劉炯炯，王長(zhǎng)江，胡紅琳，戚仁娟，夏 莉，方朝暉

西格列汀對(duì)2型糖尿病大鼠chemerin水平的影響

劉炯炯1，王長(zhǎng)江1，胡紅琳1，戚仁娟1，夏 莉1，方朝暉2

目的研究西格列汀干預(yù)對(duì)2型糖尿?。═2DM）大鼠各代謝指標(biāo)及脂肪因子chemerin水平的影響及其可能的機(jī)制，并探討脂肪因子chemerin與T2DM的關(guān)系方法將35只雄性SD大鼠隨機(jī)分為普通飼料喂養(yǎng)組（NC組，n＝10）及高脂飼料喂養(yǎng)組（HF組，n＝25），12周后將高脂飲食喂養(yǎng)的大鼠腹腔一次性注射鏈脲佐菌素（STZ）35 mg／kg，T2DM大鼠造模成功（n＝20）后隨機(jī)分為兩組：T2DM對(duì)照組（T2DM組，n＝10）、西格列汀干預(yù)組（SP組，n＝10），ELISA法分別測(cè)定干預(yù)前后各組大鼠生化指標(biāo)，Western blot法檢測(cè)大鼠腎周脂肪、肝臟和肌肉組織chemerin蛋白表達(dá)水平結(jié)果①T2DM大鼠的血清chemerin、體重（BW）、空腹血糖（FBG）、胰島素（FINS）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL）、胰島素抵抗指數(shù)（HOMO-IR）與NC組比較均增高，胰島β細(xì)胞功能指數(shù)（HOMO-β）降低，腎周脂肪、肝臟及肌肉組織的chemerin蛋白表達(dá)量增加；②西格列汀可降低T2DM大鼠FBG、FINS、TC、TG、LDL、HOMO-IR、血清chemerin水平及腎周脂肪、肝臟組織的chemerin蛋白表達(dá)量，提高HOMO-β指數(shù)；③相關(guān)性分析顯示西格列汀干預(yù)前后TG、FINS及HOMO-IR始終與chemerin獨(dú)立相關(guān)。血清chemerin水平與腎周脂肪chemerin蛋白表達(dá)量呈正相關(guān)（r＝0．79，P＜0．05）結(jié)論西格列汀可降低血清、腎周脂肪及肝臟組織中chemerin水平，改善血清學(xué)各代謝指標(biāo)，chemerin可能參與T2DM的發(fā)生發(fā)展。

2型糖尿??；西格列汀；chemerin

目前糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）的患病率日益增高，預(yù)計(jì)到2030年DM患者數(shù)量在全球范圍內(nèi)可達(dá)4．4億［1］。越來(lái)越多的研究［2］將2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）的發(fā)生發(fā)展歸結(jié)為脂肪相關(guān)信號(hào)分子（如瘦素、脂聯(lián)素、腫瘤壞死因子等）的分泌及局部炎癥反應(yīng)，chemerin就是一種2007年首次被定義為由3T3-L1脂肪細(xì)胞分泌的新的脂肪因子，目前chemerin在T2DM大鼠體內(nèi)的變化尚無(wú)明確結(jié)論，而且新型降糖藥物西格列汀對(duì)脂肪因子chemerin的影響目前鮮有報(bào)道。該研究通過(guò)建立T2DM模型來(lái)研究脂肪因子chemerin在此過(guò)程中發(fā)揮的作用，及新型降糖藥物西格列汀是否通過(guò)影響chemerin水平來(lái)發(fā)揮其作用，并探討其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 儀器與試劑Roche Modular全自動(dòng)生化分析儀（瑞士羅氏公司），穩(wěn)豪血糖儀（美國(guó)強(qiáng)生公司），胰島素放免試劑盒（北京原子高科公司），ELISA試劑盒（上海源葉生物科技有限公司），10%水合氯醛（青島宇龍海藻有限公司），羥甲基淀粉酶（上海蒙究實(shí)業(yè)有限公司），chemerin小鼠抗大鼠單克隆抗體、辣根酶標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗（英國(guó)Abcam公司），ECL化學(xué)發(fā)光顯影劑（美國(guó)millipore公司）等。

