畢田田 王娜 侯淑萍 劉原君 岑醒洪 王惠平

體外鑒定衣原體質(zhì)粒侵襲細(xì)胞相關(guān)毒力基因

畢田田 王娜 侯淑萍 劉原君 岑醒洪 王惠平

目的 比較幾種轉(zhuǎn)化沙眼衣原體鼠肺炎株（MoPn）對宿主細(xì)胞的感染力，鑒定與衣原體質(zhì)粒侵襲細(xì)胞相關(guān)的毒力基因。方法 培養(yǎng)攜帶敲除了不同開放閱讀框架（ORF）質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化菌株，并不斷擴(kuò)增收集。測定濃度后，以相同菌量接種并按離心+二乙胺乙基葡聚糖（DEAE）、離心、DEAE、無任何處理4個條件分別對菌株進(jìn)行處理，采用間接免疫熒光法計(jì)數(shù)包涵體數(shù)目；分別于（20、40、60 h）觀察各菌株連續(xù)3代感染細(xì)胞后菌斑形成速度與面積。用Lugol碘染色觀察各菌株包涵體內(nèi)糖原合成情況。結(jié)果 敲除質(zhì)粒編碼蛋白Pgp4的菌株 pGFP::CMΔPgp4在 4種條件下包涵體數(shù)目分別為（10.20±1.30）、（6.80±0.44）、（3.00±1.22）、（0.80±0.45）個，陰性對照組質(zhì)粒缺失株CMUT3包涵體數(shù)目分別為（6.40±0.89）、（3.80± 0.83）、（1.60±0.89）、（0.60± 0.54）個，同一條件下兩者均表現(xiàn)出相近的感染力，包涵體數(shù)目均低于同一條件下其他菌株（均P<0.01）。同一菌株不同條件下，包涵體數(shù)目差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=845.310，P<0.01），各菌株在離心+DEAE條件下包涵體數(shù)目最多；連續(xù)3代感染細(xì)胞時菌斑形成速度和大小均低于其他菌株；并有糖原累積的障礙。結(jié)論 Pgp4是衣原體質(zhì)粒侵襲細(xì)胞相關(guān)的毒力基因之一。

沙眼衣原體；質(zhì)粒；包涵體；毒力；基因；體外研究

沙眼衣原體（Chlamydia trachomatis,Ct）感染在全球呈增長態(tài)勢，已居性傳播疾病首位［1］。Ct感染與輸卵管阻塞關(guān)系密切，是造成不孕不育的主要原因之一［2-3］。Ct對輸卵管的致病機(jī)制尚不明確，許多實(shí)驗(yàn)室對衣原體質(zhì)粒缺失株和野生株進(jìn)行了對比性研究，發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒缺失株在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中對于動物組織引起的病變均明顯低于野生株，甚至不引起病變［4-6］。研究發(fā)現(xiàn)，決定輸卵管病變的毒力基因位于衣原體質(zhì)粒上［7］，但迄今尚未鑒定出具體的毒力基因。Ct質(zhì)粒長約7.5 kb，共編碼8個開放閱讀框架（ORF）pORF1-8［8］，導(dǎo)致輸卵管病變的基因或許在這8個ORF中，毒力基因可能是一個或多個ORF，在感染的過程中表達(dá)8種蛋白，分別為質(zhì)粒編碼蛋白 Pgp1-8。在轉(zhuǎn)錄水平上發(fā)現(xiàn)，Pgp1、2、6、8 對于維持質(zhì)粒的穩(wěn)定性是必須的，無法進(jìn)行基因敲除。目前已成功敲除Pgp3、4、5、7，并構(gòu)建了重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化菌株［9］，在此基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)旨在體外實(shí)驗(yàn)中初步鑒定毒力基因并探索其致病的機(jī)制，為臨床治療Ct感染提供新的思路。

作者單位：300052天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院皮膚科（畢田田、侯淑萍、劉原君、岑醒洪、王惠平）；蘭陵縣婦幼保健院檢驗(yàn)科（王娜）

