朱 潔，王 迪，陳鏡宇，吳華勛，魏 偉

血漿激肽釋放酶－激肽系統(tǒng)活化在大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎中的作用

朱 潔1，2，王 迪2，陳鏡宇2，吳華勛2，魏 偉2

目的觀察佐劑性關(guān)節(jié)炎（AA）大鼠血漿激肽釋放酶－激肽系統(tǒng)（KKS）的活化情況，并探討PKSI-527對(duì)大鼠關(guān)節(jié)炎及全身炎癥的影響方法采用弗氏完全佐劑建立AA大鼠模型，并通過(guò)測(cè)量足爪腫脹以及炎癥反應(yīng)評(píng)分的方法進(jìn)行半定量評(píng)價(jià)。ELISA法檢測(cè)血漿中KKS相關(guān)指標(biāo)血漿前激肽釋放酶（PK）、高分子量激肽原（HK）及緩激肽（BK）的水平，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)外周血BK受體B1R、B2R mRNA的表達(dá)情況。使用PKSI-527腹腔內(nèi)注射，觀察抑制劑對(duì)AA大鼠KKS活化以及關(guān)節(jié)腫脹和全身炎癥的改變情況結(jié)果AA大鼠表現(xiàn)繼發(fā)性足爪腫脹、關(guān)節(jié)和全身的炎癥反應(yīng)，與正常大鼠比較，其血漿內(nèi)BK、HK顯著升高（P＜0．05），PK未見(jiàn)明顯升高；同時(shí)外周血B1R、B2R mRNA表達(dá)水平亦較正常大鼠出現(xiàn)上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。注射PKSI-527可顯著降低AA大鼠血漿BK、HK、PK以及B1R、B2R mRNA的水平，與溶劑組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。PKSI-527注射后關(guān)節(jié)腫脹較溶劑組大鼠明顯減輕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），關(guān)節(jié)炎指數(shù)以及全身評(píng)分也有下降趨勢(shì)結(jié)論KKS在AA大鼠體內(nèi)處于活化狀態(tài)，使用KKS抑制劑PKSI-527能夠明顯改善AA大鼠的關(guān)節(jié)炎和全身的炎癥程度。

佐劑性關(guān)節(jié)炎；血漿激肽釋放酶－激肽系統(tǒng)；大鼠

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以慢性對(duì)稱性多關(guān)節(jié)滑膜炎為主的系統(tǒng)性自身免疫性疾病，是造成人群?jiǎn)适趧?dòng)力和致殘的主要疾病之一。RA發(fā)病機(jī)制尚不明確，與細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)紊亂、細(xì)胞因子分泌異常等炎性過(guò)程密切相關(guān)［1－2］。激肽釋放酶－激肽系統(tǒng)（kallikrein-kinin system，KKS）是體內(nèi)一個(gè)重要的內(nèi)源性多酶系統(tǒng)，與多種生理和病理過(guò)程均有聯(lián)系［3］。血漿KKS由3個(gè)血漿蛋白組成，即血漿前激肽釋放酶（prekallikrein， PK）、高分子量激肽原（high molecular weight kininogen，HK）和凝血因子Ⅻ，PK被激活后轉(zhuǎn)變?yōu)榧る尼尫琶福╧allikrein，KK），活化的血漿KK又可把HK裂解，釋放出KKS的重要相應(yīng)分子—緩激肽（bradykinin，BK）［4］。BK通過(guò)特異性的BK受體發(fā)揮作用，已知BK受體包括1型（bradykinin receptor 1，B1R）和2型（bradykinin receptor 2，B2R）。近年來(lái)研究［5］表明，這一組受體在組織損傷后的炎癥反應(yīng)等方面發(fā)揮重要作用，被認(rèn)為是抗炎免疫藥理學(xué)重要的藥物新靶點(diǎn)。該研究擬采用佐劑性關(guān)節(jié)炎（adjuvant arthritis，AA）大鼠模型［6］，通過(guò)檢測(cè)KKS在AA大鼠體內(nèi)的活化情況，并使用KKS系統(tǒng)抑制劑PKSI-527后觀察KKS相關(guān)指標(biāo)以及關(guān)節(jié)和全身炎癥的變化情況，初步探討AA大鼠體內(nèi)KKS系統(tǒng)活化與關(guān)節(jié)炎炎癥關(guān)系，為RA發(fā)病機(jī)制研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物46只清潔級(jí)SD大鼠，雄性，140～160 g，由安徽省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，飼養(yǎng)于安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，環(huán)境溫度為20℃，相對(duì)濕度為62%，每籠5只，給予標(biāo)準(zhǔn)消毒大鼠飼料，籠架上放置消毒自來(lái)水供動(dòng)物自由飲用。有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物操作均經(jīng)過(guò)安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)通過(guò)。