1．2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物普通級(jí)SD大鼠35只，雄性4周齡，（100±20）g，購(gòu)自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。飼養(yǎng)條件為室溫（22±2）℃，濕度55%左右，自然晝夜節(jié)律，自由飲水?dāng)z食。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為兩組：普通飼料組（NC組，n＝10）和高脂飼料組（HF組，n＝25）。NC組予以普通飼料（由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心配制）喂養(yǎng)，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束；HF組給予高脂飼料喂養(yǎng)。12周后，將HF組的大鼠一次性腹腔注射鏈脲佐菌素（臨用前溶解在pH＝4．5的0．1 mmol／L檸檬酸緩沖液中）35 mg／kg，于注射后第7天內(nèi)眥靜脈取血測(cè)大鼠血糖，將空腹血糖＞11．1 mmol／L者定為T(mén)2DM模型造模成功［3］，死亡5只，造模成功20只。

1．3 干預(yù)方式將20只T2DM大鼠隨機(jī)分為兩組：①T2DM對(duì)照組（T2DM組，n＝10）：灌胃給予2 ml生理鹽水作為空白對(duì)照，②西格列汀干預(yù)組（SP組，n＝10）：灌胃給予磷酸西格列汀10 mg／（kg· d），溶于2 ml羥甲基淀粉酶中，每日灌胃時(shí)間于早9點(diǎn)，持續(xù)6周，繼續(xù)予以普通飼料喂養(yǎng)。

1．4 標(biāo)本收集與處理T2DM模型造模成功后，所有大鼠禁食12 h，內(nèi)眥靜脈取血2 ml，干預(yù)6周后，所有大鼠禁食12 h，稱重，10%水合氯醛0．3 ml／100 g腹腔注射，麻醉狀態(tài)下解剖大鼠，腹主動(dòng)脈取血3 ml，血標(biāo)本靜止15 min后，3 200 r／min離心10 min，留取血清置于－80℃冰箱保存。并在冰上操作取出腎周脂肪、肝臟組織及股側(cè)肌肉組織，置于液氮罐中以備提取蛋白質(zhì)。

1．5 指標(biāo)測(cè)定通過(guò)測(cè)定血清chemerin、體重（body weight，BW）、空腹血糖（fasting glucose，F(xiàn)BG）、胰島素（fasting insulin，F(xiàn)INS）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL），計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)（insulin resistance index，HOMO-IR）［HOMOIR＝FINS（IU／ml）×FBG（mmol／L）／22．5］和胰島β細(xì)胞功能指數(shù)（HOMO-β）［HOMO-β＝20×FINS／（FBG-3．5）］來(lái)明確西格列汀對(duì)各血清代謝指標(biāo)的影響。

1．6 Western blot法檢測(cè)組織中chemerin蛋白表達(dá)提取腎周脂肪中的總蛋白，使用BCA法測(cè)定蛋白濃度，根據(jù)蛋白濃度決定上樣量。依次進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，chemerin小鼠抗大鼠單克隆抗體（1∶1 000）4℃孵育過(guò)夜后，辣根酶標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗（1∶4 000）室溫下孵育2 h。充分洗滌后ECL化學(xué)發(fā)光顯影并進(jìn)行膠片顯影定影處理。采用上述相同方法，在相同條件下完成肝臟組織及肌肉組織chemerin及各對(duì)應(yīng)的β-actin蛋白檢測(cè)。圖像掃描并分析各條帶的灰度值。

