李曉艷，周 農(nóng)

神經(jīng)節(jié)苷脂聯(lián)合依達拉奉對局灶性腦缺血再灌注大鼠PDK1、GSK3β蛋白表達的影響

李曉艷1，2，周 農(nóng)1

目的觀察單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂（GM1）聯(lián)合依達拉奉對局灶性腦缺血再灌注大鼠缺血半暗帶區(qū)PDK1、GSK3β蛋白表達的影響，探討其可能的作用方法隨機將大鼠分為假手術(shù)組、模型組、GM1組（劑量20 mg／kg，腹腔注射，1次／d）、依達拉奉組（劑量3 mg／kg，腹腔注射，2次／d）、GM1聯(lián)合依達拉奉組，采用線栓法制作大鼠大腦中動脈缺血再灌注模型，分別對缺血2 h后再灌注3、7、14 d，采用免疫組化Envision兩步法檢測大鼠模型缺血半暗帶PDK1、GSK3β蛋白表達的陽性細胞平均吸收光密度和陽性面積單位結(jié)果在缺血半暗帶，再灌注3、7、14 d各時間點，GM1聯(lián)合依達拉奉組PDK1蛋白表達平均吸收光密度和陽性面積單位分別顯著高于GM1組、依達拉奉組（P＜0．05）、模型組（P＜0．01），GSK3β蛋白表達平均吸收光密度和陽性面積單位分別顯著低于GM1組、依達拉奉組（P＜0．01）、模型組（P＜0．01）結(jié)論GM1聯(lián)合依達拉奉能增強缺血半暗帶PDK1蛋白表達，抑制GSK3β蛋白表達。

單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂；依達拉奉；腦缺血；3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶-1；糖原合成酶激酶-3β；凋亡

腦血管疾病以高發(fā)病率、高復發(fā)率、高致殘率、高死亡率的特點，成為當前疾病3大死亡原因之一。而細胞凋亡是腦缺血中最重要的病理生理機制之一，其主要發(fā)生在病灶周圍的半暗帶區(qū)，抑制腦缺血后細胞凋亡也成為抗缺血治療的重要手段。研究［1］表明單涎酸神經(jīng)節(jié)苷脂（monosialoganglioside，GM1）能通過清除氧自由基、改善細胞內(nèi)鈣超載而起到抗神經(jīng)細胞凋亡的作用。依達拉奉是一種自由基清除劑，可有效提高大鼠局灶性腦缺血時腦組織中超氧化物歧化酶（SOD）活力，降低丙二醛（MDA）水平，并且有效抑制caspase-3表達，對抗神經(jīng)細胞凋亡［2］。近年來，PI3K／Akt信號通路在腦缺血神經(jīng)元凋亡的調(diào)節(jié)作用備受關(guān)注［3］，而3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶-1（3-phosphoinositide dependent protein kinase 1，PDK1）通過磷酸化Akt使其活性增強；糖原合成酶激酶-3β（glycogensynthasekinase-3β，GSK3β）是PI3K／Akt通路下游分子，可以通過Bcl-2家族來誘導凋亡［4］。該實驗采用線栓法制作局灶性腦缺血再灌注大鼠模型，觀察GM1聯(lián)合依達拉奉對模型大鼠缺血半暗帶PDK1、GSK3β蛋白表達的影響，探討其對腦缺血神經(jīng)細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1．1 動物分組 健康SD大鼠105只，南京醫(yī)科大學實驗動物中心提供，雌雄各半，月齡4個月，280～320 g，隨機分為假手術(shù)組、模型組、GM1組、依達拉奉組、GM1聯(lián)合依達拉奉組，每組21只，缺血2 h后，再分別分為再灌注3、7、14 d 3個亞組。

1．2 局灶性腦缺血再灌注模型復制 采用線栓法阻塞大鼠左側(cè)大腦中動脈，制作局灶性腦缺血再灌注大鼠模型，缺血2 h后，分別再灌注3、7、14 d，假手術(shù)組僅作血管分離，具體方法參照文獻［5］。

1．3 藥物與試劑GM1由山東齊魯制藥有限公司提供（規(guī)格：20 mg／2 ml，批號：4010081），依達拉奉注射液由吉林博大制藥有限責任公司提供（規(guī)格：30 mg／20 ml，批號：01-140112）。PDK1、GSK3β一抗購自美國Santa Cruz公司，DAB顯色試劑盒、Envision兩步法試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

