王海峰，張 紅

1武警工程大學醫(yī)院，陜西 西安 710086；2陜西省中醫(yī)藥研究院

不同大孔吸附樹脂對葛根總黃酮分離純化效果的影響*

王海峰1，張 紅2

1武警工程大學醫(yī)院，陜西 西安 710086；2陜西省中醫(yī)藥研究院

目的：考察三種大孔吸附樹脂對葛根總黃酮的吸附及解吸性能，為分離純化葛根總黃酮提供選擇依據(jù)。方法：以葛根總黃酮為篩選指標，考察A B-8、N K A和X-5三種大孔樹脂對葛根總黃酮的吸附量和解吸率。結果：以A B-8樹脂為吸附劑。最佳分離條件為上樣濃度：1 g/m L(按生藥計算)，流速：2～3 m L/m i n，70%乙醇為洗脫劑，用量為2.5 BV，總黃酮得率76.22%。結果：A B-8大孔吸附樹脂可用于分離純化葛根總黃酮，總黃酮得率76.22%。結論：三種大孔吸附樹脂相比較，以A B-8為分離純化葛根總黃酮的最佳吸附劑。

葛根總黃酮；葛根素；大孔吸附樹脂

葛根(Pueraria lobata(Willd.)Ohwi)是豆科落葉藤本植物野葛根，最早載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，性平，味甘辛，功效解肌退熱，生津止渴，升陽透疹［1］。藥理研究發(fā)現(xiàn)葛根具有抗缺氧，改善腦循環(huán)，保護心肌缺血，降血壓等作用［1-4］。臨床主要用于急性腦梗塞，急性心肌梗塞，不穩(wěn)定性心絞痛，高粘血癥的治療［5-8］。葛根含黃酮類化合物高達7.6%，主要有葛根素、大豆素、大豆素4′，7-二葡萄糖苷黃豆苷等［9-10］。本研究采用葛根70%乙醇回流得到粗提液為原料，比較AB-8、NKA-9和X-5三種大孔吸附樹脂對葛根總黃酮的分離效果，并考察AB-8大孔吸附樹脂分離純化葛根總黃酮的工藝和方法。

1 材料與方法

1.1 材料 葛根采自陜西省安康市鎮(zhèn)平縣。葛根素標準品購于中國藥品生物制品檢定所，批號：110752-200511；AB-8、NKA及X-5大孔吸附樹脂購于天津南開大學化工廠；其他化學試劑均為分析純。

1.2 儀器 UV-2201型紫外分光光度計；層析柱(φ15 mm×200 cm)。

1.3 方法

1.3.1 葛根粗提液制備 將葛根藥材(300 g)烘干，粉碎成粗粉，采用30%乙醇為溶劑回流提取3次，1.5h/次，濾過，濾液合并，減壓濃縮至300mL，得到葛根粗提液。

1.3.2 葛根總黃酮含量測定 以葛根素為對照品，采用紫外分光光度法測定葛根總黃酮含量。

1.3.2.1 標準曲線的繪制 精密稱取葛根素4.88 mg，置于25 mL量瓶中，加95%乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為儲備液(含葛根素0.1952mg/mL)。精密量取儲備液 0.00，0.40，0.80，1.20，1.60，2.00 mL，置于25 mL量瓶中，加95%乙醇稀至刻度，搖勻。分別于254 nm波長處測定吸光度，并建立濃度對吸光度的線性回歸方程：A=62.216C+ 0.0043；相關系數(shù)r=0.999 7，見圖1。

圖1 標準曲線

1.3.2.2 含量測定 取葛根粗提液0.1 mL，置于25 mL容量瓶中，加95%乙醇至刻度，搖勻。另取1.0 mL乙醇同法稀釋作空白對照，在254 nm波長處測定吸光度。計算葛根總黃酮的含量，結果為3.997 mg/mL。

1.3.3 3種大孔吸附樹脂吸附性能的比較(柱層析分離純化)

