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醋酸甲羥孕酮和復(fù)方庚酸炔諾酮對(duì)BALB/c小鼠下生殖道感染沙眼衣原體敏感性的影響

2015-11-07 06:28韓燕鄭冰潔尹躍平鐘銘英于瑞星
中華皮膚科雜志 2015年5期
關(guān)鍵詞:沙眼衣原體醋酸

韓燕 鄭冰潔 尹躍平 鐘銘英 于瑞星

醋酸甲羥孕酮和復(fù)方庚酸炔諾酮對(duì)BALB/c小鼠下生殖道感染沙眼衣原體敏感性的影響

韓燕 鄭冰潔 尹躍平 鐘銘英 于瑞星

目的 比較醋酸甲羥孕酮和復(fù)方庚酸炔諾酮對(duì)小鼠下生殖道感染沙眼衣原體敏感性的影響。方法 60只雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為6組,分別為空白對(duì)照組、醋酸甲羥孕酮對(duì)照組、復(fù)方庚酸炔諾酮對(duì)照組、無(wú)性激素處理感染組、醋酸甲羥孕酮感染組、復(fù)方庚酸炔諾酮感染組。其中,空白對(duì)照組、醋酸甲羥孕酮對(duì)照組和復(fù)方庚酸炔諾酮對(duì)照組小鼠在接受相應(yīng)的激素單次處理后第5天通過陰道接種MyCoy細(xì)胞懸液;無(wú)性激素處理感染組、醋酸甲羥孕酮處理感染組和復(fù)方庚酸炔諾酮處理感染組小鼠在接受相應(yīng)的激素單次處理后第5天通過陰道感染接種含1×107E型沙眼衣原體包涵體形成單位(ifu)的懸液。接種后第4、7、14天,采集小鼠的陰道沖洗液進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),并在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組隨機(jī)選取3只小鼠處死,取陰道、子宮標(biāo)本固定,HE染色鏡檢。采用χ2檢驗(yàn)比較不同組別的感染率。結(jié)果 接種后對(duì)照組均無(wú)沙眼衣原體生長(zhǎng),無(wú)性激素處理感染組和復(fù)方庚酸炔諾酮感染組在接種沙眼衣原體后第4天培養(yǎng)陽(yáng)性率均為1/10,第7天和14天均無(wú)沙眼衣原體生長(zhǎng);醋酸甲羥孕酮感染組在接種后第4天培養(yǎng)陽(yáng)性率為7/10,第7天為2/7,第14天無(wú)沙眼衣原體生長(zhǎng)。Fisher精確概率計(jì)算顯示,醋酸甲羥孕酮感染組接種后,第4天感染率高于無(wú)性激素處理組和復(fù)方庚酸炔諾酮感染組(P=0.03);而第7天醋酸甲羥孕酮感染組感染率與其他兩個(gè)組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.23)。醋酸甲羥孕酮處理的兩組在接種后第4天、第7天和第14天陰道內(nèi)黏液增多,陰道復(fù)層鱗狀上皮變薄,上皮細(xì)胞黏液化,管腔有分泌物,黏膜下層少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),接種沙眼衣原體后第4天陰道發(fā)生病理變化,即管腔出現(xiàn)大量炎性分泌物,組織輕度水腫,黏膜下層少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。復(fù)方庚酸炔諾酮處理的兩組在各時(shí)間點(diǎn)陰道表現(xiàn)均正常,而子宮在接種后7 d,出現(xiàn)組織輕度水腫,腺腔擴(kuò)張,分泌物潴留,散在炎細(xì)胞浸潤(rùn)。結(jié)論 小鼠經(jīng)醋酸甲羥孕酮處理后動(dòng)情周期固定在動(dòng)情間期,陰道上皮黏液化,可能有助于增加小鼠沙眼衣原體在陰道內(nèi)感染的敏感性。經(jīng)復(fù)方庚酸炔諾酮處理后小鼠動(dòng)情期沒有明顯改變,子宮有改變,而這不能改變沙眼衣原體在陰道內(nèi)感染的敏感性。