1．4 給藥劑量與方法依達拉奉注射液，劑量3 mg／kg，應(yīng)用生理鹽水稀釋成濃度1 mg／ml，腹腔注射，2次／d；GM1，劑量20 mg／kg，用生理鹽水稀釋成濃度1 mg／ml，腹腔注射，1次／d。假手術(shù)組、模型組用等量0．9%生理鹽水腹腔注射。

1．5 取材分別于再灌注的3、7、14 d，10%水合氯醛麻醉（3．6 ml／kg體重，ip）大鼠，打開胸腔，于右心耳部剪一小口，從左心室插入導管至主動脈，向內(nèi)快速注入37℃肝素化NS 250 ml，至右心耳流出液變清亮，然后注入40 g／L多聚甲醛磷酸鹽緩沖液250 ml，灌流固定30 min后斷頭取腦，除去小腦和腦干，取大腦，放入40 g／L多聚甲醛磷酸鹽緩沖液中固定1周，脫水、透明、浸蠟，在視交叉前后連續(xù)制作腦部冠狀切片。

1．6 免疫組化兩步法檢測采用Envision兩步法進行免疫組化染色，DAB顯色液顯色，PDK1、GSK3β一抗稀釋濃度為（1∶150），陰性對照采用正常山羊血清替代一抗進行，蘇木精輕度復染。

根據(jù)大鼠腦缺血半暗帶的定位方法［6］，大腦中動脈阻塞的同側(cè)額頂葉皮質(zhì)上部界定為半暗帶的等值觀察區(qū)，采用南京捷達JD-801圖像分析系統(tǒng)，在相同視野下（×400），分別對相鄰切片的PDK1、GSK3β蛋白免疫反應(yīng)陽性細胞的平均吸收光密度和陽性面積單位進行分析。

1．7 統(tǒng)計學處理采用SPSS 16．0統(tǒng)計軟件分析，所有計量資料數(shù)據(jù)用±s表示，每組實驗所得數(shù)據(jù)采用方差分析，兩組間比較用t檢驗，多組間比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2．1 GM1聯(lián)合依達拉奉對局灶性腦缺血再灌注大鼠PDK1蛋白表達的影響陰性對照未見PDK1蛋白表達，假手術(shù)組缺血半暗帶PDK1蛋白見少量表達，腦缺血2 h后再灌注的各時間點，模型組PDK1蛋白表達明顯增強，主要表達于半暗帶神經(jīng)細胞胞質(zhì)，其陽性面積單位和平均吸收光密度值顯著高于假手術(shù)組（P＜0．01）；再灌注各時間點，GM1聯(lián)合依達拉奉組PDK1蛋白表達明顯增強，其陽性面積單位和平均吸收光密度值顯著高于模型組（P＜0．01）；再灌注各時間點，GM1組、依達拉奉組PDK1蛋白表達平均吸收光密度和陽性面積單位顯著高于模型組（P＜0．01）；再灌注各時間點，GM1聯(lián)合依達拉奉組PDK1蛋白表達平均吸收光密度和陽性面積單位顯著高于GM1組、依達拉奉組（P＜0．05）。其中，關(guān)于PDK1的陽性單位面積GM1聯(lián)合依達拉奉組與GM1組比較，F(xiàn)3d＝1．504，F(xiàn)7d＝2．527，F(xiàn)14d＝1．495；GM1聯(lián)合依達拉奉組與依達拉奉組比較，F(xiàn)3d＝0．086，F(xiàn)7d＝0．800，F(xiàn)14d＝0．256；平均吸收光密度值GM1聯(lián)合依達拉奉組與GM1組比較，F(xiàn)3d＝0．600，F(xiàn)7d＝2．705，F(xiàn)14d＝0．100；GM1聯(lián)合依達拉奉組與依達拉奉組比較，F(xiàn)3d＝1．772，F(xiàn)7d＝3．250，F(xiàn)14d＝1．338。見表1、圖1。