1．7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)以±s表示，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析（ANOVA）及LSD法，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)性分析及多元線性回歸分析，按α＝0．05檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2．1 干預(yù)前各組生化指標(biāo)的比較與NC組相比，T2DM組與SP組大鼠的BW、FBG、FINS、TC、TG、LDL及HOMO-IR升高，HOMO-β降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）；而T2DM組與SP組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

2．2 干預(yù)后各組生化指標(biāo)的比較與T2DM組相比，SP組的FBG、FINS、TC、TG、LDL及HOMO-IR均降低，HOMO-β水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0．05）；與NC組比較，T2DM組與SP組的FBG、FINS、TC、LDL及HOMO-IR均增高（P＜0．05），BW、HOMO-β水平均降低（P＜0．05），T2DM組的TG增高（P＜0．05），但SP組的TG變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2。

表1 西格列汀干預(yù)前各生化指標(biāo)的比較（n＝10，±s）

與NC組比較：*P＜0．05

指標(biāo)NC組T2DM組SP組F值BW（g）339．70±46．88 382．56±30．51*379．70±44．49*2．37 FBG（mmol／L）5．39±0．8412．74±0．98*12．44±2．28*75．60 FINS（IU／ml）7．10±0．8414．88±2．66*14．65±1．60*56．82 TC（mmol／L）1．78±0．592．71±0．48*2．82±0．62*10．16 TG（mmol／L）0．43±0．071．43±0．44*1．43±0．50*22．23 LDL（mmol／L）0．92±0．302．21±0．27*2．28±0．73*25．45 HOMO-β88．40±36．2232．52±6．60*34．57±7．39*21．37 HOMO-IR1．70±0．348．43±1．63*8．09±1．67*77．70

表2 西格列汀干預(yù)后各生化指標(biāo)比較（n＝10，±s）

與T2DM組比較：*P＜0．05；與NC組比較：＃P＜0．05

指標(biāo)NC組T2DM組SP組F值BW（g）388．55±39．03 341．50±33．07＃316．80±49．88＃7．79 FBG（mmol／l）5．00±0．8413．36±2．07＃8．09±1．12*＃93．62 FINS（IU／ml）6．45±0．7414．87±2．92＃10．02±0．37*＃64．22 TC（mmol／L）1．70±0．662．76±0．39＃2．07±0．58*＃46．63 TG（mmol／L）0．50±0．151．51±0．30＃0．55±0．03*58．16 LDL（mmol／L）0．90±0．252．22±0．26＃1．37±0．46*＃9．31 HOMO-β90．21±18．7531．08±8．11＃46．54±13．71*＃84．27 HOMO-IR1．44±0．248．88±2．55＃3．61±0．54*＃39．44

2．3 干預(yù)前后血清chemerin的比較 與NC組相比，干預(yù)前后T2DM組與SP組血清chemerin水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）；干預(yù)后與T2DM組相比，SP組血清chemerin水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），同時(shí)在SP組組內(nèi)干預(yù)后chemerin水平明顯低于干預(yù)前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。見(jiàn)表3。

表3 西格列汀干預(yù)前后chemerin水平的比較（pg／ml，n＝10，±s）

與NC組比較：*P＜0．05；與干預(yù)后T2DM組比較：＃P＜0．05；與SP組干預(yù)前比較：▲P＜0．05

組別干預(yù)前干預(yù)后NC463．60±39．46493．34±42．65 T2DM587．46±79．87*594．80±73．59*SP592．05±110．39*505．48±41．79*?！?/p>

2．4 腎周脂肪、肝臟組織及肌肉組織中chemerin蛋白的表達(dá)T2DM組與SP組大鼠腎周脂肪、肝臟及肌肉組織的chemerin蛋白表達(dá)量較NC組對(duì)應(yīng)組織的表達(dá)量增加（P＜0．05），在腎周脂肪及肝臟中表達(dá)量最高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；SP組大鼠腎周脂肪、肝臟組織的chemerin蛋白表達(dá)量較T2DM組對(duì)應(yīng)組織的表達(dá)量減少（P＜0．05），與NC組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，肌肉組織中chemerin的表達(dá)量與T2DM相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖1、表4。

