陳紹椿 尹躍平 戴秀芹 鄭和平 顧偉鳴 鄭鐘潔吳興中 曹文苓 胡麗華 朱邦勇 孫厚華 陳祥生

中國部分地區(qū)淋球菌耐藥監(jiān)測點產(chǎn)青霉素酶淋球菌及其blaTEM-135突變體的流行調(diào)查

陳紹椿 尹躍平 戴秀芹 鄭和平 顧偉鳴 鄭鐘潔吳興中 曹文苓 胡麗華 朱邦勇 孫厚華 陳祥生

目的 了解中國不同地區(qū)淋球菌耐藥監(jiān)測點產(chǎn)青霉素酶淋球菌（PPNG）的比例及blaTEM-135突變體在PPNG中的分布，比較PPNG及blaTEM-135突變體淋球菌多抗原測序分型（NG-MAST）的型別分布，了解不同地區(qū)PPNG blaTEM-135突變體的差異與聯(lián)系。方法 2012年在江蘇、上海、浙江、天津、廣東、廣西6個淋球菌耐藥監(jiān)測點共收集572株淋球菌，經(jīng)過分離純化及鑒定后，采用頭孢噻吩紙片法測定PPNG；菌株培養(yǎng)后利用試劑盒提取DNA，通過錯配擴增突變分析PCR（MAMA PCR）鑒定blaTEM-135突變體，采用NG-MAST進行分型研究。結(jié)果 572株淋球菌中PPNG總陽性率為38.1%（218/572），PPNG中相應(yīng)blaTEM-135突變體的總比例為52.3%（114/218）。監(jiān)測點中PPNG 陽性率從高至低分別為：浙江（45/87，51.7%）、上海（36/79，45.6%）、廣東（78/205，38.0%）、廣西（12/32，37.5%）、江蘇（24/77，31.2%）、天津（23/92，25%）；PPNG 中相應(yīng) blaTEM-135突變體的陽性率從高至低分別為：浙江（31/45，68.9%）、江蘇（14/24，58.3%）、廣東（39/78，50.0%）、上海（17/36，47.2%）、天津（9/23，39.1%）、廣西（4/12，33.3%）。NG-MAST分型研究顯示，blaTEM-135突變體中流行菌株型別有ST2318、ST1768、ST1866、ST1053、ST8726等，其中ST1768、ST1053和ST8726與blaTEM-135突變體有較強的對應(yīng)關(guān)系。天津PPNG菌株及blaTEM-135突變體ST分布與其他各監(jiān)測點有顯著差異，江浙滬地區(qū)菌株ST有一定聯(lián)系。結(jié)論中國淋球菌耐藥監(jiān)測點PPNG及相應(yīng)blaTEM-135突變體陽性率處于較高水平，不同地區(qū)間PPNG及相應(yīng)blaTEM-135突變體陽性菌株ST型別分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

奈瑟球菌，淋??；β內(nèi)酰胺酶類；流行病學(xué)；blaTEM-135突變體；NG-MAST

淋球菌是淋病的病原體，臨床使用抗生素治療淋球菌感染。最早曾使用青霉素進行治療，但淋球菌易于獲得外源耐藥基因而產(chǎn)生耐藥性，1976年就發(fā)現(xiàn)首例由質(zhì)粒介導(dǎo)的產(chǎn)青霉素酶的淋球菌（penicillinase-producingNeisseria gonorrhoeae，簡稱PPNG）［1-2］。而后這種產(chǎn)青霉素酶的淋球菌菌株很快在全球傳播開，使青霉素不再作為一線藥物用于淋病治療。現(xiàn)在僅剩一線治療藥物為頭孢類抗生素，但是近年來世界各地已經(jīng)分別出現(xiàn)頭孢耐藥的超級淋球菌菌株［3-5］，并且出現(xiàn)多例頭孢菌素臨床治療失敗病例［3-4，6-10］，我們正面臨挑戰(zhàn)。