1.3.3.1 大孔吸附樹脂預處理 AB-8、NKA和X-5 3種樹脂各取100 g，加95%乙醇適量，浸泡3天，讓樹脂充分溶脹，然后用95%乙醇洗脫至流出液中加水后無白色渾濁出現(xiàn)，再用蒸餾水洗盡乙醇，備用。

1.3.3.2 吸附量與解吸率測定 精密稱取預處理過的樹脂5 g，置于三角瓶中，精密加入葛根粗提液50 mL，振蕩24小時，濾過，測定濾液中總黃酮濃度。計算3種樹脂的吸附量和吸附率。再向吸附的樹脂中精密加入95%乙醇50 mL，振蕩24小時，濾過，測定濾液中總黃酮濃度，根據(jù)總黃酮解吸量計算解吸率。

2 結果

2.1 吸附量與解吸率測定結果 標準曲線的建立以“1.3.2.1”項下方法繪制標準曲線，建立總黃酮濃度對吸光度的線性回歸方程：A=66.163C+ 0.043 5；r=0.999 5，計算吸附量和解吸率。實驗結果可見3種樹脂中，AB-8大孔樹脂對葛根總黃酮的吸附量和解吸率最大，見表1。

表1 3種樹脂對葛根總黃酮的吸附量與解吸率測定 m g

2.2 A B-8大孔樹脂對葛根總黃酮的分離純化

2.2.1 吸附流速對吸附效果的影響 吸附流速對吸附效果的影響主要是影響溶質(zhì)向樹脂表面的擴散。如果流速太高，溶質(zhì)分子來不及擴散到樹脂表面，就會發(fā)生漏過。對相同的葛根浸提液(50mL)在相同條件下，分別進行了AB-8樹脂在吸附流速為小流速(2～3 mL/min)，中檔流速(4～5 mL/min)、最高流速(6～7 mL/min)的吸附實驗，結果表明流速為2～3 mL/min時黃酮洗脫量最大，見表2。

表2 吸附流速對吸附效果的影響

2.2.2 洗脫劑及洗脫濃度的選擇 取AB-8樹脂，濕法裝柱(徑高比1∶15)，準確吸取50 mL樣品原液，以流速1 mL/min上柱，分別準確配制30%、50%、70%、80%和90%的乙醇洗脫劑，檢測它們在相同條件下通過樹脂柱時的解吸率，實驗發(fā)現(xiàn)70%以下乙醇洗脫曲線光滑，無拖尾，其解吸率適中，因此選用70%乙醇洗脫，見表3，洗脫曲線見圖2。

表3 不同濃度乙醇洗脫劑對吸附效果的影響

2.2.3 洗脫劑用量的選擇 用AB-8大孔樹脂(樹脂體積25 mL)飽和吸附葛根粗提液，分別用60、90、120、150、180、200、240、270 mL 70%的乙醇洗脫，收集每一樹脂流出液體積，計算黃酮洗脫率，依據(jù)累積洗脫率確定70%乙醇用量，見表4。

表4 洗脫劑用量考察結果

實驗發(fā)現(xiàn)當洗脫劑用量大于8倍樹脂體積得到的黃酮量少，因70%乙醇用量是樹脂體積5倍時洗脫率累積達到76.22%，說明此時大孔樹脂吸附的黃酮已基本被洗脫下來，并且在其用量為4倍樹脂體積時洗脫率為58.55%。當70%乙醇用量為樹脂體積5～8倍時，黃酮洗脫率的累積值較小，說明70%乙醇用量大于5倍樹脂體積得到的黃酮量少，因此確定體積分數(shù)70%乙醇的最適宜用量為5倍樹脂體積。

圖2 不同濃度乙醇洗脫劑的洗脫曲線

3 結論

大孔樹脂(macroporous resin)是以苯乙烯和丙酸酯為單體，加入乙烯苯為交聯(lián)劑，甲苯、二甲苯為致孔劑，經(jīng)聚合反應制備而成。聚合物形成后，除去致孔劑，樹脂中留下了大小不一、形狀各異、互相貫通的孔洞。是分離中草藥水溶性成分的一種有效方法［11］。

