劉雙全 劉瓊

梅毒螺旋體Tp0844重組蛋白的表達(dá)、純化及免疫反應(yīng)性研究

劉雙全 劉瓊

目的 克隆、表達(dá)梅毒螺旋體重組蛋白Tp0844，純化表達(dá)產(chǎn)物并進(jìn)行免疫反應(yīng)性分析，篩選與宿主具有高反應(yīng)性的Tp主要蛋白。方法 通過生物信息學(xué)分析，獲取Tp0844基因序列，構(gòu)建原核載體進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；Ni-NTA親合層析柱純化重組蛋白，Western印跡法檢測其重組蛋白與梅毒陰陽性血清的反應(yīng)情況。結(jié)果 成功構(gòu)建PET-30a（+）-Tp0844原核表達(dá)重組體，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后發(fā)現(xiàn)該重組體可高表達(dá)出可溶性的重組蛋白，經(jīng)親和層析純化后獲得了相對分子質(zhì)量為43 000的重組蛋白；以梅毒IgG抗體陰、陽性血清為一抗，采用Western印跡法檢測發(fā)現(xiàn)，Tp0844重組蛋白與梅毒陽性血清能發(fā)生明顯特異反應(yīng)，而與健康陰性血清未出現(xiàn)反應(yīng)條帶。結(jié)論 可溶性重組表達(dá)的Tp0844蛋白具有較好的免疫反應(yīng)性，可作為梅毒發(fā)病機(jī)制研究的候選抗原。

蒼白密螺旋體；重組蛋白質(zhì)類；TP0844；免疫學(xué)；免疫反應(yīng)性

梅毒是由梅毒螺旋體（Treponema Pallidun，Tp）感染引起的危害人類健康的性傳播疾?。?］。其不僅可嚴(yán)重?fù)p害人體的多個器官，還可由母體經(jīng)胎盤垂直傳播給胎兒，引起早產(chǎn)、流產(chǎn)、死胎和畸胎或胎傳梅毒，嚴(yán)重影響出生人口質(zhì)量［2］。如何有效控制和預(yù)防梅毒，已成為普遍關(guān)注的公共衛(wèi)生問題，而進(jìn)行梅毒早期診斷方法研究以及闡明Tp的發(fā)病機(jī)制是控制本病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。由于Tp不能體外連續(xù)人工培養(yǎng)，對于其發(fā)病機(jī)制研究進(jìn)展緩慢。近年來，基因序列分析發(fā)現(xiàn)，Tp缺乏明顯的毒力因子編碼基因，包括革蘭陰性細(xì)菌常見的內(nèi)毒素（脂多糖）、Ⅲ型分泌系統(tǒng)、熱休克蛋白等細(xì)胞毒因子的編碼基因［2-5］。因而，篩選與宿主具有高反應(yīng)性的Tp主要蛋白或膜蛋白等致病因素是進(jìn)行Tp發(fā)病機(jī)制研究的關(guān)鍵。本研究經(jīng)篩選、克隆表達(dá)、鑒定Tp0844重組蛋白并進(jìn)行免疫反應(yīng)性的研究，現(xiàn)報告如下。

資料與方法

一、主要試劑和材料

1.菌株與載體：Tp Nichols標(biāo)準(zhǔn)株、PET-30a（+）質(zhì)粒、表達(dá)宿主菌E.coliBL-21均為本室保存。

2.主要試劑：蛋白相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，限制性內(nèi)切酶、T4連接酶、DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒，辣根過氧化酶標(biāo)羊抗人IgG，Taq PCR mix，Ni-NTA親和層析柱均購于德國Qiagen公司，梅毒陽性血清標(biāo)本為經(jīng)梅毒螺旋體明膠凝集試驗（TPPA）確證梅毒患者血清；梅毒陰性標(biāo)本為健康體檢中心健康對照血清，用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）和Trust初篩陰性標(biāo)本。

作者單位：421001湖南衡陽，南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗科

3.主要儀器：德國Biometra公司生產(chǎn)梯度PCR儀；美國Beckman公司生產(chǎn)DU640核酸蛋白定量分析儀。

二、方法

1.Tp基因組DNA的提?。喝p Nichol株感染新西蘭兔睪丸組織析出物于滅菌試管中，于水浴搖床150×g振蕩3 h，滅菌紗布過濾，取濾出物制備Tp DNA模板，操作按照Qiagen全基因組提取試劑盒說明進(jìn)行。

