王嬌 黃熙

氨基酮戊酸光動力療法對鮮紅斑痣動物模型雞冠的影響

王嬌 黃熙

目的 探討外用氨基酮戊酸光動力療法（ALA-PDT）對鮮紅斑痣（PWS）動物模型雞冠的作用和治療鮮紅斑痣的可行性。方法 80只萊亨雞隨機分為10組：空白對照組、單純ALA組、單純激光75 J/cm2組、100 J/cm2組、150 J/cm2、200 J/cm2組，ALA-PDT 75 J/cm2組、100 J/cm2組、150 J/cm2組、200 J/cm2組。單純激光組僅給予630 nm紅光照射，ALA-PDT組外用ALA后給予紅光照射。干預(yù)14 d、28 d分別取材，觀察雞冠形態(tài)學、組織學變化，計算毛細血管減少率和血管內(nèi)皮細胞凋亡情況。結(jié)果 外用ALA-PDT 75 J/cm2、100 J/cm2、150 J/cm2和200 J/cm2組雞冠實驗區(qū)域顏色變淡，光鏡下真皮毛細血管數(shù)目減少、管徑變小，部分血管內(nèi)皮細胞凋亡；毛細血管減少率分別為33.53%±4.89%、52.02%±2.77%、67.48%±5.58%、88.96%±2.47%；凋亡指數(shù)分別為：63.44±1.09、88.50±6.11、94.32± 3.67、113.76±10.57，與其余各組分別比較，均P<0.01；血管內(nèi)皮細胞凋亡深度分別為：201.19 μm ± 0.33 μm、266.15 μm ± 1.02 μm、546.09 μm ± 2.45 μm、766.37 μm ± 1.08 μm，各組間兩兩比較，均P<0.01。結(jié)論 外用ALA-PDT對雞冠毛細血管有明顯損傷，損傷程度和深度與紅光能量密度相關(guān)；誘導血管內(nèi)皮細胞凋亡可能是其治療機制之一。

葡萄酒色痣；氨基酮戊酸；光化學療法；細胞凋亡；模型，動物；雞冠

作者單位：541001廣西，桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院皮膚科

光動力療法（PDT）已作為多種組織特異性疾病如皮膚腫瘤的微創(chuàng)治療方法［1］。近期有學者嘗試運用 PDT 治療鮮紅斑痣（port wine stains，PWS），獲得初步療效［2］；其選擇的光敏劑均為靜脈途徑給藥，存在體內(nèi)代謝較慢、易繼發(fā)光敏反應(yīng)、臨床應(yīng)用受限制的缺點。如何改進PDT在PWS的臨床應(yīng)用受到關(guān)注。氨基酮戊酸（ALA）是轉(zhuǎn)化率高、避光時間短、體內(nèi)沉積少、不良反應(yīng)輕的第二代光敏劑［3］。有研究［4］證實，外用ALA-PDT可以損傷腫瘤血管，同時對正常毛細血管也有作用。根據(jù)這一原理，我們推測它可能適用于PWS的治療。本實驗以雞冠為動物模型，通過觀察ALA-PDT干預(yù)后雞冠形態(tài)學、組織學變化、血管數(shù)變化以及血管內(nèi)皮細胞凋亡情況，探討ALA-PDT對雞冠毛細血管的損傷作用及可能機制，為ALA-PDT臨床治療PWS提供實驗依據(jù)。

材料與方法

一、主要試劑及儀器

氨基酮戊酸散（規(guī)格118 mg，批號110801，復旦張江生物制藥有限公司），-20℃避光保存；PDT激光治療儀（武漢亞格光電醫(yī)療器械有限公司），波長632 nm±3 nm，輸出功率0～500 mW；TUNEL系列細胞凋亡測試試劑盒（美國Roche公司，POD；Cat.No.1168481 7910）；Olympus BXDX光學顯微鏡和照相系統(tǒng)（日本Olympus公司）。