3種樹脂中AB-8對葛根總黃酮和葛根素具有較高的吸附量，對葛根總黃酮的解吸率超過75%，可用于葛根總黃酮的分離純化。通過動態(tài)吸附、解吸的方法，以總黃酮吸附率和解吸率為評價指標，對AB-8大孔吸附樹脂分離純化葛根總黃酮效果影響的最佳條件為：以70%乙醇為洗脫劑、用量為樹脂體積的5倍，吸附流速2～3 mL/min。葛根總黃酮收率為76.22%，表明AB-8大孔樹脂純化法能夠富集葛根黃酮，適合于葛根黃酮的純化。

［1］ 徐國鈞，何宏賢.中國藥材學［M］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，1996:249.

［2］ 韋正友，湯泉，焦東桂，等.葛根素對常壓密閉條件下小鼠的抗缺氧作用［J］.基層中藥雜志，1997，11(4):43-44.

［3］ 劉啟功，王琳.葛根素對心肌梗塞犬冠脈側枝循環(huán)的影響［J］.中國中藥雜志，1999，24(5):304-306.

［4］ 黃兆銓，葉武.葛根素對高血壓患者血漿內(nèi)皮素和一氧化氮的影響［J］.中國現(xiàn)代應用藥學雜志，1999，16(3):13-15.

［5］ 馬琳，何婭.葛根素注射液治療急性腦梗塞68例［J］.陜西中醫(yī)，1999，20(1):11.

［6］ 李淑梅，劉斌，陳海芬，等.葛根素注射液對急性心肌梗塞患者血漿內(nèi)皮素及腎素血管緊張素系統(tǒng)的影響［J］.中國中西醫(yī)結合雜志，1997，17(6):339-341.

［7］ 趙志明，楊曉英.葛根素治療不穩(wěn)定性心絞痛的臨床研究［J］.中國中西醫(yī)結合雜志，1998，18(5):282-284.

［8］ 劉艷娟，吳漢卿.葛根素注射液治療高粘血癥的臨床觀察［J］.中國中醫(yī)藥科技，1999，6(2):115-116.

［9］ 許永興，瞿海斌，陳赟.葛根素大孔吸附樹脂層析分離動力學［J］.高?；瘜W工程學報，2005，19(6):29-34.

［10］馬振山.大孔吸附樹脂在藥學領域中的研究應用［J］.中成藥，1997，19(12):40-41.

［11］李劍君，李穩(wěn)高，高新，等.A B-8型大孔吸附樹脂吸附葛根素過程的研究［J］.西安交通大學學報，2000，34(4):78-81.

Influence of Macroporous Adsorption Resin on Purification of Total Flavonoids from GeGen

WANG Haifeng1,ZHANG Hong2
1 Hospital Affiliated to Engineering University of CAPF,Xi′an 710086,China;
2 Shaanxi Provincial Academy of Traditional Chinese Medicine

Objective:To provide reference for purifying total flavonoids from GeGen［Puerariae lobata(Willd.) ohwi］by observing adsorption and desorption of macroporous absorption resin to total flavonoids from GeGen. Methods:By taking total flavonoids from GeGen as screening index,adsorption volume and desorption rate of total flavonoids from GeGen were investigated by three kinds of macroporous adsorption resins AB-8,NKA and X-5.Results:AB-8 resin was taken as adsorbent.The optimal separation conditions were sample concentrations:1 g/mL(calculated according to crude drugs),flow rate:2～3 mL/min,70%ethanol as eluent,dosage:2.5BV,total flavonoids yield was 76.22%.Conclusion:AB-8 is chosen as the best adsorbent of separating and purifying total flavonoids from GeGen after comparing three kinds of macroporous absorption resins.

total flavonoids from GeGen;puerarin;macroporous absorption resin

R567.1

A

1004-6852(2015)11-0027-03

2014-11-29

西安市科技計劃項目［編號 SF0931(1)］。

王海峰(1976—)，男，主管藥師。研究方向：中藥藥劑學。