醋酸甲羥孕酮;炔諾酮;沙眼衣原體;疾病模型,動(dòng)物;小鼠;生殖道感染

沙眼衣原體感染生殖道上皮細(xì)胞后,可以誘導(dǎo)組織損傷,如果患者得不到及時(shí)的診斷和治療會(huì)導(dǎo)致持續(xù)的傳播并引起嚴(yán)重的并發(fā)癥和后遺癥。構(gòu)建動(dòng)物感染模型是了解沙眼衣原體感染致病機(jī)制、免疫、病理、進(jìn)展過程以及觀察藥物療效和毒性等的重要手段。沙眼衣原體在靈長(zhǎng)類、豚鼠、豬、小鼠等動(dòng)物的生殖器官均能引起感染。小鼠是常用的動(dòng)物模型,但研究顯示小鼠生殖道感染后的表現(xiàn)與人生殖道感染后的表現(xiàn)不同,很少引起系統(tǒng)性病變,炎癥較輕,且很快會(huì)被清除。孕激素處理能夠增加小鼠陰道對(duì)沙眼衣原體的易感性,模擬人感染的自然進(jìn)程。為了解不同孕激素對(duì)小鼠感染沙眼衣原體敏感性的影響,我們選取復(fù)方庚酸炔諾酮和醋酸甲羥孕酮兩種激素,觀察并比較這兩種激素處理后小鼠下生殖道感染沙眼衣原體的情況。

材料與方法

一、材料

6周齡雌性SPF級(jí)BALB/c小鼠產(chǎn)自揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物中心[SCXK(蘇)2012-0004],體重(21.47±1.30)g,于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心按要求喂養(yǎng)。小鼠籠具為獨(dú)立送風(fēng)隔離籠具,換氣次數(shù)為每小時(shí)30次,進(jìn)風(fēng)風(fēng)速為30 m/h;溫度為(22±2)℃,相對(duì)濕度為(30±5)%。飼料為經(jīng)60Co輻照滅菌后的SPF級(jí)小鼠維持糧,產(chǎn)自江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司[蘇飼審(2008-01.0080)],每日每籠投喂約50 g。飲用水為滅菌水,每日每籠約200 ml。E型沙眼衣原體Bour標(biāo)準(zhǔn)株來(lái)自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心(American type culture collection,ATCC),本實(shí)驗(yàn)室保存?zhèn)鞔?。醋酸甲羥孕酮注射液(150 mg/ml,批號(hào)X06089)產(chǎn)自美國(guó)輝瑞制藥有限公司。復(fù)方庚酸炔諾酮注射液(每ml含庚酸炔諾酮 50 mg,戊酸雌二醇 5 mg,批號(hào):110401)產(chǎn)自浙江仙琚制藥有限公司。

二、方法

1.E型沙眼衣原體株體外培養(yǎng)、制備感染液:用E型沙眼衣原體株感染MyCoy細(xì)胞,在含有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液中培養(yǎng),收集單層感染McCoy細(xì)胞,經(jīng)傳代使McCoy細(xì)胞被感染率達(dá)到90%,收集細(xì)胞保存在蔗糖谷氨酸磷酸鹽緩沖液中,定量后-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.小鼠喂養(yǎng)及接種:60只6周齡的雌性BALB/c小鼠[1]稱重后隨機(jī)分為6組,分別為空白對(duì)照組、醋酸甲羥孕酮對(duì)照組、復(fù)方庚酸炔諾酮對(duì)照組、無(wú)性激素處理感染組、醋酸甲羥孕酮感染組、復(fù)方庚酸炔諾酮感染組。實(shí)驗(yàn)前使用細(xì)胞培養(yǎng)的方法對(duì)每只小鼠的陰道沖洗液進(jìn)行沙眼衣原體檢測(cè),確證每只小鼠實(shí)驗(yàn)前不攜帶沙眼衣原體。各組小鼠在標(biāo)準(zhǔn)條件下適應(yīng)環(huán)境喂養(yǎng)1周后,在醋酸甲羥孕酮對(duì)照組及感染組,單側(cè)大腿外側(cè)肌內(nèi)注射醋酸甲羥孕酮注射液(150 g/L)20 μl[2-3];在復(fù)方庚酸炔諾酮對(duì)照組及感染組,單側(cè)大腿外側(cè)肌內(nèi)注射復(fù)方庚酸炔諾酮注射液20 μl。激素單次處理5 d后使用移液器吸取20 μl濃度約為 1 × 108包涵體形成單位(ifu)/ml的E型沙眼衣原體株接種至相應(yīng)各組小鼠的陰道內(nèi)(深入陰道0.5 cm),接種后仰臥靜止1 min。對(duì)照組接種MyCoy細(xì)胞懸液。

3.小鼠大體情況觀察:接種后第4、7、14天測(cè)量小鼠體重并記錄,同時(shí)觀察小鼠活動(dòng)情況、外生殖道表現(xiàn)及外陰分泌物情況等并拍照記錄。