2.Tp0844基因的擴(kuò)增：從基因庫中查詢Tp0844基因序列，軟件分析選去除信號肽序列，設(shè)計1對PCR擴(kuò)增引物：P1（BamHⅠ酶切位點）：5′-GGATCCATGAGAGTTGCAATCAAT-3′，P2（EcoRⅠ酶切位點）5′-GAATTCCTACCGCTTCTGCGAGAT-3′，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。以Tp Nichols株的基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增Tp0884基因，94℃預(yù)變性 3 min；94℃變性 30 s，46℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30個循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后再72℃終延伸5 min。取PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳，在紫外燈下觀察結(jié)果。

3.Tp0844重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定：通過BamH和EcoRI酶切位點將Tp0844基因克隆進(jìn)pET-30a（+）質(zhì)粒中構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-30a（+）/Tp0844，篩選陽性質(zhì)粒，作酶切鑒定和PCR鑒定，初步鑒定的陽性質(zhì)粒送上海市英濰捷基公司測序。經(jīng)測序鑒定的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主菌E.coliBL21中構(gòu)建重組表達(dá)體。

4.Tp0844基因的誘導(dǎo)表達(dá)：挑選單個陽性菌落37℃培養(yǎng)過夜，次日取培養(yǎng)物1∶50接種繼續(xù)培養(yǎng)至菌體A600=0.6時，加入IPTG（終濃度1.0 mmol/L）37℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h，同時設(shè)未誘導(dǎo)組及陰性對照組。離心收集菌體，用超聲波破碎菌體后離心收集沉淀與上清，SDS-PAGE電泳分析表達(dá)結(jié)果。

5.Tp0844重組蛋白的純化：大量誘導(dǎo)表達(dá)重組菌，收集菌體，用緩沖液PBS浮菌并加入適量的溶菌酶作用，超聲波破碎菌體，離心收集上清上Qiagen Ni-NTA親和層析柱純化，具體操作見說明書。純化產(chǎn)物作SDS-PAGE分析。

6.Western印跡分析重組蛋白的免疫反應(yīng)性：以1∶100稀釋的經(jīng)TPPA法確證的梅毒陽性或健康血清（陰性對照）為一抗，二抗為辣根過氧化酶標(biāo)山羊抗人IgG（1∶10 000稀釋），利用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（enhanced chemiluminescent detection，ECL）顯色，暗室曝光顯影，檢測特異性條帶。

結(jié) 果

1.Tp0844基因的克隆與鑒定：PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳，在約1 000 bp位置可見一明顯特異性條帶，片段大小與預(yù)期一致（圖1）。切膠回收PCR產(chǎn)物，并連接 PET-30a（+）載體，酶切鑒定（圖 2），可見兩株克隆菌均正確，經(jīng)測序鑒定證明插入片段為Tp0844目的基因，序列測定結(jié)果與基因庫上發(fā)表的序列完全一致。

2.重組蛋白的誘導(dǎo)、表達(dá)與純化：將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coliBL21表達(dá)宿主菌，挑選陽性重組菌進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)在相對分子質(zhì)量為43 000處有一明顯蛋白條帶，與預(yù)期的相對分子質(zhì)量大小相符（圖3，4），IPTG濃度在1 mmol/L誘導(dǎo)時間為6 h時蛋白表達(dá)量最大，并且發(fā)現(xiàn)表達(dá)蛋白主要存在于上清中。

圖1 Tp0844基因PCR擴(kuò)增結(jié)果 M：標(biāo)準(zhǔn)參照物；1：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；2：陰性對照

圖2 重組質(zhì)粒pET-30a（+）/Tp0844雙酶切電泳M：標(biāo)準(zhǔn)參照物；1：pET30a（+）空質(zhì)粒；2：Tp0844重組質(zhì)粒1雙酶切；3：Tp0844重組質(zhì)粒；4：Tp0844重組質(zhì)粒2雙酶切；5：Tp0844重組質(zhì)粒2