2．5 chemerin與各生化指標(biāo)的相關(guān)性分析 干預(yù)前血清chemerin與BW、FBG、FINS、HOMO-IR、TG、TC及LDL呈正相關(guān)，干預(yù)后血清chemerin與BW、FINS、TG及HOMO-IR呈正相關(guān)，見(jiàn)表5。進(jìn)一步進(jìn)行多元線性回歸分析，干預(yù)前以chemerin為因變量，以上述與chemerin有相關(guān)性的BW、FBG、FINS、HOMO-IR、TG、TC及LDL為自變量，結(jié)果顯示BW、TG、FINS及HOMO-IR（R2＝0．604，P＜0．05）可進(jìn)入回歸方程，干預(yù)后以chemerin為因變量，以上述與chemerin有相關(guān)性的BW、FIN、TG及HOMO-IR為自變量，結(jié)果顯示TG、FINS、HOMO-IR（R2＝0．375，P＜0．05）可進(jìn)入回歸方程，提示干預(yù)前后TG、FINS、HOMO-IR是chemerin的主要影響因素。相關(guān)性分析得出血清中chemerin的表達(dá)量與腎周脂肪中該蛋白的表達(dá)量呈正相關(guān)（r＝0．79，P＜0．05）。

3 討論

在T2DM這種以胰島素抵抗為主伴有胰島素分泌相對(duì)不足的內(nèi)環(huán)境下，大鼠的胰島β細(xì)胞功能顯著降低，伴隨血脂及體內(nèi)脂肪因子chemerin指標(biāo)的異常，本研究相關(guān)性分析得出T2DM組在西格列汀干預(yù)前chemerin水平與BW、TG呈獨(dú)立相關(guān)，說(shuō)明大鼠脂肪細(xì)胞數(shù)量和體積的增加及伴隨而來(lái)的甘油三酯異?？赡苁茄錭hemerin水平升高的原因；另一方面血清chemerin水平與FINS及HOMO-IR呈獨(dú)立相關(guān)，多項(xiàng)研究［4］證實(shí)chemerin與胰島素抵抗密切相關(guān)，如在敲除小鼠chemerin基因后，與野生型小鼠相比，脂肪組織和肝臟胰島素敏感性降低，肝糖輸出增加，GLUT2表達(dá)的減少，但也有研究［5］表明chemerin可抑制骨骼肌細(xì)胞攝取葡萄糖，降低胰島素敏感性，誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生胰島素抵抗，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，T2DM大鼠血清中FBG、FINS水平的升高與胰島素抵抗程度增加是刺激chemerin分泌的重要因素。

根據(jù)Western blot結(jié)果，提示血清中升高的chemerin蛋白可能來(lái)源于T2DM大鼠的肌肉、肝臟及脂肪組織，但其中腎周脂肪中蛋白增加的程度要明顯大于其余兩組織，且血清中chemerin水平只與腎周脂肪蛋白表達(dá)量呈正相關(guān)，所以血清中升高的chemerin的主要來(lái)源于脂肪組織。

西格列汀作為DPP-4抑制劑，可以選擇性的抑制DPP-4的生物活性，延遲GLP-1的降解，發(fā)揮降低血糖、促進(jìn)胰島素分泌、抑制胰高血糖素分泌、保護(hù)胰島β細(xì)胞功能、促進(jìn)β細(xì)胞再生等作用［6］。除上述作用外，本研究顯示西格列汀干預(yù)6周后還可改善T2DM大鼠高血脂狀態(tài)、炎癥狀態(tài)及胰島素抵抗程度，并且不增加大鼠的體重。