PPNG 是由 blaTEM-1質(zhì)粒介導(dǎo)產(chǎn)生的［1-2］，該種 β內(nèi)酰胺酶可以降解青霉素，不能降解頭孢菌素。但在一些腸桿菌屬的研究中發(fā)現(xiàn)，blaTEM質(zhì)?？赏ㄟ^多位點突變進化為產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶（extendedspectrum β-lactamases，簡稱 ESBL）的質(zhì)粒［11］。因此，淋球菌中介導(dǎo)PPNG的blaTEM-1質(zhì)粒很可能通過類似突變積累機制，進化為產(chǎn)生ESBL的“超級淋球菌”，從而具有降解各類頭孢菌素的能力。令人擔(dān)憂的是，現(xiàn)階段淋球菌中已經(jīng)出現(xiàn)具有進化為產(chǎn)ESBL 潛在能力的 blaTEM-135突變體［12-13］。blaTEM-135突變體是在其編碼的氨基酸序列的第182位發(fā)生Met182Thr（甲硫氨酸換為蘇氨酸）的氨基酸替換。該位點位于兩個重要功能區(qū)的鏈接部位，Met182Thr氨基酸替換將提高β內(nèi)酰胺酶的熱穩(wěn)定性并極大增強其他位點突變帶來的效應(yīng)，導(dǎo)致淋球菌產(chǎn)生ESBL?，F(xiàn)在在亞洲局部區(qū)域（日本、泰國）已經(jīng)出現(xiàn)了一定比例的blaTEM-135突變體［12-13］，因為青霉素在較長時間內(nèi)不再作為淋病治療藥物，很多地區(qū)對PPNG的監(jiān)測和研究力度也有所下降，對新產(chǎn)生的blaTEM-135突變菌株缺少相關(guān)數(shù)據(jù)以及分子流行病學(xué)研究。我們的前期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，南京blaTEM-135突變體的比例很高［14］。鑒于ESBL的重要性，我們將淋球菌耐藥監(jiān)測點收集的臨床菌株進行PPNG的測定，并通過簡易快速的錯配擴增突變分析（mismatch amplification mutation assay，MAMA）檢測 blaTEM-135突變體，采用淋球菌多抗原測序分型技術(shù)（NG-MAST）對所有blaTEM-135突變體菌株進行分子分型研究，從而初步了解中國潛在超廣譜β內(nèi)酰胺酶淋球菌的分布及分子流行病學(xué)信息。

材料和方法

一、菌株收集及PPNG測定

2012年中國疾病預(yù)防控制中心性病控制中心收集來自江蘇、上海、浙江、天津、廣東、廣西壯族自治區(qū)（廣西）淋球菌耐藥監(jiān)測點的572株淋球菌，經(jīng)過分離純化及革蘭染色、氧化酶實驗初步鑒定后，利用頭孢噻吩法判斷菌株是否產(chǎn)β內(nèi)酰胺酶。菌株鑒定后-70℃保存于脫脂牛奶管中。

二、DNA提取

菌株統(tǒng)一用淋球菌血瓊脂培養(yǎng)基［每500 ml含18 g GC瓊脂粉（淋球菌基礎(chǔ)瓊脂粉，英國Oxoid公司產(chǎn)品），50 ml無菌脫纖維羊血（南京便診生物科技有限公司）］復(fù)蘇后，刮取平板上菌落于200 μl磷酸鹽緩沖液（PBS）中混懸均勻，使用比濁儀（620 nm）調(diào)整菌懸液濃度至0.1麥氏單位。使用德國Qiagen公司生產(chǎn)的QIAxtractor全自動核酸純化儀提取DNA，所用試劑為儀器配套的QIAxtractor DX試劑盒。實驗操作按照儀器說明書及提取液體樣本的試驗方案進行，方案如下：向200 μl菌懸液中加入120 μl DXL緩沖液（細胞裂解液），45℃振蕩加熱處理1 h。待樣本冷卻至室溫，2 500×g離心10 min。轉(zhuǎn)移300 μl上清至2 000 μl樣本板中，進行全自動核酸純化。