資料與方法

一、資料

1.細(xì)胞及菌株來源：Hela細(xì)胞系由天津市性傳播疾病研究所細(xì)胞培養(yǎng)室保存。鼠肺炎型沙眼衣原體菌株：WT為野生株，CMUT3為質(zhì)粒缺失株，pGFP::CM為鼠型沙眼衣原體Mopn菌株質(zhì)粒CM與pGFP載體融合菌株。pGFP上攜帶氨芐西林的抗性基因，可用含氨芐西林的培養(yǎng)基對融合成功的質(zhì)粒進(jìn)行篩選，pGFP載體還可以表達(dá)發(fā)綠色熒光的蛋白。pGFP::CMΔPgp3、4、5、7分別為敲除開放閱讀框不同基因的質(zhì)粒攜帶株。各菌株原體EB來自美國得克薩斯大學(xué)圣安東尼奧醫(yī)學(xué)科學(xué)中心鐘光明教授實(shí)驗(yàn)室，保存于-80℃中備用。

2.主要試劑：細(xì)胞培養(yǎng)液（含Earlys鹽的MEM培養(yǎng)基，10%胎牛血清，50 mg/L慶大霉素）；衣原體感染液（細(xì)胞培養(yǎng)液中加入兩性霉素B、萬古霉素和1 mg/L放線菌酮）；二乙胺乙基葡聚糖（DEAE-D）；細(xì)胞消化液：0.25%胰酶液與0.02%乙二胺四乙酸（EDTA）的混合液，兩者體積比 1∶3，0.2 μm 抽濾器抽濾滅菌；SPG磷酸鹽緩沖液：蔗糖74.62 g，磷酸二氫鉀0.512 g，磷酸氫二鉀1.237 g，L谷氨酸0.845 g，溶于800 ml水中，用10 mol/L NaOH調(diào)節(jié)至7.2，用純水調(diào)節(jié)最終體積至1L，0.2 μm濾器抽濾滅菌，分裝后4℃保存；一抗為單克隆抗體MC22（鼠抗沙眼衣原體主要外膜蛋白MOMP蛋白），來自美國得克薩斯大學(xué)圣安東尼奧醫(yī)學(xué)科學(xué)中心鐘光明教授實(shí)驗(yàn)室；二抗為FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG，來自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

3.主要器材：6孔細(xì)胞培養(yǎng)板、24孔細(xì)胞培養(yǎng)板、細(xì)胞刮子購自美國Costar公司，超凈工作臺購自天津市醫(yī)療器械工業(yè)公司醫(yī)藥凈化設(shè)備廠。

二、方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)：將Hela細(xì)胞從液氮罐中復(fù)蘇培養(yǎng)成功后，接種到6孔培養(yǎng)板，在5%CO2溫箱37℃培養(yǎng)16～24 h，待細(xì)胞長成致密單層后吸出培養(yǎng)液，每孔加入30 mg/L DEAE-D 2 ml室溫下作用30 min。

2.沙眼衣原體的培養(yǎng)與擴(kuò)增：吸出各細(xì)胞孔中的DEAE-D液，加離心液（不加血清的DMEM液），將凍存于-80℃的上述菌株常溫解凍，倍比稀釋后接種于預(yù)先放置有載玻片的24孔板上，32℃1 200×g離心1 h，5%CO2孵箱37℃培養(yǎng)20～24 h。采用間接免疫熒光技術(shù)檢測包涵體以確定衣原體培養(yǎng)成功，并觀察不同稀釋度下各菌株的感染率。在6孔板中進(jìn)行衣原體的擴(kuò)增，擴(kuò)增時選用感染率達(dá)60%左右的稀釋濃度進(jìn)行接種，擴(kuò)增數(shù)代后，選用1 000 ml SPG收集2個6孔板的衣原體，每管50 μl分裝至無菌的微量離心管中，-80℃保存，待測衣原體濃度。

3.間接免疫熒光法對沙眼衣原體濃度的測定：將不同菌株按 1 ∶1 000、1 ∶2 000、1 ∶4 000……倍比稀釋后接種于預(yù)先放置有載玻片的24孔板中，培養(yǎng)20～24 h后，吸出細(xì)胞培養(yǎng)孔中的衣原體感染液，用預(yù)冷的PBS洗滌；冰甲醇固定單層細(xì)胞10 min；經(jīng)預(yù)冷PBS洗滌1遍；用200～500 μl含10%胎牛血清的DMEM液封閉放于4℃8 h；加入一抗（1∶40稀釋）200 μl，4℃過夜；PBS清洗 6遍；加入二抗（1∶80稀釋）50 μl避光放于37℃孵箱中1 h；PBS洗滌3～6遍；緩沖甘油封片，熒光顯微鏡（×400）觀察計(jì)數(shù)，計(jì)算不同菌株的濃度。每ml包涵體形成單位（IFU）=鏡下包涵體個數(shù)×876.16×稀釋倍數(shù)×（1 000/實(shí)際體積）。

