吳 萍，何慶元，李正鵬，史 鈞，祝嫦巍

(安徽科技學院 應用微生物研究所, 安徽 鳳陽 233100)

大豆根瘤菌對不同微肥及pH耐性的篩選

吳 萍，何慶元，李正鵬，史 鈞，祝嫦巍

(安徽科技學院 應用微生物研究所, 安徽 鳳陽 233100)

在YMA平板上對14株大豆根瘤菌進行Fe、Co、B、Mo、Zn及pH的耐性試驗。結果表明，在檸檬酸鐵濃度為0.05%時，64%的供試菌株能生長，當濃度增至0.25%時，所有菌株均不生長；在氯化鈷濃度為0.005%時，57%的供試菌株能正常生長，當濃度增至0.025%時，所有菌株均不生長；在硼酸濃度為0.04%時64%供試菌株能正常生長，當濃度上升到0.10%時，所有菌株生長均受抑制或不生長；在鉬酸鈉濃度為0.4%時供試菌株均能生長，當濃度增至0.6%時，有36%的菌株能正常生長；在硫酸鋅濃度為0.025%時有36%的菌株能正常生長，當濃度增至0.075%時，所有菌株受抑制或不生長。表明供試菌株對鉬、硼的耐性較強，而對鋅、鐵、鈷的耐性較弱；不同根瘤菌株對同一微量元素的耐性差異較大，同一根瘤菌對不同微量元素的耐性也有差異。多數(shù)菌株在pH6.0～8.0范圍內生長正常，耐堿能力比耐酸能力強。其中AWCS13-4菌株耐受微量元素和酸堿度能力最強。

大豆根瘤菌；微量元素；耐性

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 14株大豆根瘤菌(表1)，由安徽科技學院生物技術實驗室提供。

表1 供試菌株

1.1.2 培養(yǎng)基 ①YMA固體斜面培養(yǎng)基：甘露醇10g，酵母粉1g，MgSO4·7H2O 0.2g，K2HPO40.5g，NaCl 0.1g，CaCl20.05g ，Rh微量元素液4mL，H2O 1000mL，pH 6.8～7.0(Rh微量元素液：H3BO35g，Na2MoO45g，H2O 1000mL)，瓊脂15～20；②YMA液體培養(yǎng)基：不加瓊脂的YMA培養(yǎng)基；③YMA固體平板培養(yǎng)基：與斜面培養(yǎng)基相同。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液制備 將根瘤菌在無菌條件下接種于固體斜面培養(yǎng)基上(YMA)，于28℃培養(yǎng)3d。

將已活化的根瘤菌接1環(huán)到YMA液體培養(yǎng)基(250mL的三角燒瓶80mL培養(yǎng)基)中，在28℃，150r/min恒溫搖床中震蕩培養(yǎng)3d，隨后用無菌的0.85%生理鹽水離心洗滌3次得菌懸液備用。

1.2.2 測定方法 ①大豆根瘤菌耐鐵能力的測定：分別配制不同濃度的檸檬酸鐵，加入YMA固體培養(yǎng)基中，使其終濃度分別為0.05%、0.10%、0.25%、0.50%、0.75%、1.00%，將培養(yǎng)好的供試菌株菌懸液分別點種在不同濃度的檸檬酸鐵的YMA平板上，每個濃度設三個重復，以不含檸檬酸鐵的YMA平板為對照，于28℃培養(yǎng)3d，觀察并記錄結果；②大豆根瘤菌耐鈷能力：分別配制不同濃度的氯化鈷，加入YMA固體培養(yǎng)基中，使其終濃度分別為0.005%、0.010%、0.025%、0.050%、0.075%，接種方法同檸檬酸鐵，以不含氯化鈷為對照；③大豆根瘤菌耐硼能力：分別配制不同濃度的硼酸，加入YMA固體培養(yǎng)基中，使其終濃度分別為0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.10%，接種方法同檸檬酸鐵，以不含硼酸為對照；④大豆根瘤菌耐鉬能力：分別配制不同濃度的鉬酸鈉，加入YMA固體培養(yǎng)基中，使其終濃度分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%，接種方法同檸檬酸鐵，以不含鉬酸鈉為對照；⑤大豆根瘤菌耐鋅能力：分別配制不同濃度的硫酸鋅，加入YMA固體培養(yǎng)基中，使其終濃度分別為0.005%、0.010%、0.025%、0.050%、0.075%，接種方法同檸檬酸鐵，以不含硫酸鋅為對照；⑥大豆根瘤菌耐酸堿能力：用HCl和NaOH將YMA固體培養(yǎng)基的pH值分別調至4.0、5.0、6.0、8.0、9.0、10.0，將培養(yǎng)好的供試菌株菌懸液分別點種在不同pH值的YMA平板上，每個濃度設三個重復，以pH 7.0的YMA平板為對照，于28℃培養(yǎng)3d，觀察并記錄結果。