二、動物分組

6月齡萊亨雞（動物合格證號4104035）80只，體重1.7～2.5kg，雞冠色澤紅潤、顏色均勻、無潰瘍壞死。將實驗動物隨機分為10組：空白對照組、單純ALA組、單純激光 75 J/cm2組、100 J/cm2組、150 J/cm2、200 J/cm2組，ALA-PDT 75 J/cm2組、100 J/cm2組、150 J/cm2組、200 J/cm2組，每組8只。雞冠一側(cè)用龍膽紫標記1 cm×1 cm的區(qū)域為實驗區(qū)域，對側(cè)為自身對照?？瞻讓φ战M不做任何處理；單純ALA組：用滅菌注射用水將ALA稀釋成20%新鮮溶液，在實驗區(qū)域放置等體積滅菌紗布兩層，將溶液滴于紗布上，塑料薄膜封包，用錫皮紙包扎后避光放置，2 h后重復滴加1次，持續(xù)敷藥時間不少于3 h；單純激光組：分別以能量密度 75、100、150、200 J/cm2紅光照射實驗區(qū)域，光斑直徑1 cm，持續(xù)時間20 min，根據(jù)公式（照射功率=能量密度×照射面積/照射時間）計算輸出功率；ALA-PDT組：同單純ALA組局部外用ALA 后分別以能量密度 75、100、150、200 J/cm2紅光照射實驗區(qū)域。干預(yù)后實驗動物相同條件下避光飼養(yǎng)24 h。

三、檢測指標

1.一般情況：干預(yù)前肉眼觀察雞冠的形態(tài)學情況，照像以備比較；Wood燈暗視野下觀察雞冠熒光現(xiàn)象（單純ALA組、ALA-PDT組去除包扎物后觀察），熒光現(xiàn)象可反映ALA富集情況。干預(yù)即刻、7、14、28 d肉眼觀察各組動物及實驗區(qū)域一般情況和形態(tài)變化。

2.HE染色：干預(yù)14、28 d用微型環(huán)鉆分別鉆取各組全層雞冠組織，以實驗側(cè)的對側(cè)為自身對照。組織塊4%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，取部分切片行常規(guī)染色觀察。每張切片隨機選取5個高倍視野（10×400），計算毛細血管平均數(shù)，根據(jù)公式計算毛細血管減少率：毛細血管減少率=（對照側(cè)毛細血管平均數(shù)－實驗側(cè)毛細血管平均數(shù)）/對照側(cè)毛細血管平均數(shù)×100%。

3.TUNEL法檢測：取部分剩余切片，根據(jù)TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒說明染色，觀察血管內(nèi)皮細胞凋亡情況。凋亡細胞胞核呈紅染，凋亡小體呈較小的紅色圓形小體。每張切片隨機取5個高倍視野（10×400），每個視野計數(shù)200個細胞，總計1 000個，根據(jù)公式計算凋亡指數(shù)（apoptosis index，AI）：AI= 凋亡細胞數(shù)/1 000。隨機選取 5 個點測量皮膚基底層至明顯凋亡最深處的垂直距離，取其平均值，即為該組明顯凋亡深度值。

四、統(tǒng)計學分析

結(jié) 果

一、Wood燈觀察一般情況

Wood燈觀察，空白對照組和單純激光組實驗區(qū)域無熒光現(xiàn)象，單純ALA組和ALA-PDT組實驗區(qū)域可見明亮磚紅色熒光，判斷為ALA經(jīng)皮吸收后代謝為原卟啉IX（PpIX）所致，實驗區(qū)域以外部分和對側(cè)未見熒光現(xiàn)象。見圖1，2。