三、PCR擴增鑒定blaTEM-135突變體

blaTEM-135突變體鑒定采用 Nakayama 等［13］報道的錯配擴增突變分析PCR，簡要流程如下：根據(jù)文獻合成以下兩對引物：一對引物為TEM-F，5′-GTC GCCCTTATTCCCTTTTTTG-3′，TEM-R，5′-TAGTGT ATGCGGCGACCGAG-3′，用于擴增TEM基因序列22-268位堿基片段（blaTEM-1和blaTEM-135都含有這一片段而且完全匹配，PPNG菌株不管含有blaTEM-1還是blaTEM-135突變體都能夠擴增出該片段）。另一對引物用于區(qū)分blaTEM-1和blaTEM-135，上游引物MAMA-F，5′-GCATCTTACGGATGGCATGAC-3′，下游引物MAMA-R，5′-TGTTGCCATTGCTGCAGGGG-3′，下劃線標示的GG為blaTEM-1錯配堿基，只有含有blaTEM-135突變體的PPNG才能擴增出來。綜合兩對引物的擴增結(jié)果，僅有TEM引物擴增出blaTEM-1，TEM引物和MAMA引物都能擴增出blaTEM-135突變體。所有引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。擴增采用ABI 9700型PCR基因擴增儀。PCR擴增采用10 μl反應(yīng)體系，包括：2×Emerald Amp PCR Master Mix［反應(yīng)預(yù)混液，寶生物工程（大連）有限公司］5 μl，上游引物 0.25 μl，下游引物 0.25 μl，模板 DNA 0.5 μl，水 4 μl。PCR 程序設(shè)定如下：96 ℃變性 2 min，96 ℃ 10 s，56℃ 10 s,72 ℃ 30 s擴增25個循環(huán)，72℃延伸2 min，4℃保溫。日本國立傳染病研究所Nakayama教授贈予的NGON 00-002菌株DNA（含blaTEM-1）和NGON08-003菌株DNA（含blaTEM-135）作為PCR實驗對照品。PCR產(chǎn)物通過15 g/L瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定，電泳DNA標準參照物采用50 bp DNA Ladder［寶生物工程（大連）有限公司］。

四、NG-MAST分型

NG-MAST分型采用Martin 等［15］的方法，簡述如下：PCR擴增porB基因和tbpB基因，擴增產(chǎn)物進行15g/L瓊脂糖凝膠電泳，在正確位置有條帶的產(chǎn)物送至北京華大基因公司進行純化測序。porB基因測序結(jié)果與基因庫中已知序列（GenBank號：M21289）進行比對，以M21289序列為參考，截取從第455位堿基開始的490 bp大小的基因片段進入NG-MAST網(wǎng)站（www.ng-mast.net）比對以獲取porB基因的等位基因型別；tbpB基因測序結(jié)果與基因庫中已知序列（GenBank號：U65222）進行比對，以U65222序列為參考，截取從第1118位堿基開始的390 bp大小的基因片段進入NG-MAST網(wǎng)站比對以獲取tbpB基因的等位基因型別；最后再綜合porB和tbpB基因的等位基因型別從NG-MAST網(wǎng)站獲取該菌株的基因型別。

結(jié) 果

一、各耐藥監(jiān)測點PPNG和blaTEM-135突變體的流行率

錯配擴增突變分析PCR電泳結(jié)果見圖1，2。如果圖1，2對應(yīng)位置都有PCR擴增產(chǎn)物，則該樣本含有blaTEM-135突變體；如果僅圖1有PCR擴增產(chǎn)物，而圖2對應(yīng)位置沒有擴增產(chǎn)物條帶，則該樣本不含blaTEM-135突變體。本次試驗共檢測572株淋球菌，PPNG及其相應(yīng)的blaTEM-135突變體的比例分別為38.1%（218/572）和 52.3%（114/218），具體見表 1。各監(jiān)測點PPNG陽性比例從高至低排列順序為：浙江、上海、廣東、廣西、江蘇、天津。各監(jiān)測點PPNG陽性菌株中blaTEM-135突變體比例從高至低排列順序為：浙江、江蘇、廣東、上海、天津、廣西。浙江PPNG及blaTEM-135突變體比例居于各監(jiān)測點首位。

二、PPNG菌株NG-MAST型別分布

圖1 TEM-F和TEM-R引物擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果 擴增產(chǎn)物為TEM基因序列22-268位247 bp大小堿基片段，所有產(chǎn)青霉素酶淋球菌陽性樣本都可擴增出相應(yīng)條帶。M：標準參照物；1：blaTEM-135突變體陽性對照；2：blaTEM-135突變體陰性對照；3～21：臨床樣本；22：空白對照

圖2 MAMA-F和MAMA-R引物擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果 擴增產(chǎn)物為含有blaTEM-135突變體的TEM基因片段，片段大小仍然為247 bp，不含blaTEM-135突變體的樣本PCR不能擴增出產(chǎn)物。M：標準參照物；1：blaTEM-135突變體陽性對照；2：blaTEM-135突變體陰性對照；3～21：臨床樣本；22：空白對照

對218株P(guān)PNG陽性菌株進行NG-MAST分型，結(jié)果顯示共有158個ST型別，菌株數(shù)量≥3的ST型別見表2。所有型別中，ST4846豐度最高（n=9）。在PPNG菌株中，某些ST型別與blaTEM-135突變體有較強的對應(yīng)關(guān)系，如 ST1053、ST1768、ST8726，屬于這些型別的所有菌株均為blaTEM-135突變體（表3）。天津監(jiān)測點（華北地區(qū)）PPNG菌株及blaTEM-135突變體的ST型別分布與東南沿海地區(qū)監(jiān)測點有顯著不同，浙江、江蘇、上海監(jiān)測點（華東地區(qū)）PPNG菌株及blaTEM-135突變體ST型別相似性較高，主要流行ST 型別（ST4846，ST2318，ST1866）在華東和華南地區(qū)都有分布。

