朱小霞 周強(qiáng) 程浩 朱紅明

·研究報道·

尖銳濕疣患者皮損中朗格漢斯細(xì)胞和漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞的檢測

朱小霞 周強(qiáng) 程浩 朱紅明

目的 探討朗格漢斯細(xì)胞（LC）和漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞（pDC）在尖銳濕疣（CA）感染發(fā)病機(jī)制中的可能作用。方法 免疫組化SP法檢測23例CA患者皮損中CD1a+LC和CD2AP+pDC、CD123+pDC的表達(dá)和分布情況，以其中13例CA組織的邊緣正常皮膚為對照，比較CA皮損和邊緣正常皮膚中CD1a+LC、CD2AP+pDC、CD123+pDC表達(dá)密度和陽性率的差異。結(jié)果 CD1a+LC主要位于表皮基底層上棘層，少數(shù)在真皮乳頭層。CA皮損中CD1a+LC在表皮層和真皮層的密度及陽性率與邊緣正常對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。CD2AP+pDC、CD123+pDC主要位于真皮乳頭層，CA患者皮損中CD2AP+pDC、CD123+pDC的密度和陽性率均比邊緣正常對照組顯著增高（P<0.05）。結(jié)論 人乳頭瘤病毒感染影響局部黏膜的pDC數(shù)量，LC數(shù)量未見變化。

尖銳濕疣；郎格爾漢斯細(xì)胞；樹突細(xì)胞；免疫組織化學(xué)；人乳頭瘤病毒

尖銳濕疣（CA）是由人乳頭瘤病毒（HPV）感染引起的皮膚黏膜疾病，臨床上易復(fù)發(fā)，難治愈。目前認(rèn)為，HPV感染后，機(jī)體局部細(xì)胞免疫功能受損是HPV持續(xù)感染和尖銳濕疣反復(fù)發(fā)作的重要原因。朗格漢斯細(xì)胞（LC）和漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞（plasmacytoid dendritic cells，pDC）是皮膚組織中兩大重要的樹突細(xì)胞，其中LC是啟動免疫應(yīng)答的關(guān)鍵細(xì)胞，而pDC是免疫反應(yīng)的重要細(xì)胞，其通過pDC/TLR通路介導(dǎo)分泌I型干擾素（IFN），發(fā)揮抗病毒作用。本研究通過免疫組化方法檢測CA皮損中LC的標(biāo)記分子CD1a和pDC的特異性表面標(biāo)志分子CD2AP、CD123的表達(dá)情況，探討它們在CA發(fā)病機(jī)制中的作用。

一、資料與方法

1.臨床資料：2012年10月至2013年8月，寧波市第一醫(yī)院和浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院收集的23例CA初發(fā)患者，符合2000年衛(wèi)生部疾病控制司制訂的CA診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)組織病理證實為CA患者。其中男18例，女15例，年齡21～42歲，病程1周至2個月。13例對照取自23例CA患者中皮損邊緣正常皮膚。所有患者均無明顯免疫缺陷病史，無糖尿病和嚴(yán)重肝腎功能損害，無合并使用免疫抑制劑的疾病。

2.試劑：CD1a+鼠抗人單克隆抗體、CD2AP+鼠抗人單克隆抗體和CD123+鼠抗人單克隆抗體均為英國Abcam公司產(chǎn)品；即用型UltrasensitiveTMSP免疫組化試劑盒和DAB顯色試劑盒均為北京中杉生物公司產(chǎn)品。

3.方法：

（1）免疫組化染色：取CA患者局部皮損組織，4%甲醛固定后常規(guī)制成蠟塊和切片。分別以CD1a+鼠抗人單克隆抗體、CD2AP+鼠抗人單克隆抗體和CD123+鼠抗人單克隆抗體為一抗，按免疫組化SP試劑盒說明書進(jìn)行LC和pDC染色，以磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作為陰性對照。將染色后的切片置于顯微鏡下觀察并判斷結(jié)果。

作者單位：315010浙江，寧波市第一醫(yī)院（朱小霞、朱紅明）；浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院（周強(qiáng)、程浩）

圖1 CD1a在CA皮損和邊緣組織中的表達(dá)（SP×400） 1A：CA皮損表皮層較多黃褐色樹枝狀細(xì)胞，棘層為主，胞質(zhì)染色；1B：CA真皮乳頭層少量黃褐色不規(guī)則形細(xì)胞，胞質(zhì)染色；1C：CA邊緣組織表皮層較多黃褐色樹突細(xì)胞，胞質(zhì)染色；真皮乳頭層少量黃褐色細(xì)胞，胞質(zhì)染色