2．2 GM1聯(lián)合依達拉奉對局灶性腦缺血再灌注大鼠GSK3β蛋白表達的影響陰性對照未見GSK3β蛋白表達，假手術(shù)組缺血半暗帶GSK3β蛋白見少量表達，腦缺血2 h后再灌注的各時間點，模型組GSK3β蛋白表達明顯增強，主要表達于半暗帶神經(jīng)細胞胞質(zhì)，其陽性面積單位和平均吸收光密度值顯著高于假手術(shù)組（P＜0．01）；再灌注各時間點，神經(jīng)節(jié)苷脂聯(lián)合依達拉奉組GSK3β蛋白表達明顯減弱，其陽性面積單位和平均吸收光密度值顯著低于模型組（P＜0．01）；再灌注各時間點，GM1組、依達拉奉組GSK3β蛋白表達平均吸收光密度和陽性面積單位顯著低于模型組（P＜0．05）；再灌注各時間點，GM1聯(lián)合依達拉奉組GSK3β蛋白表達平均吸收光密度和陽性面積單位顯著低于GM1組、依達拉奉組（P＜0．01）。其中，關(guān)于GSK3β的陽性單位面積GM1聯(lián)合依達拉奉組與GM1組比較，F(xiàn)3d＝0．495，F(xiàn)7d＝1．422，F(xiàn)14d＝0．588；GM1聯(lián)合依達拉奉組與依達拉奉組比較，F(xiàn)3d＝0．708，F(xiàn)7d＝9．81，F(xiàn)14d＝ 2．885；平均吸收光密度值GM1聯(lián)合依達拉奉組與GM1組比較，F(xiàn)3d＝0．014，F(xiàn)7d＝0．09，F(xiàn)14d＝0．816；GM1聯(lián)合依達拉奉組與依達拉奉組比較，F(xiàn)3d＝0．108，F(xiàn)7d＝3．642，F(xiàn)14d＝1．026。見表2、圖2。

表1 各組缺血2 h再灌注不同時間缺血半暗帶PDK1蛋白表達陽性細胞的陽性單位面積和平均吸收光密度值（n＝7，±s）

與假手術(shù)組比較：**P＜0．01；與模型組比較：＃＃P＜0．01；與依達拉奉組比較：▲P＜0．05，▲▲P＜0．01；與GM1組比較：△P＜0．05，△△P＜0．01

組別陽性單位面積（×102）平均吸收光密度值3 d7 d14 d 3 d7 d14 d假手術(shù)12．21±1．0212．22±0．9012．35±1．460．115±0．0090．122±0．0090．118±0．011模型16．72±0．82**18．28±0．47**17．81±0．84**0．154±0．006**0．172±0．009**0．171±0．009**依達拉奉20．95±0．82＃＃23．60±0．77＃＃22．21±0．57＃＃0．202±0．012＃＃0．226±0．005＃＃0．225±0．008＃＃GM10．98±1．49＃＃22．81±0．94＃＃21．81±1．23＃＃0．206±0．010＃＃0．221±0．016＃＃0．222±0．013＃＃依達拉奉＋GM123．10±0．71＃?！鳌?5．50±0．67＃?！鳌?3．38±0．78＃?！?．229±0．008＃?！鳌?．243±0．011＃?！鳌?．242±0．017＃?！?/p>

表2 各組缺血2 h再灌注不同時間缺血半暗帶GSK3β蛋白表達陽性細胞的陽性單位面積和平均吸收光密度值（n＝7，±s）

與假手術(shù)組比較：**P＜0．01；與模型組比較：＃P＜0．05，＃＃P＜0．01；與依達拉奉組比較：▲P＜0．05，▲▲P＜0．01；與GM1組比較：△P＜0．05，△△P＜0．01

組別陽性單位面積（×102）平均吸收光密度值3 d7 d14 d 3 d7 d14 d假手術(shù)9．93±0．609．88±0．699．82±0．610．098±0．0100．091±0．0100．095±0．009模型17．86±0．57**21．50±0．83**21．32±1．32**0．198±0．010**0．217±0．010**0．214±0．008**依達拉奉15．96±0．57＃＃20．23±0．75＃19．05±0．94＃＃0．166±0．011＃＃0．204±0．004＃0．193±0．011＃＃GM116．31±0．88＃＃20．74±0．5619．89±0．68＃0．170±0．009＃＃0．207±0．0080．202±0．006＃＃依達拉奉＋GM114．17±0．64＃＃▲▲△△14．94±0．33＃?！鳌?4．08±0．55＃?！鳌?．137±0．009＃?！鳌?．142±0．007＃?！鳌?．140±0．007＃＃▲▲△△

