(dòng)需要它對(duì)軸突的保護(hù)作用〔11，13～16〕，然而對(duì)于中樞神經(jīng)元，尤其是神經(jīng)元經(jīng)歷變性的過(guò)程時(shí)NMNAT1是否作為一個(gè)保護(hù)蛋白或酶而發(fā)揮功能知道的很少。因此，在不同的變性過(guò)程中，NMNAT1的不同功能特征將幫助理解它在神經(jīng)退行性疾病中的作用。本研究結(jié)論是第1次展示了NMNAT1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)軸突中所起的作用，已經(jīng)為研究人員開(kāi)發(fā)了一實(shí)驗(yàn)性的實(shí)驗(yàn)，在原代培養(yǎng)神經(jīng)元中通過(guò)檢測(cè)軸突形態(tài)去研究不同刺激下NMNAT1的保護(hù)作用。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)闡明了NMNAT1基因的表達(dá)水平與神經(jīng)退行性疾病造成神經(jīng)元缺失的潛在關(guān)系，將為進(jìn)一步尋找可能的神經(jīng)退行性疾病的潛在藥物靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 Magni G，Amici A，Emanuelli M，et al.Enzymology of NAD+homeostasis in man〔J〕．Cell Mol Life Sci，2004;61(1):19-34.

2 Magni G，Amici A，Emanuelli M，et al.Structure and function of nicotinamide mononucleotide adenylyltransferase〔J〕．Curr Med Chem，2004;11(7):873-5.

3 Berger F，Lau C，Dahlmann M，et al.Subcellular compartmentation and differential catalytic properties of the three human nicotinamide mononucleotide adenylyltransferase isoforms〔J〕．J Biol Chem，2005;280(43):36334-41．

4 Lau C，Niere M，Ziegler M．The NMN/NaMN adenylyltransferase(NMNAT)protein family〔J〕．Front Biosci，2009;14(4):410-31.

5 Zhai Q，Wang J，Kim A，et al.Involvement of the ubiquitin-proteasome system in the early stages of wallerian degeneration〔J〕．Neuron，2003;39(2):217-25.

6 Zhai RG，Rizzi M，Garavaglia S.Nicotinamide/nicotinic acid mononucleotide adenylyltransferase，new insights into an ancient enzyme〔J〕．Cell Mol Life Sci，2009;66(17):2805-18.

7 Zhai RG，Zhang F，Hiesinger PR，et al.NAD synthase NMNAT acts as a chaperone to protect against neurodegeneration〔J〕．Nature，2008;452(7189):887-91.

8 Sasaki Y，Vohra BPS，Lund FE，et al.Nicotinamide mononucleotide adenylyl transferase-mediated axonal protection requires enzymatic activity but not increased levels of neuronal nicotinamide adenine dinucleotide〔J〕．J Neurosci，2009;29(17):5525-35.

9 Zhang T，Berrocal JG，Yao J，et al．Regulation of poly(ADP-ribose)polymerase-1-dependent gene expression through promoter-directed recruitment of a nuclear NAD+synthase〔J〕．J Biol Chem，2012;287(15):12405-16.

10 Wang J，Zhai Q，Chen Y，et al.A local mechanism mediates NAD-dependent protection of axon degeneration〔J〕．J Cell Biol，2005;170(3):349-55.

11 Kandel ER，Schwartz JH，Jessell TM.Principles of neural science〔M〕．New York:McGraw-Hill Companies，Inc，2000:93-4.

12 Zhu Y，Zhang L，Sasaki Y，et al.Protection of mouse retinal ganglion cell axons and soma from glaucomatous and ischemic injury by cytoplasmic overpression of Nmnat 1〔J〕．Invest Ophthalmol Vis Sci，2013;54(1):25-36．

13 Watts RJ，Hoopfer ED，Luo L.Axon pruning during Drosophila metamorphosis:evidence for local degeneration and requirement of the ubiquitin-proteasome system〔J〕．Neuron，2003;38(6):871-85.

14 Yan T，F(xiàn)eng Y，Zheng J，et al.Nmnat 2 delays axon degeneration in superior cervical ganglia dependent on its NAD synthesis activity〔J〕．Neurochem Int，2010;56(1):101-6.

15 Luo L，O'Leary DD.Axon retraction and degeneration in development and disease〔J〕．Annu Rev Neurosci，2005;28(1):127-56.

16 Coleman M.Axon degeneration mechanisms:commonality amid diversity〔J〕．Nat Rev Neurosci，2005;6(11):889-98.