1．2 主要試劑和儀器卡介苗（北京生物制品所）；血漿激肽釋放酶抑制劑PKSI-527（美國(guó)Santa Cruz公司）（貨號(hào)：sc-222181）；TRIzol試劑（美國(guó)Invitrogen公司）；PCR引物及探針由上海TianGen公司合成；ELISA試劑盒（BK、PK、HK）（英國(guó)Abcam公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAidTMFirst strand cDNA Synthesis Kit（德國(guó)Fermentas公司）；Universal 320／320R型低溫離心機(jī)（德國(guó)Hettich公司）；FTC-2000A熒光定量PCR儀及分析軟件（加拿大Funglyn Biotech公司）；Elx-800型酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Tek儀器公司）；KS-TB型足趾容積測(cè)量?jī)x（濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司）。

1．3 大鼠AA模型的制備及藥物處理SD大鼠經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)。模型制備方法為本所常規(guī)開(kāi)展的方法［6］。具體步驟如下：將卡介苗80℃水浴滅活1 h，與高壓滅菌的石蠟充分研磨、混勻，制成10 mg／ml弗氏完全佐劑，大鼠經(jīng)隨機(jī)分組后，各組動(dòng)物分別于第0天于右后足爪皮內(nèi)注射0．1 ml弗氏完全佐劑使其致炎，正常組于同樣部位注射等量的生理鹽水。當(dāng)AA大鼠需要PKSI-527干預(yù)時(shí)，PKSI-527采用Hank′s平衡溶液溶解，分別于第12天、第15天和第18天腹腔注射，注射劑量為300 mg／（kg·d），正常組則腹腔注射同等體積的Hank′s平衡溶液。

1．4 大鼠AA模型的評(píng)價(jià)在注射后24 h內(nèi)密切關(guān)注（每4～6 h觀察1次）大鼠足部改變及活動(dòng)、攝食水等一般表現(xiàn)并進(jìn)行記錄；然后每3 d監(jiān)測(cè)1次體重，同時(shí)觀察關(guān)節(jié)炎癥程度，進(jìn)行全身表現(xiàn)評(píng)分，測(cè)量左后足容積，具體方法見(jiàn)下述。

1．4．1 足爪腫脹度測(cè)定 使用足容積測(cè)量?jī)x在致炎前分別測(cè)量每只大鼠左后足（繼發(fā)側(cè)）容積。自炎癥出現(xiàn)后，每3 d測(cè)量1次左后足容積，計(jì)算繼發(fā)側(cè)足爪腫脹度：足爪腫脹度（ml）＝注射后足爪體積（ml）—注射前足爪體積（ml）。

1．4．2 關(guān)節(jié)炎指數(shù) 從大鼠關(guān)節(jié)炎癥出現(xiàn)后，每3 d觀察每組大鼠的繼發(fā)病變，對(duì)左后足爪、左前足爪和右前足爪進(jìn)行關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分。并用尼康D3100相機(jī)采集大鼠腫脹關(guān)節(jié)的圖像。每只足爪的關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下，0分：正常；1分：踝關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅斑和輕微腫脹；2分：踝關(guān)節(jié)到跖關(guān)節(jié)或掌關(guān)節(jié)紅斑和輕微腫脹；3分：踝關(guān)節(jié)到跖趾關(guān)節(jié)或掌關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅斑和中度腫脹；4分：踝關(guān)節(jié)到趾關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅斑和重度腫脹。每只大鼠最多12分。