4.細(xì)胞培養(yǎng)及病理檢測(cè)小鼠生殖道沙眼衣原體:接種后第4、7、14天,用 RPMI1640 運(yùn)送液 100μl,每次吸取20 μl深入小鼠陰道0.5 cm處,停留30 s后回收沖洗液,反復(fù)3次,得到約100 μl陰道沖洗液。采集得到的陰道沖洗液標(biāo)本50 μl用于細(xì)胞培養(yǎng)檢測(cè),50 μl用于盲傳,每次檢測(cè)均設(shè)衣原體陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。每一玻片見到≥1個(gè)包涵體為陽(yáng)性[4];第1次檢測(cè)陰性的標(biāo)本將利用盲傳保存液再檢測(cè)和盲傳,共3次。3次盲傳后檢測(cè)仍為陰性的標(biāo)本則認(rèn)定為真正的陰性標(biāo)本。組織形態(tài)學(xué)觀察:接種后第4、7、14天,各組隨機(jī)取3只小鼠,收集陰道沖洗液后頸椎脫臼處死,解剖取陰道、子宮標(biāo)本,4%甲醛液固定后,常規(guī)石蠟包埋切片,HE染色鏡檢。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:使用EXCEL2013錄入數(shù)據(jù),用IBM SPSS Statistics 20進(jìn)行數(shù)據(jù)整理、轉(zhuǎn)換和分析。采用χ2檢驗(yàn)比較不同組別的感染率,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、沙眼衣原體培養(yǎng)的結(jié)果

在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集的陰道沖洗液標(biāo)本中,空白對(duì)照組、醋酸甲羥孕酮對(duì)照組、復(fù)方庚酸炔諾酮對(duì)照組培養(yǎng)的結(jié)果均為陰性。Fisher精確概率計(jì)算顯示醋酸甲羥孕酮處理組4 d后的感染率(7/10,95%CI:35.4%~91.9%)高于無(wú)性激素處理組和復(fù)方庚酸炔諾酮處理組(均為1/10,95%CI0.5%~45.9%,P=0.03);而7 d后感染率醋酸甲羥孕酮處理組(2/7,95%CI5.6%~69.7%)與其他兩個(gè)組(均為 0,95%CI0~43.9%),差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.23。14 d后所有組別均未感染沙眼衣原體。

二、小鼠接種沙眼衣原體后器官大體形態(tài)及組織病理表現(xiàn)

大體形態(tài):空白對(duì)照組及無(wú)性激素處理感染組各時(shí)間點(diǎn)外陰、陰道內(nèi)黏液、解剖后子宮陰道均無(wú)異常。醋酸甲羥孕酮對(duì)照組及感染組在各時(shí)間點(diǎn)外陰、解剖后對(duì)照組陰道均無(wú)異常,但陰道內(nèi)黏液很多。復(fù)方庚酸炔諾酮對(duì)照組及感染組在各時(shí)間點(diǎn)外陰、陰道內(nèi)黏液、子宮陰道均無(wú)異常。組織病理表現(xiàn):小鼠接種沙眼衣原體后第4天,第7天和第14天后醋酸甲羥孕酮對(duì)照組陰道均出現(xiàn)復(fù)層鱗狀上皮變薄、上皮細(xì)胞黏液化、管腔有分泌物、黏膜下層少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的表現(xiàn),子宮腺腔正常,內(nèi)膜輕度水腫,散在少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);醋酸甲羥孕酮感染組第4天陰道出現(xiàn)復(fù)層鱗狀上皮變薄,上皮細(xì)胞黏液化,管腔有大量炎性分泌物,黏膜下層少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),子宮內(nèi)膜水腫,炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1),而至第7天和第14天小鼠陰道病理改變和醋酸甲羥孕酮對(duì)照組基本相同。復(fù)方庚酸炔諾酮感染組和對(duì)照組在接種后的第4天,第7天和第14天的陰道表現(xiàn)均正常,而在沙眼衣原體感染后第7天(即注射激素后第12天)子宮組織輕度水腫,腺腔擴(kuò)張,分泌物潴留,散在炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(圖2)。

圖1 醋酸甲羥孕酮感染組小鼠接種沙眼衣原體后第4天組織學(xué)表現(xiàn)(HE×200) 1A:陰道:復(fù)層鱗狀上皮變薄,上皮細(xì)胞黏液化,管腔有分泌物,黏膜下層少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);1B:子宮:腺腔正常,內(nèi)膜輕度水腫,散在少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)