3 討論

缺血中心區(qū)和周圍的半暗帶組成局灶性腦缺血病灶，缺血再灌注時產(chǎn)生的氧自由基可導致脂質(zhì)過氧化反應(yīng)從而改變其功能，細胞膜通透性增強，線粒體腫脹破裂并誘發(fā)細胞凋亡，其主要發(fā)生在半暗帶。如果能阻止凋亡的發(fā)展，就有可能減輕腦缺血時腦損傷程度，縮小梗死范圍，因此腦缺血后神經(jīng)元凋亡機制以及基于細胞凋亡為靶點的抗腦缺血研究成為研究的熱點［7］。

在近年來研究［8］的抗凋亡信號通路中，PI3K／Akt信號通路已成為熱門之一，PDK1是AGC蛋白激酶家族里面的一種絲氨酸／蘇氨酸激酶，對控制細胞生長分化生存蛋白質(zhì)翻譯和葡萄糖代謝具有重要意義。GSK3β是Akt下游一重要靶向分子，可通過激活糖原合成酶調(diào)節(jié)細胞能量代謝過程，在細胞的生長、分化、突變和凋亡等生命活動中具有重要的調(diào)控作用，是多種信號途徑的交匯點，具有廣泛的底物［9］，參與多種信號的負調(diào)控。有研究［10］表明，在多種正常組織細胞及多類腫瘤細胞中，GSK3β活性上調(diào)可進一步激活細胞凋亡的相關(guān)蛋白激酶，從而誘導細胞凋亡。有研究［11］表明抑制PDK1的活性可以促使癌細胞凋亡或抑制其增殖。

Candelise et al［12］通過對急性腦梗死患者聯(lián)合使用GM1及依達拉奉療效的觀察，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥不僅增強神經(jīng)營養(yǎng)因子功能的作用，而且可以更好地發(fā)揮改善腦組織代謝及修復病變的腦組織，減少腦組織繼發(fā)梗死的作用。研究結(jié)果顯示，在缺血半暗帶，再灌注3、7、14 d各時間點，模型組PDK1、GSK3β蛋白表達的平均吸收光密度和陽性面積單位均顯著高于假手術(shù)組，說明腦缺血后PDK1、GSK3β蛋白表達增加，PI3K／Akt信號通路存在激活現(xiàn)象；再灌注各時間點，GM1組、依達拉奉組PDK1蛋白表達平均吸收光密度和陽性面積單位顯著高于模型組，可見GM1、依達拉奉均可促進PDK1表達，從而使Akt活性增強，抗神經(jīng)細胞凋亡；GM1組、依達拉奉組GSK3β蛋白表達平均吸收光密度和陽性面積單位顯著低于模型組，說明GM1、依達拉奉均可抑制GSK3β表達，從而抑制細胞凋亡的相關(guān)蛋白激酶的激活；再灌注各時間點，GM1聯(lián)合依達拉奉組PDK1蛋白表達平均吸收光密度和陽性面積單位顯著高于GM1組或依達拉奉組，GSK3β蛋白表達平均吸收光密度和陽性面積單位顯著低于GM1組或依達拉奉組，說明GM1聯(lián)合依達拉奉在促進PDK1及抑制GSK3β表達上較單獨用藥效果更佳。

綜上所述，GM1聯(lián)合依達拉奉能增強缺血半暗帶PDK1蛋白表達，抑制GSK3β蛋白表達，調(diào)節(jié)PI3K／Akt信號通路，抗腦缺血神經(jīng)細胞凋亡，并且其作用明顯優(yōu)于單獨使用GM1或依達拉奉。但PI3K／Akt信號通路及其相關(guān)分子如何實現(xiàn)對神經(jīng)細胞凋亡的調(diào)控以及分子機制有待進一步的研究。

［1］ Yu R K，Tsai Y T，Ariga T．Functional roles of gangliosides in neurodevelopment-anoverview of recent advances［J］．Neurochem Res，2012，37（6）：1230－44．

［2］ 周亞東，楊 琳，李修斌，等．依達拉奉對大鼠局灶性腦缺血后神經(jīng)元凋亡的影響［J］．中國實用醫(yī)藥，2011，6（19）：35－7．

［3］ Yuan Y，Guo Q，Ye Z，et al．Ischemic postconditioning protects brain from ischemia／reperfusion injury by attenuating endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis through PI3K-Akt pathway［J］．Brain Res，2011，1367：85－93．