1．4．3 全身表現(xiàn)及評(píng)分 從大鼠關(guān)節(jié)炎癥出現(xiàn)后，每3 d進(jìn)行1次全身表現(xiàn)評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下，耳：0＝無(wú)結(jié)節(jié)和發(fā)紅癥狀，1＝一只耳朵結(jié)節(jié)和發(fā)紅癥狀，2＝兩只耳朵結(jié)節(jié)和發(fā)紅癥狀；鼻：0＝無(wú)結(jié)締組織腫脹，1＝明顯結(jié)締組織腫脹；尾：0＝無(wú)結(jié)節(jié)，1＝有結(jié)節(jié)；前足爪：0＝無(wú)腫脹，1＝一個(gè)前足爪腫脹，2＝兩個(gè)前足爪腫脹；后足爪：0＝無(wú)腫脹，1＝一個(gè)后足爪腫脹，2＝兩個(gè)后足爪腫脹。每只大鼠最多評(píng)8分。

1．5 血漿BK、PK、HK檢測(cè)各組大鼠經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，使用10%EDTA抗凝管，血樣采集后，同時(shí)以10 μl／ml加入抑肽酶，防止激肽系統(tǒng)蛋白降解，靜置充分凝固后，4 000 r／min離心10 min，分離血漿，血漿BK、PK、HK檢測(cè)采用ELISA法，根據(jù)底物顯示顏色的深淺與樣品濃度之間存在的相關(guān)關(guān)系，使用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)樣品吸光度（optical density，OD）值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組樣品濃度。

1．6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)全血B1R、B2R mRNA表達(dá)于造模后第24天，麻醉處死各組大鼠取全血，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)成cDNA后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)B1R、B2R mRNA表達(dá)水平。B1R上游引物：5′-CCACATTCCTTCTACGCTCTG-3′，下游引物：5′-TCAACTCCACCATCCTTGC-3′；B2R上游引物：5′-CTGTCGTGGAAGTGGCTATG-3′，下游引物：5′-AGGTCCCGTTATGAGCAGAC-3′。經(jīng)反復(fù)條件摸索，融解曲線分析顯示B1R、B2R及β-actin基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的融解曲線峰值分別為84．0、84．0、84．5℃。以β-actin為內(nèi)參。根據(jù)公式，從而獲得目的基因的相對(duì)拷貝數(shù)，將目的基因與內(nèi)參基因βactin的比值用于統(tǒng)計(jì)分析。

1．7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)錄入及分析均采用SPSS 16．0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料均以±s表示，兩組間的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)的方法，多組間比較采用方差分析。炎癥評(píng)分?jǐn)?shù)據(jù)采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)，以箱式圖表示，采用SPSS 16．0軟件的作圖功能進(jìn)行作圖。

2．1 AA大鼠的表現(xiàn)SD大鼠在接受弗氏完全佐劑一次性注射后，首先表現(xiàn)為注射部位和被注射足爪的腫脹、發(fā)紅等炎癥表現(xiàn)。觀察發(fā)現(xiàn)，注射弗氏完全佐劑后大鼠右后足爪開(kāi)始腫脹，20 h后腫脹達(dá)到高峰，持續(xù)3 d左右腫脹程度逐漸減輕。但在隨后的觀察中，一般在第9天以后又再度出現(xiàn)嚴(yán)重腫脹，同時(shí)伴發(fā)其他足爪和關(guān)節(jié)的腫脹、發(fā)紅。此外，接受弗氏完全佐劑注射的大鼠毛發(fā)光澤度降低、精神萎靡、多發(fā)性關(guān)節(jié)腫脹導(dǎo)致其活動(dòng)障礙，部分大鼠搔抓腫脹足爪以致破潰。正常組大鼠一般狀態(tài)、活動(dòng)均無(wú)較大改變，關(guān)節(jié)亦未出現(xiàn)腫脹。見(jiàn)圖1。AA大鼠不僅表現(xiàn)為關(guān)節(jié)的病變，全身其他部位也同樣出現(xiàn)繼發(fā)性炎癥反應(yīng)。在對(duì)側(cè)足爪、前爪、鼻部、耳部以及尾根部也出現(xiàn)了不同程度的繼發(fā)性炎癥表現(xiàn)。見(jiàn)圖2。