圖2 復(fù)方庚酸炔諾酮感染組小鼠接種沙眼衣原體后第7天組織學(xué)表現(xiàn)(HE×200) 2A:子宮腺腔擴(kuò)張,分泌物潴留,黏膜下層伴有少量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);2B:子宮組織輕度水腫,腺腔擴(kuò)張,分泌物潴留,散在炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)

討 論

雌性小鼠性成熟后,生殖器官發(fā)生增生、退化的周期性變化為動(dòng)情周期。一般分為四期:動(dòng)情前期、動(dòng)情期、動(dòng)情后期和動(dòng)情間期。動(dòng)情前期陰道復(fù)層鱗狀上皮細(xì)胞增厚但角化未完全;動(dòng)情期陰道復(fù)層鱗狀上皮細(xì)胞厚且角化完全,表面的上皮細(xì)胞脫落至管腔中;動(dòng)情后期表現(xiàn)為復(fù)層鱗狀上皮細(xì)胞退化,角化完全的細(xì)胞脫落,同時(shí)間質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)白細(xì)胞并浸潤(rùn)表皮;動(dòng)情間期陰道的上皮細(xì)胞變薄且黏液化,間質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)很多白細(xì)胞并通過表皮移入直至管腔。鼠的一個(gè)動(dòng)情周期為4~5 d,可通過陰道脫落細(xì)胞的變化了解動(dòng)情周期的全部過程[5]。實(shí)驗(yàn)中各對(duì)照組及復(fù)方庚酸炔諾酮感染組在不同時(shí)間點(diǎn)可以觀察到不完全相同的動(dòng)情周期的病理改變;而醋酸甲羥孕酮感染組小鼠動(dòng)情周期一直維持在動(dòng)情間期:復(fù)層鱗狀上皮變薄,上皮細(xì)胞黏液化,管腔有分泌物,黏膜下層少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。Tuffrey等[6]在1981年即發(fā)現(xiàn)孕激素是建立小鼠生殖道感染沙眼衣原體模型的關(guān)鍵因素。后續(xù)的動(dòng)物研究已發(fā)現(xiàn),孕酮預(yù)處理后可以增加小鼠對(duì)沙眼衣原體感染的易感性[7-8],推測(cè)是在孕激素的影響下,小鼠生殖道上皮細(xì)胞層變薄并能夠穩(wěn)定地處在動(dòng)情間期的環(huán)境下,允許建立感染。而我們觀察到醋酸甲羥孕酮感染組小鼠陰道上皮的改變證實(shí)了該假說(shuō)。由于本實(shí)驗(yàn)中每次采集的陰道沖洗液量不足以進(jìn)行細(xì)胞因子的分析,故此假說(shuō)尚待進(jìn)一步驗(yàn)證。而人群研究的結(jié)果同樣也顯示醋酸甲羥孕酮能夠增加人感染沙眼衣原體的風(fēng)險(xiǎn)[9]。

醋酸甲羥孕酮感染組接種沙眼衣原體后第4天小鼠陰道腔出現(xiàn)大量的炎癥分泌物,組織輕度水腫疏松,黏膜下層少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),而陰道沖洗液的細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果基本為陽(yáng)性,但在接種后第7天小鼠陰道炎性分泌物明顯減少,而陰道沖洗液的細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果基本為陰性,沖洗液細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果與病理切片觀察結(jié)果之間具有較好的相關(guān)性,均提示沙眼衣原體感染為急性感染[10],主要表現(xiàn)為陰道炎,而子宮和子宮頸沒有嚴(yán)重的炎癥改變,且在解剖時(shí)未發(fā)現(xiàn)卵巢有所改變,因此未對(duì)小鼠的卵巢進(jìn)行進(jìn)一步作病理分析。未經(jīng)處理小鼠的動(dòng)情后期及動(dòng)情間期也會(huì)有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),因此研究者在進(jìn)行沙眼衣原體動(dòng)物模型建立時(shí)需要考慮到動(dòng)情周期對(duì)病理表現(xiàn)的影響。我們觀察各時(shí)間點(diǎn)各小鼠的大體改變時(shí)未發(fā)現(xiàn)以往研究中所出現(xiàn)的特殊表現(xiàn)如,小鼠外陰紅腫,毛發(fā)脫落、灰暗無(wú)光澤等[3,11],可能尚須進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