圖3 37℃重組質(zhì)粒在大腸桿菌中1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)不同時間表達(dá)的SDS-PAGE結(jié)果 M:標(biāo)準(zhǔn)參照物；1：rTp0844誘導(dǎo)6 h上清；2：rTp0844誘導(dǎo)4 h上清；3：rTp0844誘導(dǎo)2 h上清；4：rTp0844誘導(dǎo)6 h沉淀；5：rTp0844誘導(dǎo)2 h沉淀；6：rTp0844誘導(dǎo)4 h沉淀；7：rTp0844未誘導(dǎo)

圖4 重組TP0844蛋白純化結(jié)果 M：標(biāo)準(zhǔn)參照物；2：裂解上清；3～8：洗滌液過柱流出物；9：蛋白洗脫液（目的蛋白）

圖5 TP0844重組蛋白的Western印跡檢測 1：Tp陽性血清；2：健康陰性血清

3.重組Tp0844蛋白的免疫反應(yīng)性檢測：以梅毒IgG抗體陰、陽性血清為一抗，采用Western印跡方法檢測Tp0844重組蛋白的免疫反應(yīng)性。結(jié)果顯示，誘導(dǎo)產(chǎn)物與Tp陽性血清在預(yù)計位置出現(xiàn)明顯特異反應(yīng)條帶，而與陰性血清未出現(xiàn)反應(yīng)條帶（圖 5）。

討 論

近年來，全世界每年新增約1 500萬新感染病例［1-2，6-11］，近 3 年全球梅毒的發(fā)病率年均增長率達(dá)20%，我國的梅毒感染率和發(fā)病率也呈上升趨勢，成為一個備受關(guān)注的公共衛(wèi)生問題［1-2，6-11］。尋找 Tp的致病因素、闡明Tp發(fā)病機(jī)制是控制梅毒的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。由于Tp不能體外連續(xù)人工培養(yǎng)，缺乏遺傳操作系統(tǒng)及外膜的易脆性導(dǎo)致對其不能進(jìn)行遺傳操作，嚴(yán)重阻礙了從分子水平對Tp發(fā)病機(jī)制的研究。Tp全基因序列的解析極大地促進(jìn)了對Tp基因結(jié)構(gòu)與功能的研究［2］。隨著基因工程技術(shù)的迅速發(fā)展，使得梅毒Tp重組蛋白的獲得相對容易,一方面為建立現(xiàn)有梅毒血清學(xué)診斷的替代方法提供了條件，同時為梅毒免疫功能及發(fā)病機(jī)制研究開辟了一條新的途徑。

作為有望在梅毒致病過程中發(fā)揮重要作用的蛋白一般需要滿足兩個條件：首先，必須能早期接觸機(jī)體，在感染早期即能在血液里檢測到其相應(yīng)的抗體；其次要求蛋白含量較高、免疫原性強(qiáng)［3-5，11］。進(jìn)行Tp發(fā)表機(jī)制的研究首先須從篩選蛋白入手。Tp0844基因全長1 050 bp，編碼350個氨基酸、相對分子質(zhì)量約為43 000，在Tp的細(xì)胞定位尚不清楚，其生物學(xué)功能也尚未明了，且整個分子的抗原性較強(qiáng)，存在多個強(qiáng)抗原表位，可以作為梅毒發(fā)表機(jī)制研究的候選抗原。本研究的目的是通過克隆、表達(dá)獲得重組Tp0844蛋白進(jìn)行免疫反應(yīng)性的研究。本文結(jié)果顯示，成功獲得高純度、可溶性表達(dá)的重組蛋白Tp0844重組蛋白；進(jìn)一步檢測純化的重組蛋白的免疫反應(yīng)性，經(jīng)Western印跡分析，其能與梅毒感染陽性血清發(fā)生反應(yīng)，而與梅毒陰性血清未發(fā)生反應(yīng)，證明Tp0844重組蛋白具有良好的免疫反應(yīng)性，從而為下一步研究其在梅毒發(fā)病中的作用，如黏附、穿透、播散及誘導(dǎo)宿主炎癥反應(yīng)作用，完整解析Tp0844的生物學(xué)功能及進(jìn)行梅毒早期診斷方法學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。

［1］FraserCM,NorrisSJ,WeinstockGM,etal.Completegenomesequence ofTreponema pallidum,the syphilis spirochete［J］.Science,1998,281（5375）:375-388.