2．2 足爪腫脹度和炎癥評(píng)分

2．2．1 足爪腫脹度 大鼠在注射弗氏完全佐劑后，每3 d測(cè)量1次對(duì)側(cè)（左后）足爪容積并計(jì)算足爪腫脹度。在注射后第9天，對(duì)側(cè)足爪開(kāi)始出現(xiàn)腫脹，程度持續(xù)加重，直至第24天處死動(dòng)物時(shí)，腫脹度仍然較高，而正常組的足爪容積在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間無(wú)異常變化。第12天開(kāi)始，與同一天正常大鼠比較，AA大鼠足爪腫脹度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），見(jiàn)圖3。

2．2．2 關(guān)節(jié)炎指數(shù) 注射足爪以外的足爪出現(xiàn)炎性改變是AA大鼠的特點(diǎn)，為了評(píng)估繼發(fā)性關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度，本實(shí)驗(yàn)采用了半定量評(píng)分的方法分別對(duì)另外3個(gè)足爪的炎癥進(jìn)行評(píng)判，并計(jì)算關(guān)節(jié)炎指數(shù)。從足爪腫脹度的結(jié)果我們得出第18天以后對(duì)側(cè)足爪的腫脹度明顯增加。故從第18天起，每3 d對(duì)其余3個(gè)足爪的繼發(fā)性關(guān)節(jié)炎情況及全身炎癥情況進(jìn)行評(píng)分。關(guān)節(jié)炎指數(shù)的結(jié)果如圖4所示。注射后第18、21、24天的關(guān)節(jié)炎指數(shù)高于注射當(dāng)天（第0天），經(jīng)非參數(shù)秩和檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。提示大鼠發(fā)生了繼發(fā)性關(guān)節(jié)炎性改變，且從箱式圖可以看出，AA大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈逐漸增加趨勢(shì)。

2．2．3 全身表現(xiàn)及評(píng)分 根據(jù)“全身表現(xiàn)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)”對(duì)繼發(fā)部位的炎癥進(jìn)行評(píng)分，結(jié)果如圖5所示。提示注射后第18、21、24天的全身表現(xiàn)評(píng)分高于注射當(dāng)天（第0天），經(jīng)非參數(shù)秩和檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。而且箱式圖顯示，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，AA大鼠全身表現(xiàn)評(píng)分呈逐漸增加趨勢(shì)。

2．3 AA大鼠體內(nèi)KKS的活化情況為了解KKS的活化情況，在注射后第24天，麻醉處死大鼠取血漿，檢測(cè)血漿中BK、PK、HK含量。與正常組比較，AA大鼠BK和HK濃度明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。但PK在AA大鼠未見(jiàn)明顯升高，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示AA大鼠血漿中存在KKS的活化。為進(jìn)一步證實(shí)KKS活化，本實(shí)驗(yàn)將AA大鼠隨機(jī)分為兩組，分別于造模成功后的第12、15、18天腹腔內(nèi)注射PKSI-527或溶劑，同樣在第24天處死動(dòng)物，取血漿檢測(cè)BK、PK及HK的含量。注射PKSI-527可顯著降低AA大鼠血漿BK及HK的水平，與溶劑組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。同時(shí)PK的水平在腹腔注射PKSI-527組也出現(xiàn)了明顯下降，與溶劑組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。說(shuō)明激肽釋放酶抑制劑可有效抑制血漿中KKS的活化。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血漿BK、HK、PK水平（±s）

與正常組比較：*P＜0．05；與AA＋溶劑組比較：△P＜0．05

組別nBK（pg／ml）HK（ng／ml）PK（pg／ml）正常8724．33±153．715．48±0．328．41±1．07 AA11994．20±111．09*6．20±0．11*13．18±4．97 AA＋溶劑8924．75±59．98*6．03±0．4012．73±2．80 AA＋PKSI-5278746．31±77．69△5．34±0．33△7．63±1．72△