根據(jù)相關(guān)分析顯示在西格列汀干預(yù)后chemerin與大鼠的TG、FINS、HOMO-IR成獨(dú)立相關(guān)，這與Derosa et al［7］的研究結(jié)果相一致，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示聯(lián)合使用西格列汀的T2DM患者血清chemerin水平、FBG、FINS及HOMO-IR均低于單用二甲雙胍組，說(shuō)明西格列汀可能通過(guò)改善胰島素抵抗和高胰島素血癥來(lái)影響chemerin水平。進(jìn)一步進(jìn)行Western blot分析，結(jié)果顯示西格列汀干預(yù)后脂肪及肝臟組織中的chemerin表達(dá)量降低，提示西格列汀可能通過(guò)促進(jìn)肝臟及脂肪組織細(xì)胞胰島素的信號(hào)傳遞通路中胰島素受體底物-1（IRS-1）的酪氨酸磷酸化，直接或間接改善胰島素受體或受體后信號(hào)傳導(dǎo)途徑來(lái)增加胰島素的敏感性，從而影響血清中chemerin水平。另一方面腸道及胰腺分泌的GLP-1、胰島素和胰高血糖素可以影響TG的水平［8］，而西格列汀可以通過(guò)提高GLP-1，降低胰高血糖素，降低肝臟及腸道內(nèi)載TG脂蛋白的水平來(lái)影響TG水平［9］，說(shuō)明西格列汀能通過(guò)調(diào)節(jié)脂代謝進(jìn)而影響chemerin的水平。

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The influence of sitaglipin on chemerin levels of type 2 diabetic rats

Liu Jiongjiong，Wang Changjiang，Hu Honglin，et al
（Dept of Endocrinology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

ObjectiveTo investigate the effects of sitagliptin on metabolic parameters and chemerin levels of type 2 diabetic rats，and to explore the relationship between chemerin and type 2 diabetes．Methods A total of 35 male SD rats were randomly divided into normal diet group（NC，n＝10）and a high－fat diet group（HF，n＝25）．After 12 weeks，high-fat diet rats were given an injection of 35 mg／kg streptozotocin at a time，then the diabetic model rats（n＝20）were randomly divided into 2 groups：diabetes control group（T2DM，n＝10）and sitagliptin intervention group（SP，n＝10）．The rats＇metabolic parameters were measured by ELISA．The chemerin protein expression levels in kidney adipose，liver and muscle tissue were detected by Western blot．Results ①The serum chemerin，F(xiàn)BG，F(xiàn)INS，TCH，TG，LDL，HOMO-IR levels of diabetic model group were increased．HOMO-beta decreased．Chemerin expression levels of diabetes control group in adipose，liver and muscle tissue increased compared with NC group；②Sitagliptin could down-regulate the levels of BW，F(xiàn)BG，F(xiàn)INS，TC，TG，LDL，HOMOIR，serum chemerin and chemerin levels in adipose and liver tissues．On the contrary，HOMO-beta was up-regulated；③The correlation analysis showed that TG，F(xiàn)INS and HOMO-IR were always independently associated with chemerin．In tissues，serum chemerin had positive correlation with chemerin expression levels in adipose．Conclusion Sitagliptin can reduce the levels of chemerin in serum and tissues．It also can improve the metabolic indexes remarkably in serum．Chemerin may be a key involving element in the development of diabetes．

type 2 diabetes；sitagliptin；chemerin

R 587．1

A

1000－1492（2015）03－0294－04

2014－11－13接收

安徽省高校省級(jí)自然科學(xué)研究項(xiàng)目（編號(hào)：KJ2013Z126）；安徽中醫(yī)學(xué)院中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)學(xué)科—中醫(yī)內(nèi)分泌學(xué)科開(kāi)放基金（編號(hào)：2011nfmxk004）；安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2001年度國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金培養(yǎng)計(jì)劃（編號(hào)：2011KJ11）

1安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，合肥 230022

2安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，合肥 230031

劉炯炯，女，碩士研究生；王長(zhǎng)江，男，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：chjw82＠126．com；胡紅琳，女，副教授，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：hhlin1994＠sina．com