1.2.3 聚類分析 將供試性狀轉換為數(shù)字性狀, 如根據(jù)供試菌株的生長情況, 可將能生長或在平板上形成典型菌落者記為“ 1”, 否則記為“ 0”。利用NTSYSpc 2.10e軟件，采用平均連鎖法(UPGMA)，聚類結果以樹狀圖譜的方式表示。

2 結果與分析

2.1 大豆根瘤菌的耐鐵能力

供試根瘤菌的耐鐵能力總體表現(xiàn)較弱(表2)，但不同菌株對鐵的耐性存在一定的差異。9株供試菌株(64%)能在0.05%的檸檬酸鐵YMA平板上生長，所有菌株在0.25%以上的檸檬酸鐵YMA平板上不生長。其中菌株AHM6-3、AWL6-4B對鐵更為敏感，低濃度的鐵(0.10%)也使其生長受到抑制。而低濃度的檸檬酸鐵(0.05%)對AWCS13-4有促進作用。

2.2 大豆根瘤菌的耐鈷能力

供試根瘤菌的耐鈷能力總體表現(xiàn)較弱(表2)。有8株供試菌株(57%)在0.005%氯化鈷的YMA平板上能正常生長，但濃度上升到0.010%時，菌株生長均受抑制或不生長。當YMA平板上氯化鈷的濃度達到0.025%時，所有供試菌株均不生長。耐鈷能力相對較好的菌株是AFFZC7、ASF17、AHM7A、AWL12-1、AFL15、AHM2B。

表2 不同濃度的鐵、鈷對根瘤菌生長的影響

注：-不生長，+生長差，++菌落生長與對照相當，+++菌落生長比對照好。下同。

2.3 大豆根瘤菌的耐硼能力

從表3可知，供試根瘤菌的耐硼能力總體較好，但是不同菌株對硼的耐性存在一定的差異。有9株(64%)供試菌株在0.04%硼酸YMA平板上正常生長，當濃度上升到0.10% 時，所有菌株生長均受到不同程度的抑制。其中菌株AATB25對硼酸更為敏感，當濃度為0.03%時，生長均受到抑制。而低濃度的硼酸對AWCS13-4、AWL12-1、AFL15有促進作用。

2.4 大豆根瘤菌的耐鉬能力

從表3可知，供試根瘤菌的耐鉬能力總體表現(xiàn)較好。所有供試菌株均能在0.4%的鉬酸鈉YMA平板上生長，在0.5%鉬酸鈉YMA平板上有12株(86%)可以生長，5株(36%)可以在0.6%鉬酸鈉YMA平板上正常生長。并且低濃度鉬酸鈉對AWCS13-4、AWL6-4B、AHM2B菌株有促進作用，甚至濃度達到0.4～0.5%時， AWL12-1菌株生長最好。

表3 不同濃度的硼、鉬對根瘤菌生長的影響

2.5 大豆根瘤菌的耐鋅能力

供試根瘤菌的耐鋅能力總體較弱(表4)，但是不同菌株對鋅的耐性有差異。所有菌株在0.075%硫酸鋅YMA平板上均受抑制或不生長，當硫酸鋅濃度為0.05%時，僅有2株供試根瘤菌(14%)生長良好。在0.025%硫酸鋅YMA平板上，有5株供試菌(36%)能正常生長。耐鋅能力較強的菌株是AWCS13-4、AATB25、AHM2B，AHM7A對鋅最敏感。但低濃度硫酸鋅對AFFZC7、AWCS13-4、AFL15、AWL6-4B、AHM2B、ABL9-2有促進作用。

2.6 大豆根瘤菌的耐酸堿能力

供試根瘤菌的耐酸堿能力有一定差異(表4)，菌株在中性條件均生長良好。大部分菌株在酸性條件下生長均受影響。pH 4.0時，2株供試菌株(14%)能正常生長，36%的菌株在pH 5.0時能正常生長，pH 6.0和8.0時，93%的菌株能生長，71%的菌株在pH 9.0時能正常生長，36%的供試菌株在pH10.0時能正常生長。其中AHM6-3、AWCS13-4菌株耐酸堿能力最強，在pH4.0～10.0范圍之間均可正常生長。而AATB25菌株耐酸能力最差。

表4 不同濃度的鋅、pH對根瘤菌生長的影響

2.7 大豆根瘤菌對各種微量元素耐性的多樣性分析

以菌株在各種微量元素的條件下能否增殖為標準，用平均連鎖法(UPGMA)對來自于安徽不同地區(qū)的14株大豆根瘤菌耐性能力相似性進行聚類分析(圖1)。從圖1看出，安徽不同地區(qū)分離到的大豆根瘤菌對微量元素耐性能力呈現(xiàn)多樣性，來自同一地區(qū)的大豆根瘤菌對微量元素耐性能力也呈現(xiàn)多樣性；并且分離到的大豆根瘤菌在微量元素耐性上沒有按照地理來源進行聚群，如同一類群的菌株可以來源于不同的采集點，如AWCS13-4和AATB25菌株，而同一個采集點分離到的菌株也可以聚在不同類群中，如AWL12-1和AWL6-4B菌株。以上這些現(xiàn)象的出現(xiàn)可能于當?shù)胤N植制度、土地利用狀況以及環(huán)境因素等多方面存在差異有關。