（2）結(jié)果判斷：CD1a染色觀察：光鏡下細(xì)胞膜和（或）細(xì)胞質(zhì)呈黃褐色樹枝狀突起的細(xì)胞為陽性細(xì)胞；CD2AP和CD123染色觀察：光鏡下細(xì)胞膜和（或）細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)棕黃或黃褐色顆粒的細(xì)胞為陽性細(xì)胞?！?00光鏡下，每張切片隨機(jī)選取皮損處表皮為主的5個視野，計數(shù)每視野表皮內(nèi)陽性細(xì)胞數(shù)和表皮細(xì)胞總數(shù)；再隨機(jī)選取真皮乳頭層為主的5個視野，計數(shù)每視野真皮陽性細(xì)胞數(shù)和真皮浸潤細(xì)胞總數(shù)。邊緣正常皮膚計數(shù)方法同皮損處。陽性細(xì)胞密度=5個視野陽性細(xì)胞總數(shù)/5個視野總細(xì)胞數(shù)；陽性率=含陽性細(xì)胞的病例數(shù)/總病例數(shù)×100%。

4.統(tǒng)計學(xué)方法：采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料用±s表示，兩組間比較用t檢驗，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

二、結(jié)果

1.CD1a的表達(dá)：CA皮損和邊緣正常皮膚表皮層和真皮層均可見CD1a+LC細(xì)胞，表皮層陽性細(xì)胞胞體大，細(xì)胞突起多，真皮層陽性細(xì)胞胞體相對小，細(xì)胞突起少（圖1）。CA皮損組織和邊緣正常皮膚組織中表皮的CD1a+LC細(xì)胞密度分別為0.024±0.013和0.020±0.013，兩組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；CA皮損組織和邊緣正常皮膚組織中真皮的CD1a+LC細(xì)胞密度分別為0.041±0.051和0.033±0.042，兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。23例CA皮損組織中CD1a表達(dá)陽性率為100%，邊緣正常皮損組織CD1a表達(dá)陽性率為92.3%（12/13），兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.086，P>0.05）。

2.CD2AP的表達(dá)：CD2AP陽性細(xì)胞主要見于真皮乳頭層，表皮層未見陽性細(xì)胞（圖2）。CA皮損組織CD2AP+pDC細(xì)胞密度0.105±0.091高于邊緣正常皮膚組織0.031±0.045，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。23例CA皮損組織中有21例呈CD2AP陽性表達(dá)，陽性率為91.3%，高于邊緣正常皮膚組織CD2AP表達(dá)陽性率53.8%（7/13），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.749，P<0.05）。

3.CD123的表達(dá)：CD123陽性細(xì)胞主要見于真皮乳頭層，表皮層未見陽性細(xì)胞（圖3）。CA皮損組織CD123+pDC細(xì)胞密度0.089±0.063高于邊緣正常皮膚組織0.025±0.035，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。23例CA皮損組織中有21例呈CD123陽性表達(dá)，陽性率為91.3%，高于皮損邊緣正常皮膚組織CD123表達(dá)的陽性率53.8%（7/13），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.749，P<0.05）。

4.CD2AP和CD123的相關(guān)性：CA皮損中，CD2AP與CD123陽性細(xì)胞密度呈顯著正相關(guān)（r=0.696，P<0.05）。

5.LC和pDC的相關(guān)性：CA皮損中LC密度和pDC密度無相關(guān)性（r=0.127，P>0.05）。

三、討論

CA是由HPV感染引起的一種常見的性傳播疾病，其反復(fù)難治愈的主要原因被認(rèn)為是機(jī)體不能建立對HPV感染有效的免疫應(yīng)答。LC最具特異性的標(biāo)記之一是CD1a，人表皮LC是能表達(dá)CD1a的唯一細(xì)胞［1-2］，通過檢測上皮內(nèi)CD1a的表達(dá)，可以了解上皮中LC的數(shù)量。有關(guān)CA組織中LC變化的研究結(jié)論不一，有研究發(fā)現(xiàn)，CA皮損中CD1a+LC數(shù)量較正常人［3］和慢性炎癥中明顯減少［4］，也有研究［5］發(fā)現(xiàn)，CA 皮損中CD1a+LC數(shù)量、密度與正常人無差異。本研究發(fā)現(xiàn)，CA皮損內(nèi)CD1a+LC的形態(tài)、表達(dá)數(shù)量和密度與邊緣正常皮膚差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示CA皮損中LC數(shù)量、密度以及形態(tài)變化不是其局部免疫異常的主要原因。