二、肉眼觀察

觀察期內(nèi)實驗動物一般情況良好，無動物死亡。干預(yù)前后及觀察期內(nèi)，肉眼觀察空白對照組、單純ALA組、單純激光組雞冠外形及色澤無明顯變化，僅單純激光200 J/cm2組干預(yù)16～20 min實驗區(qū)域輕微腫脹、色澤略變暗，停止干預(yù)1～3 min均恢復正常。外用ALA-PDT組實驗區(qū)域干預(yù)后均出現(xiàn)明顯的紅白相間。ALA-PDT 75 J/cm2組8例、100 J/cm2組6例干預(yù)即刻實驗區(qū)域輕微水腫、顏色加深，停止干預(yù)30min變成深紅色；7、14、28d實驗區(qū)域均為正常鮮紅色，為輕度反應(yīng)。ALA-PDT100J/cm2組2例、ALA-PDT150J/cm2組7例干預(yù)即刻實驗區(qū)域明顯腫脹、出現(xiàn)以白色為主的白紫色變化，停止干預(yù)10 min左右變成紫紅色；7、14 d實驗區(qū)域白紫色、無破潰結(jié)痂，28 d恢復正常鮮紅色，為中度反應(yīng)。ALA-PDT150J/cm2組1例、ALA-PDT200J/cm2組8例干預(yù)即刻實驗區(qū)域明顯腫脹、出現(xiàn)灰白斑、部分表皮壞死，停止干預(yù)20 min左右變成暗紫紅色；7 d創(chuàng)面結(jié)薄層黑痂，14 d痂皮脫落、創(chuàng)面愈合，28 d恢復正常顏色。各組均無瘢痕形成。

圖1 Wood燈下，單純ALA組和ALA-PDT組實驗區(qū)域可見雞冠ALA富集區(qū)域呈磚紅色熒光現(xiàn)象（箭頭）

圖2 Wood燈下，空白對照組和單純激光組實驗區(qū)域 圖中ALA-PDT組非實驗區(qū)域為無熒光現(xiàn)象，中下部小塊半圓形熒光為該組實驗區(qū)域

圖3 各組雞冠組織光鏡表現(xiàn)（HE×400） 3A～3C：分別為正常對照組、單純ALA組、單純激光組：表皮正常，乳頭層大量擴張毛細血管，腔內(nèi)充滿紅細胞；3D：ALAPDT 75 J/cm2組干預(yù)14 d表皮極輕微增生，乳頭層血管數(shù)量略減少、管徑略縮??；3E：ALA-PDT組100 J/cm2組干預(yù)14 d表皮輕微增生，乳頭層血管明顯減少、部分閉鎖；3F：ALA-PDT 150 J/cm2組干預(yù)14 d表皮細胞明顯增生，乳頭層血管數(shù)量明顯減少、大部分閉鎖；3G：ALA-PDT組200 J/cm2干預(yù)14 d表皮細胞變性、灶性壞死，乳頭層毛細血管大量減少，潰瘍、水腫，嚴重凝固性壞死；3H～3K：ALA-PDT 75 J/cm2組、100 J/cm2、150 J/cm2、200 J/cm2組干預(yù)28 d表皮細胞增生，乳頭層毛細血管減少

三、HE染色

干預(yù)14、28 d，空白對照組、單純ALA組、單純激光組與自身對照比較，組織學表現(xiàn)無明顯變化，光鏡下可見實驗區(qū)域表皮正常，真皮乳頭層可見大量擴張的毛細血管、腔內(nèi)充滿紅細胞，血管內(nèi)皮細胞完整，內(nèi)皮下有不連續(xù)的平滑肌層。ALA-PDT 75 J/cm2組 8例、100 J/cm2組 8例、150 J/cm2組 6例干預(yù)14 d實驗區(qū)域表皮細胞增生、水腫，乳頭層毛細血管減少、管腔內(nèi)紅細胞減少；干預(yù)28 d實驗區(qū)域表皮細胞增生，乳頭層部分血管閉鎖，新生毛細血管生成，為中度反應(yīng)。ALA-PDT 150 J/cm2組2例、200 J/cm2組8例干預(yù)14 d實驗區(qū)域表皮細胞灶性缺失伴明顯增生，乳頭層毛細血管大量減少，潰瘍、水腫，嚴重凝固性壞死；干預(yù)28 d表皮細胞明顯增生，乳頭層大量血管閉鎖，偶見新生毛細血管，為重度反應(yīng)。見圖3。