2．4 AA大鼠外周血中B1R、B2R mRNA表達(dá)情況取大鼠全血，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)成cDNA后采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)B1R、B2R mRNA表達(dá)水平；將測(cè)出的CT值用公式計(jì)算出相對(duì)含量再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，AA大鼠外周血中B1R mRNA、B2R mRNA表達(dá)水平與正常組相比明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）；AA大鼠經(jīng)腹腔注射PKSI-527或溶劑（第12、15、18天）后，第24天外周血中B1R、B2R mRNA表達(dá)水平出現(xiàn)明顯下調(diào)，與注射溶劑組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。見(jiàn)圖6。

2．5 KKS抑制劑對(duì)AA大鼠足爪腫脹的影響抑制劑組的關(guān)節(jié)腫脹輕于溶劑組，足爪腫脹度比較分析表明，抑制劑組第21天和第24天的左后足爪腫脹度較溶劑組有所減少，第21天的足爪腫脹度兩組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0．283），而第24天的關(guān)節(jié)腫脹度比較，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0．032）。見(jiàn)圖7。

2．6 KKS抑制劑對(duì)AA大鼠關(guān)節(jié)和全身炎癥評(píng)分的影響采用半定量評(píng)分的方法分別對(duì)注射足爪以外的3個(gè)足爪的炎癥進(jìn)行評(píng)判，并計(jì)算關(guān)節(jié)炎指數(shù)。經(jīng)PKSI-527處理后的AA大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)在第21天和第24天均較溶劑組有所下降，但經(jīng)非參數(shù)秩和檢驗(yàn)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。注射PKSI-527后，第21天和第24天大鼠的全身表現(xiàn)評(píng)分均較溶劑組有明顯下降，經(jīng)非參數(shù)秩和檢驗(yàn)，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）結(jié)果表明PKSI-527對(duì)大鼠AA有一定抑制作用。見(jiàn)圖8。

3 討論

目前RA的發(fā)病機(jī)制尚不明確，臨床上無(wú)特異性的治療方法，為此，國(guó)內(nèi)研究者進(jìn)行了大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，并建立了幾種比較成熟可靠的RA整體動(dòng)物病理模型來(lái)研究RA的發(fā)病機(jī)制。上世紀(jì)50年代細(xì)菌學(xué)家Fruend創(chuàng)立的AA模型是免疫性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型的基本方法。隨著對(duì)RA和AA的深入研究，發(fā)現(xiàn)兩者有相似之處，且AA的造模方法簡(jiǎn)單，成功率較高，是目前比較常用的RA實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型［7］。本研究采用弗氏完全佐劑誘導(dǎo)SD大鼠，成功的建立了AA大鼠模型。

KKS是體內(nèi)一個(gè)重要的內(nèi)源性酶系統(tǒng)。BK是KKS的終末效應(yīng)物質(zhì)，是生理狀態(tài)下的主要存在形式，BK的生物學(xué)效應(yīng)廣泛，可介導(dǎo)大多數(shù)的生理學(xué)作用并發(fā)揮對(duì)內(nèi)毒素、促炎細(xì)胞因子、組織損傷、炎癥、缺氧等的效應(yīng)［8］。本研究提示AA大鼠血漿中BK、HK的水平都有所升高，激肽釋放酶抑制劑可以顯著減少血漿中BK、PK及HK的水平，這些結(jié)果表明AA大鼠體內(nèi)存在一定程度的KKS活化現(xiàn)象。RA患者存在明顯的KKS活化，如有研究［9］顯示RA患者的血漿和滑膜液中緩激肽水平上升，滑膜液中激肽釋放酶活性增高，血液中B1R和B2R表達(dá)上調(diào)。本研究從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的角度驗(yàn)證了KKS活化在關(guān)節(jié)炎中的活化。