圖2 CD2AP和CD123在CA皮損和邊緣組織中的表達(dá)（SP×400） 2A：CA皮損真皮乳頭層CD2AP陽性表達(dá)細(xì)胞，胞質(zhì)著棕色；2B：CA邊緣組織真皮層未見CD2AP陽性表達(dá)細(xì)胞；2C：CA皮損真皮乳頭層CD123陽性表達(dá)細(xì)胞，胞質(zhì)著棕色；2D：CA邊緣組織真皮層未見CD123陽性表達(dá)細(xì)胞

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CA皮損中，CD123和CD2AP的表達(dá)非常一致，故CD123和CD2AP的陽性表達(dá)細(xì)胞均認(rèn)為是pDC。此外，CA皮損組織CD123+pDC和CD2AP+pDC的密度和陽性率均明顯高于邊緣正常皮膚組織，提示CA皮損中pDC數(shù)量有所增加，推測HPV感染影響局部黏膜的pDC數(shù)量，pDC可能參與了機(jī)體局部抗HPV感染的免疫反應(yīng)。本研究還發(fā)現(xiàn)pDC和LC的密度無相關(guān)性，提示pDC和LC在CA局部免疫反應(yīng)中各司其職。HPV感染是否導(dǎo)致LC功能受損和pDC/TLR下游通路阻斷，以及pDC與Treg之間的相互作用尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。

［1］朱寧,程浩.人乳頭瘤病毒感染對朗格漢斯細(xì)胞影響機(jī)制的研究進(jìn)展［J］.國際皮膚性病學(xué)雜志,2011,37（3）:174-176.

［2］Feng JY,Peng ZH,Tang XP,et al.Immunohistochemical and ultrastructuralfeatures ofLangerhans cells in condyloma acuminatum［J］.J Cutan Pathol,2008,35（1）:15-20.

［3］車雅敏,王家璧,劉躍華,等.初發(fā)和復(fù)發(fā)尖銳濕疣患者局部皮損朗格漢斯細(xì)胞的檢測［J］.中華皮膚科雜志,2005,38（6）:388.

［4］賴亭吉,駱丹.CD1a和CD83分子在宮頸病變中的表達(dá)［J］.中華皮膚科雜志,2009,42（5）:321-323.

［5］魯建云,吳志強(qiáng),黎明,等.尖銳濕疣皮損中朗格漢斯細(xì)胞功能狀態(tài)的研究［J］.中國男科學(xué)雜志,2008,22（11）:17-21.

Detection of Langerhans cells and plasmacytoid dendritic cells in condyloma acuminatum lesions of patients

Zhu Xiaoxia*,Zhou Qiang,Cheng Hao,Zhu Hongming.*Ningbo First Hospital,Ningbo 315010,Zhejiang,China

ObjectiveTo investigate the possible roles of Langerhans cells（LCs）and plasmacytoid dendritic cells（pDCs）in the pathogenesis of condyloma acuminatum（CA）.MethodsTissue specimens were obtained from the lesions of 23 patients with CA and from perilesional normal skin of 13 of the 23 patients.The expressions and distribution of CD1a,CD2AP and CD123 were analyzed using the streptavidin-peroxidase （SP）immunohistochemical method.Statistical analysis was carried out to compare the density and percentage of CD1a+LCs,CD2AP+pDCs and CD123+pDCs between lesional skin and perilesional normal skin.ResultsMost CD1a+LCs were observed in the prickle cell layer of the epidermis,and a few in the papillary layer of the dermis.There was no significant difference in the density or percentage of CD1a+LCs in the epidermis or dermis between the lesional and perilesional skin specimens（allP>0.05）.CD2AP+pDCs and CD123+pDCs were distributed mainly in the papillary layer of the dermis,and their density and percentage were significantly higher in the lesional than in the perilesional skin specimens （allP<0.05）.ConclusionHuman papillomavirus infection may affect the quantity of pDCs but not LCs in local mucous membranes.

Condylomata acuminata;Langerhans cells;Dendritic cells;Immunohistochemistry;Human papillomavirus

Cheng Hao,Email:hz_chenghao@126.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.05.011

高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金（20100101110028）；寧波市自然科學(xué)基金（2012A610218）；寧波市醫(yī)學(xué)科技計劃項目（2011B04）

程浩，Email：hz_chenghao@126.com

2014-07-01）

（本文編輯：吳曉初）