復(fù)方庚酸炔諾酮作為健康育齡婦女的避孕藥[12],主要含有庚酸炔諾酮和戊酸雌二醇[13],為雌激素及孕激素類避孕藥,系通過抑制垂體促性腺激素分泌而抑制排卵,達(dá)到避孕作用。本研究所用的復(fù)方庚酸炔諾酮含庚酸炔諾酮50 mg、戊酸雌二醇5 mg,避孕有效率達(dá) 99.8%[14]。雖然其中的炔諾酮是孕激素,但是由于雌激素的存在,小鼠的動(dòng)情周期沒有出現(xiàn)孕激素影響的主要病理表現(xiàn),復(fù)方激素對(duì)小鼠感染沙眼衣原體的敏感性沒有改變。這也從另一個(gè)側(cè)面驗(yàn)證了小鼠動(dòng)情間期生殖道上皮改變對(duì)增加小鼠對(duì)沙眼衣原體感染敏感性的重要性。

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Effects of medroxyprogesterone acetate and compound norethisterone enanthate on the susceptibility of BABL/c mice to lower reproductive tract infection with

Chlamydia trachomatisHan Yan,Zheng Bingjie,Yin Yueping,Zhong Mingying,Yu Ruixing.Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College;National Center for Sexually Transmitted Disease Control,China Center for Disease Control and Prevention,Nanjing 210042,China

ObjectiveTo compare the effects of medroxyprogesterone acetate (MPA)and compound norethisterone enanthate (CNE)on the susceptibility of BABL/c mice to lower reproductive tract infection withchlamydia trachomatis(Ct).MethodsA total of 60 BALB/c mice were randomly and equally divided into 6 groups:MPA-pretreated control group and CNE-pretreated control group inoculated with MyCoy cell suspensions in the vagina on the 5th day after single treatment with MPA and CNE respectively,blank control group receiving no treatment,MPA-pretreated infected group and CNE-pretreated infected group inoculated with 1 × 107inclusion-forming units(IFU)of Ct serovar E in the vagina on the 5th day after single treatment with MPA and CNE respectively,control infected group inoculated with the same quantity of IFU of Ct serovar E in the vagina but receiving no pretreatment.On day 4,7 and 14 after inoculation,vaginal irrigation fluid was obtained from all the mice for cell culture of Ct.Three mice were randomly selected from each of these groups at the above three time points and sacrificed,and vaginal and uterine tissue specimens were obtained for hematoxylin-eosin(HE)staining and microscopic examination.Chi-square test and Fisher's exact test were conducted to compare infection rate among different groups.ResultsNo growth of Ct was observed in the three control groups at the above time points.The culture-positive rate of Ct was 1/10 on day 4 but 0 on day 7 and 14 in boththe CNE-pretreated infected group and control infected group,7/10 on day 4,2/7 on day 7 but 0 on day 14 in the MPA-pretreated infected group.Fisher's exact test revealed that the culture-positive rate of Ct was significantly higher in the MPA-pretreated infected group than in the control infected group and CNE-pretreated infected group on day 4(bothP=0.03),but similar among the three infected groups on day 7 (P=0.23).Both the MPA-pretreated control group and infected group showed an increase in endovaginal mucus,thinning of vaginal stratified squamous epithelium,mucification of vaginal epithelium,presence of secretions in vaginal lumen and submucosal infiltration of a few inflammatory cells on day 4,7 and 14,as well as appearance of pathological changes(including the presence of large quantities of purulent secretions in lumen,mild tissue edema and submucosal infiltration of a few inflammatory cells)in the vagina on day 4.Vaginal tissues were normal in both the CNE-pretreated infected group and control group at the above three time points,but mild tissue edema,lumen expansion,secretion retention and infiltration of scattered inflammatory cells were observed in the uterus on day 4 after inoculation.Conclusions MPA can arrest the estrous cycle of mice at diestrus with the mucification of vaginal epithelium,which may increase the susceptibility to Ct vaginal infection in mice.In contrast,CNE has no obvious effect on the estrous cycle and susceptibility to Ct vaginal infection despite of the appearance of pathological changes in the uterus.

Medroxyprogesterone acetate;Norethindrone;Chlamydia trachomatis;Disease models,animal;Mice;Reproductive tract infections

Yin Yueping,Email:yinyp@ncstdlc.org

作者單位:210042南京,中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院皮膚病研究所,中國(guó)疾病預(yù)防控制中心性病控制中心

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.05.005

國(guó)家十二五“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)課題(2012ZX09301002005);協(xié)和青年基金(33320140135)

尹躍平,Email:yinyp@ncstdlc.org

2014-04-24)

(本文編輯:尚淑賢)

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