表1 2012年6個耐藥監(jiān)測點產(chǎn)青霉素酶的淋球菌（PPNG）及其相應(yīng)的blaTEM-135突變體分布

表2 2012年6個監(jiān)測點PPNG菌株NG-MAST型別分布（株）

表3 2012年度各監(jiān)測點blaTEM-135突變體NG-MAST型別分布（株）

討 論

淋球菌blaTEM-135突變體是新近報道的產(chǎn)β內(nèi)酰胺酶的突變體，該突變體可能是產(chǎn)ESBL淋球菌的一個重要過渡。Ohnishi等最早在日本發(fā)現(xiàn)兩株blaTEM-135突變體［12］，然后他們對泰國進行了流行病學(xué)調(diào)查［13］，數(shù)據(jù)顯示泰國 2005—2007年收集的菌株中PPNG的比例是79.3%（96/121），其中blaTEM-135突變體的比例是9.4%（9/96）。而我們前期在江蘇點的預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)PPNG陽性率遠低于泰國，但相應(yīng)blaTEM-135突變體的總比例又遠高于泰國［14］，我們推測中國blaTEM-135突變體比例應(yīng)當(dāng)處于較高水平。我國浙江省PPNG及blaTEM-135突變體高達51.7%和68.9%。產(chǎn)ESBL的blaTEM基因主要有兩種來源，一種是通過基因重組從外源（致病或非致病微生物）獲取相關(guān)基因，另一種是通過突變的積累，通常以其細胞內(nèi)一種常規(guī)酶類為基礎(chǔ)，在環(huán)境抗生素選擇性壓力的篩選下，逐漸積累能夠提高其生存能力的耐藥突變。

本次研究所選耐藥監(jiān)測點的淋病疫情大部分位于全國前列，我們的研究發(fā)現(xiàn)，東南沿海及華南一些省份是淋病高發(fā)地區(qū)，同時也是PPNG和blaTEM-135突變體高陽性率地區(qū)，兩者之間有一定相關(guān)性。NG-MAST分型實驗表明，地處華北的天津監(jiān)測點PPNG和blaTEM-135突變體的菌株型別與東南沿海省份明顯不同，可能與南北地域隔離、人口流動以及性網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成有關(guān)。華東地區(qū)的流行菌株有較多重疊，可能與江浙滬同處長三角地區(qū)、地域接近、人口交往頻繁有關(guān)。

日本最早發(fā)現(xiàn)的兩株blaTEM-135突變體的NGMAST 型別分別是 ST1549、ST4013［15］，泰國發(fā)現(xiàn)的9株blaTEM-135突變體的NG-MAST型別分別是ST5134、ST5138、ST5132、ST1292、ST147、ST5135、ST211［13］，這些型別在中國的突變體中都沒有出現(xiàn)，說明我國的突變體菌株構(gòu)成與日本、泰國有較大差異，這一差異可能源于空間上較大的地域跨度以及不同地域之間性網(wǎng)絡(luò)無交叉，同時也證明我國blaTEM-135突變體的產(chǎn)生主要是由于本地的選擇壓力獨立進化產(chǎn)生，少數(shù)型別序列與日本、泰國突變體序列有較高同源性，證明有共同的起源，或在進化過程中有一定的交叉重疊。

本次研究發(fā)現(xiàn)，在PPNG菌株中，某些ST型別與blaTEM-135突變體有較強的對應(yīng)關(guān)系，屬于這些型別的所有菌株均為blaTEM-135突變體。NG-MAST型別與淋球菌的特定性狀之間的對應(yīng)關(guān)系在很多研究中也有發(fā)現(xiàn)，如在頭孢低敏和耐藥菌株的研究中發(fā)現(xiàn)頭孢耐藥特性與ST1407和ST4220兩種型別有極強的相關(guān)性［3-4］。所以在某一特定區(qū)域內(nèi)，充分利用分子分型技術(shù)建立具有某一特性的菌株型別數(shù)據(jù)庫，從而建立起當(dāng)?shù)亓芮蚓餍写氐姆肿由飳W(xué)檔案是有意義的［16］。我們也希望將PPNG和blaTEM-135突變體的監(jiān)測持續(xù)下去，并建立起blaTEM-135突變體的分子流行病學(xué)檔案，為將來可能出現(xiàn)的產(chǎn)ESBL淋球菌的溯源提供依據(jù)。