四、毛細血管減少率

與空白對照組比較，單純ALA組、單純激光組毛細血管減少率均P>0.05，說明單純ALA和單純激光照射無治療作用。ALA-PDT組較空白對照組毛細血管減少率相比，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），說明外用ALA并紅光照射有治療作用。4種不同能量密度ALA-PDT組之間比，均P<0.01，說明其作用強度與能量密度呈正相關(guān)。見表1。

表1 雞冠干預(yù)14 d、28 d各組毛細血管減少率（%，±s）

表1 雞冠干預(yù)14 d、28 d各組毛細血管減少率（%，±s）

注：n=8。a：各組與空白對照組比較P<0.01；b：各組與單純ALA組比較P<0.01；c：ALA-PDT組與相同能量密度的單純激光組比較P<0.01；d：ALA-PDT 75 J/cm2組與ALA-PDT其他組比較P<0.01；e：ALA-PDT 100 J/cm2組與 ALA-PDT 其他組比較 P<0.01；f：ALA-PDT 150 J/cm2組與 ALA-PDT 其他組比較 P<0.01；g：ALAPDT 200 J/cm2組與ALA-PDT其他組比較P<0.01

組別 14 d 28 d空白對照組 1.48±1.04 1.00±2.34單純ALA組 0.74±0.41 1.74±0.25單純激光75 J/cm2組 0.91±0.64c 2.01±1.56 100 J/cm2組 1.12±1.77c 0.33±1.09 150 J/cm2組 0.38±1.96c 0.00±0.34 200 J/cm2組 0.00±1.44c 0.08±0.34 ALA-PDT 75 J/cm2組 33.53±4.89abefg 29.45±3.27 100 J/cm2組 52.02±2.77abdfg 53.89±1.76 150 J/cm2組 67.48±5.58abdeg 58.64±3.42ab 200 J/cm2組 88.96±2.47abdef 91.32±1.68ab

五、TUNEL法檢測血管內(nèi)皮細胞凋亡

干預(yù)14 d，空白對照組、單純ALA組、單純激光組鏡下偶見血管內(nèi)皮細胞凋亡，其凋亡指數(shù)（AI）兩兩比較差異均P>0.05。ALA-PDT組血管內(nèi)皮細胞凋亡與自身對照及其他組相比顯著增加，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；隨能量密度增加AI增大，各組之間兩兩比較均P<0.01。見表2。

表2 干預(yù)14 d各組血管內(nèi)皮細胞凋亡指數(shù)（±s）

表2 干預(yù)14 d各組血管內(nèi)皮細胞凋亡指數(shù)（±s）

注：n=8。a：各組與空白對照組比較P<0.01；b：各組與單純ALA組比較P<0.01；c：ALA-PDT組與相同能量密度的單純激光組比較P<0.01；d：ALA-PDT 75 J/cm2組與 ALA-PDT 其他組比較 P<0.01；e：ALA-PDT 100 J/cm2組與 ALA-PDT 其他組比較 P<0.01；f：ALAPDT 150 J/cm2組與 ALA-PDT 其他組比較 P<0.01；g：ALA-PDT 200 J/cm2組與ALA-PDT其他組比較P<0.01

組別 凋亡指數(shù)空白對照組 1.05±0.76單純ALA組 1.38±0.52單純激光75 J/cm2組 1.21±0.35c 100J/cm2組 1.37±0.98c 150 J/cm2組 1.24±1.78c 200 J/cm2組 1.22±0.47c ALA-PDT 75 J/cm2組 63.44±1.09abefg 100 J/cm2組 88.50±6.11abdfg 150 J/cm2組 94.32±3.67abdeg 200 J/cm2組 113.76±10.57abdef