［4］ Chen L，Xiang Y，Kong L，et al．Hydroxysafflor yellow a protects against cerebral ischemia-reperfusion injury by anti-apoptotic effectthrough PI3K／Akt／GSK3β pathway in rat［J］．Neurochemical Res，2013，38（11）：2268－75．

［5］ 李 凈，王 鍵．益氣活血法改善氣虛血瘀證局灶性腦缺血再灌注模型鼠生物學特征的有效性評價［J］．中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學雜志，2003，9（4）：22－6．

［6］ Bannister C M，Chapman S A．Ischemia and revascularization of the middle cerebral territory of the rat brain by manipulation of the blood vessels in the neck［J］．Surg Neurol，1984，21（4）：351－7．

［7］ Tu X K，Yang W Z，Shi S S，et al．Baicalin inhibits TLR2／4 signaling pathway in rat brain following permanent cerebral ischemia［J］．Inflammation，2011，34（5）：463－70．

［8］ 李 欣．PDK1結(jié)構(gòu)與功能研究進展［J］．攀枝花學院學報，2014，31（2）：92－5．

［9］ Liang M H，Chuang D M．Differertial roles of glycogen syntase kinase-3 isoforms in the regulation of transcriptional activation［J］．J Biol Chem，2006，281（41）：30479－84．

［10］Choi Y K，Kim Y S，Choi I Y，et al．25-hydroxy cholesterol induces mitochondfia-dependent apoptosis via activation of glycogen synthase kinase-3beta in PCI2 cells［J］．Free Radio Res，2008，42（6）：544－53．

［11］Bo X，Mei Y，Wen J L，et al．Expression of oxidored nitro domaincontaining protein 1（NOR1）impairs nasopharyngeal carcinoma cells adaptation to hypoxia and inhibits PDK1 expression［J］．Mol Cell Biochem，2014，393（2）：293－300．

［12］Candelise L，Ciccone A．Gangliosides for acute ischemic stroke［J］．Stroke，2002，33（9）：2336．

Effects of monosialoganglioside and edaravone on expressions of PDK1，GSK3β protein in ischemic penumbra after focal cerebral ischemia／reperfusion in MCAO rats

Li Xiaoyan1，2，Zhou Nong1
（1Dept of Neurology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022；2Dept of Neurology，The Second People’s Hospital of Anhui，Hefei 230011）

ObjectiveTo investigate the effects of GM1 and Edaravone on expressions of PDK1，GSK3β protein in ischemic penumbra after local cerebral ischemia／reperfusion in intraluminal thread occlusion of the middle cerebral artery rats and its related mechanism．Methods The local cerebral ischemia／reperfusion model was established by intraluminal thread occlusion of the middle cerebral artery．The animals were randomly divided into pseudo surgery group，model group，GM1 group，Edaravone group and GM1 and Edaravone group．Using the techniques of immuno-histochemical sraining，the expressions of PDK1，GSK3β protein were observed at 3，7 and 14 days in ischemic penumbra．Results In ischemic penumbra，3，7，14 days each time point，a value and positive unit of the PDK1 protein expression in GM1 and Edaravone groups were higher than those in GM1 or Edaravone groups（P＜0．05），model groups（P＜0．01）；a value and positive unit of the GSK3β protein expression in GM1 and Edaravone groups were lower than those in GM1 or Edaravone groups（P＜0．01），model groups（P＜0．01）．Conclusion GM1 and Edaravone resist neural cell apoptosis，regulate PI3K／Akt signal transduction pathway by enhancing PDK1 protein and restraining GSK3β expression after local cerebral ischemia／reperfusion in artery rats．

monosialoganglioside；edaravone；brain ischemia／reperfusion；3-phosphoinositide dependent protein kinase 1；glycogen synthase kinase-3β；apoptosis

R 743

A

1000－1492（2015）03－0302－05

2014－12－31接收

1安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，合肥 230022

2安徽省第二人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，合肥 230011

李曉艷，女，碩士研究生；周 農(nóng)，男，主任醫(yī)師，責任作者，E-mail：zhounong＠foxmail．com