4.在4種條件下計(jì)數(shù)包涵體：不同菌株均以1.5×104IFU接種，每個菌株接種時均設(shè)置4個不同的條件（離心+DEAE、離心、DEAE、無任何處理），培養(yǎng)20～24 h后，間接免疫熒光法計(jì)數(shù)不同條件每孔包涵體的數(shù)目。計(jì)數(shù)時每孔計(jì)數(shù)5個不同的視野最后計(jì)算平均值。

5.菌斑形成情況：將不同菌株按能達(dá)相近的感染率（約10%）時的菌量接種，衣原體感染宿主細(xì)胞后，分別在20、40、60 h固定細(xì)胞，免疫熒光染色，觀察不同菌株連續(xù)3代感染細(xì)胞后的菌斑形成情況。

圖1 接種培養(yǎng)后通過間 接免疫熒光檢測包涵體（箭頭，免疫熒光× 400） 1A ～ 1G：分別表示野生株WT、質(zhì)粒缺失株CMUT3、融合菌株pGFP::CM、轉(zhuǎn)化菌株pGFP::CMΔPgp3、pGFP::CMΔPgp4 、pGFP : : CMΔPgp5 、pGFP::CMΔPgp7；培養(yǎng)后均見包涵體形成

6.沙眼衣原體包涵體Lugol碘液染色檢查：吸出細(xì)胞培養(yǎng)孔中的衣原體感染液，自然風(fēng)干或者吹干后，用冰甲醇固定單層細(xì)胞10 min，Lugol碘液母液用蒸餾水稀釋4～5倍后染色，觀察不同菌株的包涵體內(nèi)糖原染色情況。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

各組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有數(shù)據(jù)用±s表示，同一條件下菌株pGFP::CMΔPgp4與其他菌株包涵體數(shù)目的比較和不同條件下同一菌株間包涵體數(shù)目之間的比較，采用析因設(shè)計(jì)的方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、接種培養(yǎng)后通過間接免疫熒光檢測包涵體

免疫熒光顯微鏡下觀察（×400），可見亮綠色、具有直徑2～3 mm典型大小中強(qiáng)綠色的點(diǎn)狀或團(tuán)塊狀熒光即為包涵體，見圖1。

表1 各衣原體菌株濃度測定結(jié)果

二、各衣原體菌株濃度測定的結(jié)果

不同稀釋濃度的菌株接種培養(yǎng)20～24 h后，按條件（離心+DEAE）進(jìn)行處理，采用間接免疫熒光法，×400免疫熒光顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)每孔包涵體數(shù)目，每個稀釋濃度計(jì)數(shù)5個視野，按公式計(jì)算所收集的微量離心管管中衣原體濃度。見表1。

三、體外檢測各菌株感染能力

按相同的菌量（1.5×104IFU）接種，比較各轉(zhuǎn)化菌株在不同條件侵襲和粘附宿主細(xì)胞的能力。陽性對照組為野生株WT，陰性對照組為質(zhì)粒缺失株CMUT3。見圖2。

圖2 不同條件下不同菌株包涵體數(shù)目 1：WT；2：CMUT3；3：pGFP::CM；4：pGFP::CMΔPgp3；5：pGFP::CMΔPgp4；6：pGFP::CMΔPgp5；7：pGFP::CMΔPgp7

析因分析提示不同條件之間各菌株包涵體數(shù)目差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=845.310，P<0.01），離心+DEAE條件下包涵體數(shù)目最多，無任何處理時包涵體數(shù)目最少，提示離心和DEAE均能增強(qiáng)毒力基因在體外對宿主細(xì)胞的侵襲和粘附能力；相同條件下pGFP::CMΔPgp4與 WT，pGFP::CM，pGFP::CMΔPgp3，pGFP::CMΔPgp5，pGFP::CMΔPgp7兩兩比較，包涵體數(shù)目均較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，（F值分別為558.036，801.825，234.146，1324.473，121.784，均P<0.01），提示Pgp4是衣原體質(zhì)粒侵襲細(xì)胞相關(guān)的毒力基因之一；不同條件和不同菌株之間交互效應(yīng)顯著（F=89.645，P<0.01）。