BK主要是與其受體B1R和（或）B2R結(jié)合發(fā)揮其生理學(xué)效應(yīng)，前者為誘導(dǎo)型表達(dá)，后者為構(gòu)成型表達(dá)［10］。B1R介導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)不像B2R那么快，它可被誘導(dǎo)的特點(diǎn)使得其更多地在病理狀態(tài)下發(fā)揮作用，包括慢性炎癥、疼痛、高血壓、創(chuàng)傷和腫瘤增殖［10－13］。因此有學(xué)者認(rèn)為通過(guò)研發(fā)特異性的B1R拮抗劑可能對(duì)于控制慢性炎癥和腫瘤有所幫助［14］。而KKS這一體內(nèi)很早就被發(fā)現(xiàn)的系統(tǒng)也因?yàn)槠錆撛诘乃幬锇悬c(diǎn)而引起了人們的廣泛關(guān)注。本研究中AA大鼠外周血B1R和B2R表達(dá)增高，PKSI-527不僅有效抑制了KKS的活化，下調(diào)了BK受體的表達(dá)水平，而且減輕了AA大鼠的關(guān)節(jié)炎性改變及全身改變，提示BK及其受體B1R、B2R可能在AA大鼠的病理改變效應(yīng)中發(fā)揮重要的作用，導(dǎo)致關(guān)節(jié)及其他組織的損傷。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)采用弗氏完全佐劑成功建立了AA大鼠模型，證實(shí)了KKS在AA大鼠體內(nèi)處于活化狀態(tài)，而使用KKS抑制劑PKSI-527能夠明顯改善AA大鼠的關(guān)節(jié)炎癥程度。研究結(jié)果為進(jìn)一步靶向KKS治療RA提供了理論依據(jù)。

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Plasmic kallikrein-kinin system activation in adjuvant arthritis rats

Zhu Jie1，2，Wang Di2，Chen Jingyu2，et al
（1Dept of Ophthalmology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022；2Institute of Clinical Pharmacology，Anhui Medical University，Key Laboratory of Anti-inflammatory and Immune Medicine of China Education Ministry，Hefei 230032）

ObjectiveTo detect activation of plasmic kallikrein-kinin system（KKS）in adjuvant arthritis（AA）rats and observe the effects on paw edema as well as systemic inflammation of kallikrein inhibitor PKSI-527．Methods SD rats were injected with Freund＇s complete adjuvant to establish AA rats model，semiquantitative scores were used to estimate the paws and systemic inflammation．Levels of plasimic prekallikrein（PK），high molecular weight kininogen（HK）and bradykinin（BK）were detected by ELISA，expressions of BK receptor BIR B2R mRNA in blood were detected by real-time quantitative PCR．The activation of KKS and inflammatory scores were also evaluated in AA rat treated with PKSI-527．Results After injection with Freund′s complete adjuvant，SD rats developed secondary inflammation in multi-sites，including non-injected paws．Levels of BK and HK in AA rats were elevated compared with normal rats（P＜0．05），but not PK（P＞0．05）．After injection with PKSI-527 in AA rats，there was obvious decrease of BK，HK as well as PK in AA rats（compared to vehicle group，P＜0．05）．B1R and B2R mRNA expression which assayed by real-time PCR showed that over-expression of B1R and B2R in AA rats，intraperitoneal injection with PKSI-527 could down-regulate B1R and B2R mRNA expression．After injection with PKSI-527，the edema of paw was relieved，when compared the mean volume of contralateral paw edema on day 24 with vehicle rats（P＜0．05）．PKSI-527 could decrease inflammatory score in AA rats，but without statistic significance（P＞0．05）．Systemic inflammatory scores were decreased in AA rats after treated with PKSI-527（compared to vehlcie group，P＜0．05）．Conclusion Plasmic kallikrein kinin system（KKS）is activated in AA rats，and kallikrein inhibitor PKSI-527 can obviously relieve the inflammation of AA rats．

adjuvant arthritis；plasmic kallikrein-kinin system；rats

R 967

A

1000－1492（2015）03－0269－06

2015－01－16接收

國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（編號(hào)：81330081）

1安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科，合肥 2300222安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所，抗炎免疫藥物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230032

朱 潔，女，主治醫(yī)師，博士研究生；魏 偉，男，教授，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：wwei＠ahmu．edu．cn