3 結論與討論

供試根瘤菌對不同微量元素的耐性有差異。試驗結果表明：耐鉬、硼能力遠高于耐鈷、鐵、鋅的能力，耐鉬能力強于耐硼能力，耐受鈷、鐵、鋅能力上表現(xiàn)為鋅>鐵>鈷。耐堿能力比耐酸能力強。其中AWCS13-4菌株耐受微量元素和酸堿度能力最強。并且不同地區(qū)大豆根瘤菌對微量元素的耐性能力呈現(xiàn)多樣性，來自同一地區(qū)的大豆根瘤菌對微量元素的耐性能力也呈現(xiàn)多樣性。

一定濃度的鐵、鈷、硼、鉬、鋅對根瘤菌生長有一定的促進作用。同時有研究表明微量元素還可增強根瘤菌株的競爭性和有效性?？梢姡欢舛鹊奈⒘吭貙Ω鼍纳L、競爭結瘤和高效固氮有一定的促進作用。因此，在研究“根瘤菌+微量元素”高效復合根瘤菌劑中，微量元素不能隨意復配，除需考慮根瘤菌對微量元素的耐性外，還應考慮根瘤菌的結瘤能力、競爭結瘤能力、共生固氮有效性和相應微量元素對它們的影響，同時還需注意菌劑pH。

[1]馬中雨，李俊，張永芳，等.大豆根瘤菌與大豆品種共生匹配性研究[J].大豆科學，2008,27(2):221-227.

[2]江木蘭，張學江，徐巧珍，等.大豆—根瘤菌的固氮作用[J]. 中國油料作物學報，2003,25(1):51-53.

[3]楊江科，周琴，周俊初. pH 對土壤中土著快、慢生大豆根瘤菌結瘤的影響[J]. 應用生態(tài)學報，2001,12(4)：639-640.

[4]李艷杰. 接種大豆根瘤菌對大豆生長及產(chǎn)量的影響[J]. 黑龍江農(nóng)業(yè)科學，2013(1):50-52.

[5]陳遠學，徐開未，張小平，等.花生根瘤菌對微量元素耐性的篩選[J]. 中國土壤與肥料，2007(4):76-79.

[6]杜應瓊，廖新榮，黃志堯，等.硼、鉬對花生氮代謝的影響[J]. 作物學報，2001,27(5):612-616.

[7]周可金，馬成澤，李定波，等.花生B、Cu、Mo、Zn肥配施效應研究[J]. 花生學報，2003,32(1):21-25.

[8]江榮風，張福鎖. 硼對大豆結瘤和固氮作用的影響[J]. 植物營養(yǎng)與肥料學報，1994(1):67-73.

[9]徐開未，張小平，陳遠學，等.鉬與花生根瘤菌的復配及在酸性紫色土上的接種效果[J]. 植物營養(yǎng)與肥料學報，2005,11(6):816-821.

( 責任編輯:李孟良)

Tolerance Screening of Soybean Rhizobium in Different Microelement Fertilizer and pH

WU Ping，HE Qing-yuan，LI Zheng-peng，SHI Jun，ZHU Chang-wei

(Institute of Applied Microbiology, Anhui Science and Technology University，F(xiàn)engyang 233100，China)

Tolerance experimentation of 14 rhizobial strains for five microelement (iron, cobalt, boron, molybdenum and zinc) and pH was tested using YMA plates. The results show that 64%, 57%, 64%, 100%, 36% and 36% strains could normally grow in 0.05% ferric citrate, 0.005% cobalt chloride, 0.04% boric acid, 0.40% and 0.6% sodium molybdate and 0.025% zinc sulfate, respectively. No strain was grown in 0.25% ferric citrate, 0.025% cobalt chloride, 0.10% boric acid or 0.075% zinc sulfate. The tested strains have relatively strong tolerance to molybdenum and boron and relatively weak tolerance to Zinc, iron and cobalt. The resistance of the same strain has difference among different microelements, and the resistances of the same microelement have difference among different strains. The majority of strains could normally grow in the range of pH6.0～8.0, thereinto, while AWCS13-4 have the strongest resistance for microelements and pH among all strains.

Soybean rhizobia；Microelements; Tolerance to stresses

2014-12-29

安徽省教育廳自然科學基金項目(KJ2011Z066)；安徽省教育廳自然科學基金項目 (KJ2013A077)；安徽科技學院自然科學基金項目(ZRC2013367)；安徽科技學院生物學重點建設學科項目(AKXK20102-1)。

吳萍(1958-)，女，安徽省五河縣人，教授，主要從事生物肥料研究。

S565.1

A

1673-8772(2015)02-0020-05