六、血管內(nèi)皮細胞明顯凋亡深度

干預(yù) 14 d，ALA-PDT各組血管內(nèi)皮細胞明顯凋亡深度分別為 （201.19± 0.33）μm、（266.15±1.02）μm、（546.09±2.45）μm、（766.37±1.08）μm，兩兩比較，均P<0.01。見圖4。

圖4 ALA-PDT組干預(yù)14 d血管內(nèi)皮細胞明顯凋亡深度（×100） 4A：ALA-PDT 150 J/cm2組血管內(nèi)皮細胞明顯凋亡深度606.09 μm；4B：ALA-PDT 200 J/cm2組血管內(nèi)皮細胞明顯凋亡深度820.10 μm

討 論

雞冠真皮乳頭層豐富的毛細血管網(wǎng)與PWS的組織病理學表現(xiàn)極其相似［5］，雞與人血液光吸收特性基本相同［6］。因此，雞冠一般作為PWS的實驗動物模型。PDT療法具有靶組織選擇特異性，光敏劑可被靶組織選擇性富集，在適當波長、能量密度光波的局部照射以及組織氧的相互作用下產(chǎn)生活性氧物質(zhì)，活性氧物質(zhì)主要通過誘導靶組織的直接壞死和細胞凋亡來達到治療目的［1］。PDT的療效取決于光敏劑和光源。近年來，內(nèi)源性光敏劑如血卟啉、癌光啉、血卟啉甲醚［2，5］等誘導的PDT臨床治療PWS初步取得療效。但這些光敏劑使用后需避光4～8周，光敏反應(yīng)時有發(fā)生，臨床應(yīng)用受到限制。ALA是血紅蛋白合成途徑中天然存在的卟啉前體，在細胞內(nèi)經(jīng)酶催化后轉(zhuǎn)變成原卟啉IX（PpIX），接受一定能量的激發(fā)光源照射發(fā)生光化學反應(yīng)［7］。外用ALA-PDT目前臨床主要用于治療日光性角化?。?］、Bowen 病、尖銳濕疣等皮膚增生性疾?。?］。Reid 等［8］在對外用ALA-PDT治療增生性瘢痕的研究中發(fā)現(xiàn)微血管數(shù)量減少，認為ALA-PDT可對病灶內(nèi)血管產(chǎn)生非熱源性損傷。Chang等［9］進一步研究發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細胞經(jīng)ALA處理后細胞內(nèi)PpIX濃度明顯升高，并經(jīng)適當光照后發(fā)生凋亡。本實驗通過外用ALA結(jié)合能量密度為75～200 J/cm2630 nm紅光對雞冠進行干預(yù)，肉眼觀察發(fā)現(xiàn)，干預(yù)即刻、7、14、28 d實驗區(qū)域表現(xiàn)為白色、白紫色、淺白色、鮮紅色等反應(yīng)；干預(yù)14、28 d組織學見乳頭層毛細血管管徑減小、數(shù)量減少，血管內(nèi)皮細胞減少率為33.53%±4.89%～88.96%±2.47%與單純外用ALA及單純激光照射組比較，毛細血管減少率均有顯著性差異。本研究進一步證實，ALA-PDT對PWS動物模型雞冠的毛細血管有直接損傷效應(yīng)。

本實驗發(fā)現(xiàn)，ALA-PDT對雞冠的損傷程度隨紅光能量密度的增大而增強，不同能量密度組之間血管內(nèi)皮細胞減少率和血管損傷深度的比較差異均有統(tǒng)計學意義，提示ALA-PDT對血管損傷效應(yīng)與光源的能量密度呈正相關(guān)。能量密度不足不能充分激發(fā)光敏劑發(fā)生光化學反應(yīng)，但能量密度過高易造成非靶組織的損傷，外用ALA-PDT在能量密度100～150 J/cm2時能對雞冠產(chǎn)生理想的血管選擇性損傷，合適的能量密度范圍還有待于進一步的摸索。