四、各菌株菌斑形成能力的檢測

菌斑形成實(shí)驗(yàn)是用來檢測衣原體在細(xì)胞與細(xì)胞之間的傳播能力的方法之一。本實(shí)驗(yàn)中，各菌株連續(xù)3代感染細(xì)胞后，在相同時間段（感染后20、40、60 h）觀察各菌株菌斑形成的速度及大小，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在相同感染率接種的情況下，相同時間段野生株菌斑形成速度最快，面積最大；質(zhì)粒缺失株菌斑形成速度慢，面積?。籔gp4敲除的菌株菌斑形成速度與面積均低于其他菌株，提示Pgp4基因影響衣原體在細(xì)胞與細(xì)胞之間的傳播能力。

五、各菌株糖原合成能力的檢測

倒置顯微鏡下觀察包涵體內(nèi)糖原染色，野生株和毒力基因攜帶株中糖原染色陽性，包涵體呈紅褐色或棕褐色。質(zhì)粒缺失株CMUT3和質(zhì)粒敲除株pGFP::CMΔPgp4糖原染色陰性，提示Pgp4基因影響糖原的積累。見圖3。

討 論

衣原體質(zhì)粒是一個相對分子質(zhì)量小，基因序列高度保守的雙鏈環(huán)狀DNA分子。廣泛存在于多種衣原體中，其中包括沙眼衣原體及鼠肺炎衣原體。通過質(zhì)粒缺失株和野生株的對比性研究，發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒是參與衣原體致病的毒力因子［10］。質(zhì)粒缺失株的成功轉(zhuǎn)化，為研究質(zhì)粒攜帶株的致病性提供了分子學(xué)基礎(chǔ)，為鑒定出具體的毒力基因，闡明致病機(jī)制提供可能。

沙眼衣原體的自然宿主是人，雖然它能成功感染小鼠的下生殖道，但卻不能引起小鼠輸卵管的病變，沙眼衣原體鼠肺炎株（MoPn）也稱為鼠肺炎衣原體，現(xiàn)已劃分為一個新的衣原體種（Chlamydia muridarum）［11］，經(jīng)證實(shí)不僅可以感染小鼠的生殖道，而且還可引起輸卵管的病變［12］，與女性泌尿生殖道Ct感染后的疾病發(fā)展過程一致［13］。目前，MoPn鼠生殖道感染模型已被廣泛應(yīng)用于Ct致病機(jī)制及疫苗研發(fā)等方面的研究［11］。目前運(yùn)用基因重組技術(shù)已成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pGFP::CM，并成功轉(zhuǎn)化了質(zhì)粒缺失株CMUT3。Pgp1，2，6，8是維持質(zhì)?；窘Y(jié)構(gòu)的因子，故目前只成功敲除了Pgp3、4、5、7并構(gòu)建各轉(zhuǎn)化菌株［14］。轉(zhuǎn)化成功的菌株命名為 pGFP::CMΔPgp3、pGFP::CMΔPgp4、pGFP::CMΔPgp5、pGFP::CMΔPgp7［15］。

在體外試驗(yàn)中，相同菌量接種培養(yǎng)時，質(zhì)粒缺失株CMUT3和Pgp4敲除的菌株免疫熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)包涵體數(shù)目均明顯低于其他菌株，提示質(zhì)粒缺失株CMUT3和Pgp4敲除的菌株對宿主細(xì)胞的感染能力低于其他菌株。碘染時兩菌株均出現(xiàn)包涵體內(nèi)糖原染色障礙，提示Pgp4是與毒力基因密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子并影響包涵體內(nèi)糖原的合成；以相同感染率接種培養(yǎng)相同時間觀察各菌株菌斑形成情況發(fā)現(xiàn)，Pgp4敲除的菌株與質(zhì)粒缺失株菌斑形成速度與面積均低于其他菌株，提示毒力基因Pgp4影響衣原體在細(xì)胞與細(xì)胞之間傳播的能力，可為動物實(shí)驗(yàn)鑒定影響衣原體上行感染能力的毒力基因提供基礎(chǔ)。Pgp4是質(zhì)粒編碼的開放閱讀框中最小的片段，編碼102個氨基酸［15］，質(zhì)粒編碼的許多基因的表達(dá)都依賴于Pgp4［14］，無論是在沙眼衣原體或者鼠型沙眼衣原體感染中，均已證實(shí)Pgp4是一個正轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子［15］。