志謝 日本國立傳染病研究所大西真教授（Ohnishi Makoto）、中山周一教授（Nakayama Shu-ichi）給予技術(shù)支持并贈DNA對照品

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Penicillinase-producingNeisseria gonorrhoeaeand its blaTEM-135gene variants at several gonococcal antimicrobial surveillance sites in China:an epidemiological study

Chen Shaochun*,Yin Yueping,Dai Xiuqin,Zheng Heping,Gu Weiming,Zheng Zhongjie,Wu Xingzhong,Cao Wenling,Hu Lihua,Zhu Bangyong,Sun Houhua,Chen Xiangsheng.*Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College;National Center for Sexually Transmitted Disease Control,China Center for Disease Control and Prevention,Nanjing 210042,China

ObjectiveTo determine the prevalence of penicillinase-producingNeisseria gonorrhoeae（PPNG）and the distribution of blaTEM-135gene variants in PPNG at several gonococcal antimicrobial surveillance sites in China,to compareN.gonorrhoeaemulti-antigen sequence typing（NG-MAST）types of PPNG and its blaTEM-135gene variants,and to assess the difference and association in NG-MAST types of blaTEM-135gene variants among different regions.MethodsA total of 572N.gonorrhoeaeisolates were collected at 6 gonococcal antimicrobial surveillance sites from Jiangsu,Shanghai,Zhejiang,Tianjin,Guangdong and Guangxi in 2012.After isolation,purification,and identification,cefalotin paper discs were used for detection of PPNG.DNA was extracted by QIAxtractor DX kits after cultivation of the PPNG strains.Then,mismatch amplification mutation assay（MAMA）PCR was performed to identify blaTEM-135variants,and NG-MAST analysis to determineN.gonorrhoeaegenotypes.ResultsAmong the 572N.gonorrhoeaestrains,38.1%（218/572）were identified as PPNG,and of the PPNG strains,52.3% （114/218）were blaTEM-135variants.The detection rate of PPNG at these surveillance sites from high to low was as follows:51.7% （45/87,Zhejiang）,45.6%（36/79,Shanghai）,38.0% （78/205,Guangdong）,37.5% （12/32,Guangxi）,31.2% （24/77,Jiangsu）and 25.0%（23/92,Tianjin）,and that of blaTEM-135variants was as follows:68.9%（31/45,Zhejiang）,58.3%（14/24,Jiangsu）,50.0%（39/78,Guangdong）,47.2%（17/36,Shanghai）,39.1%（9/23,Tianjin）and 33.3%（4/12,Guangxi）.NG-MAST analysis showedthat the ST2318,ST1768,ST1866,ST1053 and ST8726 types predominated among these blaTEM-135variants,and a strong correlation was found between blaTEM-135variants and some NG-MAST types,such as ST1768,ST1053 and ST8726 types.The distribution of NG-MAST types was significantly different between the surveillance site in Tianjin（in the Northern part of China）and the other sites （in the Southern part of China）,but highly similar among the surveillance sites in Jiangsu,Zhejiang and Shanghai regions.Conclusions There is a high prevalence of PPNG and its blaTEM-135variants at several gonococcal antimicrobial surveillance sites in China,with significant differences in NG-MAST genotype distribution of PPNG and its blaTEM-135variants among different regions.

Neisseria gonorrhoeae;beta-Lactamases;Epidemiology;blaTEM-135Gene variant;Neisseria gonorrhoeaemulti-antigen sequence typing

Yin Yueping,Email:yinyp@ncstdlc.org

作者單位：210042南京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院皮膚病研究所，中國疾病預(yù)防控制中心性病控制中心（陳紹椿、尹躍平、戴秀芹、孫厚華、陳祥生）；廣東省皮膚病醫(yī)院（鄭和平、吳興中）；上海市皮膚病醫(yī)院（顧偉鳴）；天津市疾病預(yù)防控制中心（鄭鐘潔）；廣州市皮膚病防治所（曹文苓）；浙江省皮膚病防治研究所（胡麗華）；廣西壯族自治區(qū)皮膚病防治研究所（朱邦勇）

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.05.004

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金（81101294）；協(xié)和青年基金暨中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金（3332013143）

尹躍平，Email：yinyp@ncstdlc.org

2014-03-04）

（本文編輯：尚淑賢）