近來研究發(fā)現(xiàn)PDT還可引起靶細胞凋亡來產(chǎn)生后期治療效應(yīng)［10］。本實驗也發(fā)現(xiàn)雞冠經(jīng)ALA-PDT干預(yù)出現(xiàn)大量血管內(nèi)皮細胞凋亡，與單純外用ALA組和單純激光照射組比較，差異有統(tǒng)計學意義，并且隨紅光能量密度增加，ALA-PDT組AI增大、凋亡深度加深。提示血管內(nèi)皮細胞凋亡的發(fā)生是ALAPDT致血管損傷的作用機制之一，且這種作用強度與紅光能量密度正相關(guān)。

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Effects of aminolevulinic acid-based photodynamic therapy on chicken combs,an animal model for port wine stains

Wang Jiao,Huang Xi.Department of Dermatology,Affiliated Hospital of Guilin Medical University,Guilin 541001,Guangxi,China

ObjectiveTo investigate the effects of aminolevulinic acid-based photodynamic therapy（ALAPDT）on chicken combs,an animal model for port wine stains （PWS）,and to explore the feasibility of PWS treatment with ALA-PDT.MethodsA total of 80 leghorns were randomly and equally divided into 10 groups:blank control group receiving no treatment,ALA group treated with ALA alone,four single laser groups irradiated with 630-nm red laser at 75,100,150 and 200 J/cm2respectively,four ALA-PDT groups pretreated with ALA followed by 630-nm red laser radiation at 75,100,150 and 200 J/cm2respectively.An area sized 1 cm×1 cm were marked at one side of combs in all these leghorns,and served as the experiment area to receive corresponding treatment,with that in the other side as the control area.Tissue specimens were obtained on the 14th and 28th days after treatment followed by the observation of morphological and histological changes,calculation of decrement rate in capillary number,and determination of apoptosis index in vascular endothelial cells （VECs）in chicken combs.ResultsIn all the four ALA-PDT groups,the combs became lighter in color with apoptosis of some VECs as well as a decrease in capillary count and diameter in the dermis of the experiment areas.The decrement rate in capillary number was 33.53%±4.89%,52.02%±2.77%,67.48%±5.58%and 88.96%±2.47%respectively,and apoptosis index in VECs was 63.44±1.09,88.50±6.11,94.32±3.67 and 113.76±10.57 respectively,in the 75-,100-,150-and 200-J/cm2ALA-PDT groups on the 14th day after treatment,and both the decrement rate and apoptosis index in each of these groups were significantly different from those in the blank control group,ALA group,single laser groups receiving red laser radiation at the corresponding dose,and the other ALAPDT groups（allP<0.01）separately.The apoptosis depth of VECs,defined as the vertical distance from the basal layer to the deepest level at which VEC apoptosis occurred,was 201.19 ± 0.33 μm,266.15 ± 1.02 μm,546.09 ± 2.45 μm and 766.37 ± 1.08 μm respectively in the 75-,100-,150-and 200-J/cm2ALA-PDT groups on the 14th day,with significant differences between these four groups （allP<0.01）.Conclusions ALA-PDT can markedly damage capillaries in the animal model of port wine stains,chicken combs,with the degree and depth of capillary damage associated with red light energy density.The induction of VEC apoptosis may be an action mechanism of ALA-PDT in the treatment of PWS.

Port-wine stain;Aminolevulinic acid;Photochemotherapy;Apoptosis;Models,animal;Chicken comb

Huang Xi,Email:706864119@qq.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.05.009

黃熙，Email：706864119@qq.com

2014-07-18）

（本文編輯：吳曉初）