圖3 碘染色在倒置顯微鏡下觀察衣原體包涵體（箭頭，碘染色 × 100） 3A、3C、3D、3F、3G：分別表示野生株、融合菌株pGFP::CM、轉(zhuǎn)化菌株pGFP::CMΔPgp3、pGFP::CMΔPgp5、pGFP::CMΔPgp7，均可見棕褐色包涵體形成；3B、3E：分別表示質(zhì)粒缺失株和pGFP::CMΔPgp4菌株細(xì)胞內(nèi)均未見包涵體形成

本研究還對衣原體的培養(yǎng)設(shè)定了4種條件：離心+DEAE、離心、DEAE-D、無任何處理。4種條件下，Pgp4敲除的菌株間接免疫熒光結(jié)果顯示包涵體形成數(shù)目均最少，離心+DEAE-D的條件下，各菌株包涵體形成數(shù)目均最多，提示DEAE和離心都能增加衣原體毒力基因?qū)λ拗骷?xì)胞的侵襲和粘附能力。離心作用的原理是通過離心力使衣原體粒子容易沉淀在細(xì)胞表面而提高感染率，DEAE-D的強(qiáng)化作用可能是其帶正電荷因而同帶負(fù)電的沙眼衣原體結(jié)合起到一種吸附作用。本研究在國內(nèi)首次采用基因敲除的重組質(zhì)粒菌株來感染細(xì)胞，在體外試驗(yàn)中初步鑒定出侵襲細(xì)胞的毒力基因Pgp4，為進(jìn)一步進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)提供一定基礎(chǔ)。

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Identification of cell invasion-related virulence genes in chlamydial plasmidsin vitro

Bi Tiantian*,Wang Na,Hou Shuping,Liu Yuanjun,Cen Xinghong,Wang Huiping.*Department of Dermatology,General Hospital,Tianjin Medical University,Tianjin 300052,China

ObjectiveTo compare the infectivity of several transformedChlamydia trachomatis（Ct）mouse pneumonitis（Mopn）strains to host cells,and to identify cell invasion-related virulence genes in Chlamydial plasmids.MethodsSeveral Ct strains,including wild-type Ct Mopn strain（WT strain）,plasmid-free Ct strain（CMUT3 strain）,Ct Mopn strain transformed with the shuttle vector carrying pGFP and the completeC.muridarum（CM）plasmid（pGFP::CM strain）and Ct Mopn strains transformed with shuttle vectors carrying pGFP and mutant CM plasmids with inframe deletions of Pgp3,4,5 or 7 （pGFP::CM△Pgp3,4,5,7 strains）,were cultured,amplified and collected.After the concentrations of Ct were determined,each of these strains was divided into four groups to be inoculated at a same amount（1.5 × 104inclusion forming units（IFU））followed by four different treatments respectively:centrifugalization+DEAE group treated with centrifugalization followed by ion-exchange chromatography on diethylaminoethyl（DEAE）-cellulose columns,centrifugalization group treated with centrifugalization only,DEAE group treated with chromatography on DEAE-cellulose columns only,control group receiving no treatment.After additional culture for 20-24 hours,indirect immunofluorescence assay was performed to count the number of chlamydial inclusions.At 20,40 and 60 hours after infection,the growth rate and area of chlamydial plaques were assessed after three continuous passages.Lugol′s iodine staining was conducted to observe glycogen synthesis in bacterial inclusions.ResultsThe inclusion number in the centrifugalization+DEAE group,centrifugalization group,DEAE group and control group was 10.20±1.30,6.80±0.44,3.00±1.22 and 0.80±0.45 respectively for the pGFP::CM△Pgp4 strain,6.40±0.89,3.80±0.83,1.60±0.89 and 0.60±0.54 respectively for the CMUT3 strain.Under same experiment conditions,the pGFP::CM△Pgp4 strain and CMUT3 strain showed similar infectivity,and formed less inclusions compared with the other Ct strains （allP<0.01）.The number of inclusions formed by the same Ct strains were significantly different among the 4 groups（F=845.310,P<0.01）,and were highest in the centrifugalization+DEAE group for all the strains.The pGFP::CM△Pgp4 strain showed significantly lower growth rate and area of plaques with an abnormality in glycogen accumulation compared with the other strains at 20,40 and 60 hours after infection.ConclusionThe plasmid-encoding gene Pgp4 may be a cell invasionassociated virulence gene in chlamydial plasmids.

Chlamydia trachomatis;Plasmids;Inclusion bodies;Virulence；Genes；In vitro

Wang Huiping,Email:huiping1208@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.05.003

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金（81301469）

王惠平，Email：huiping1208@163.com

2014-05-23）

（本文編輯：吳曉初）