［2］Peeling RW,Hook EW 3rd.The pathogenesis of syphilis:the Great Mimicker,revisited［J］.J Pathol,2006,208（2）:224-232.

［3］劉雙全,汪世平,肖勇健,等.梅毒螺旋體Tp0319重組蛋白的表達(dá)及免疫活性研究［J］.中華皮膚科學(xué)雜志,2010,43（5）:332-335.

［4］余堅,趙飛駿,張曉紅,等.白介素2與梅毒螺旋體膜蛋白Gpd雙價核酸疫苗的免疫活性及保護(hù)作用研究［J］.中華皮膚科學(xué)雜志,2011,44（10）:688-692.

［5］劉瓊,劉雙全,張秋桂.梅毒螺旋體膜蛋白研究進(jìn)展［J］.微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展,2013,41（5）:56-59.

［6］Lafond RE,Lukehart SA.Biological basis for syphilis［J］.Clin Microbiol Rev,2006,19（1）:29-49.

［7］Lee V,Kinghorn G.Syphilis:an update［J］.Clin Med,2008,8（3）:330-333.

［8］Liu S,Wang S,Wu Y,et al.Production of proinflammatory cytokines in the human THP-1 monocyte cell line following induction by Tp0751,a recombinant protein ofTreponema pallidum［J］.Sci China Life Sci,2010,53（2）:229-233.

［9］Houston S,Hof R,Francescutti T,et al.Bifunctional role of theTreponema pallidumextracellular matrix binding adhesin Tp0751［J］.Infect Immun,2011,79（3）:1386-1398.

［10］McGill MA,Edmondson DG,Carroll JA,et al.Characterization and serologic analysis of theTreponema pallidumproteome［J］.Infect Immun,2010,78（6）:2631-2643.

［11］謝小平,劉雙全,張秋桂.梅毒螺旋體TP0993重組蛋白的表達(dá)、純化及免疫活性分析［J］.中華皮膚科學(xué)雜志,2013,46（5）:305-308.

Expression,purification and evaluation of immunoreactivity of the recombinant protein Tp0844 ofTreponema pallidum

Liu Shuangquan,Liu Qiong.Department of Clinical Laboratory,First Affiliated Hospital,University of South China,Hengyang 421001,Hunan,China

Treponema pallidum;Recombinant proteins;TP0844;Immunology;Immunoreactivity

Liu Shuangquan,Email:dantelliu@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.05.007

國家自然科學(xué)基金（81201331）；湖南省自然科學(xué)基金（11JJ4076）；湖南省教育廳青年基金（11B107）

劉雙全，Email：dantelliu@163.com

2014-05-13）

（本文編輯：吳曉初）

【Absrtact】ObjectiveTo clone,express,purify and evaluate the immunoreactivity of the recombinant protein Tp0844 ofTreponema pallidum（Tp）,and to screen major Tp proteins with high host reactivity.MethodsThe Tp0844 gene sequence was obtained through bioinformatics analysis.A prokaryotic expression vector of the Tp0844 gene was constructed and transformed intoE.coliBL21 followed by isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside （IPTG）induction for the expression of the recombinant protein Tp0844.Nickel-NTA affinity chromatography columns were utilized to purify the recombinant protein,and Western blotting was performed to evaluate the reactivity of the recombinant protein with sera positive or negative for anti-Tp IgG antibodies.ResultsThe recombinant prokaryotic expression vector PET-30a（+）-Tp0844 was successfully constructed.After IPTG induction,a soluble recombinant protein with a relative molecular mass of about 43 000 was highly expressed,and purified by affinity chromatography.Western blotting showed that the Tp0844 recombinant protein specifically reacted with anti-Tp IgG antibody-positive sera,but not with anti-Tp IgG antibody-negative sera.Conclusions The soluble recombinant protein Tp0844 has good immunoreactivity,and can serve as a candidate antigen for investigation into the pathogenesis of syphilis.