許元寶，徐德祥，張 程，王 華

脂多糖預(yù)處理減輕對乙酰氨基酚所致急性肝損傷

許元寶1，2，徐德祥1，張 程1，王 華1

目的建立對乙酰氨基酚（APAP）引起小鼠急性肝損傷動物模型，探討低劑量脂多糖（LPS）預(yù)處理對APAP引起急性肝損傷的作用方法①選取ICR雄性小鼠20只，隨機分成APAP組和LPS＋APAP組。禁食后，APAP組經(jīng)腹腔注射APAP（300 mg／kg）；LPS＋APAP組經(jīng)腹腔注射先給予LPS（50 μg／kg），3 h后再給予APAP（300 mg／kg），密切觀察小鼠存活狀況，72 h后取材，測生化指標，行肝組織HE染色。②ICR雄性小鼠隨機分成APAP 0、0．5、6、12、24、72 h組和LPS＋APAP 0、0．5、6、12、24、72 h組。禁食后，APAP組腹腔注射APAP（300 mg／kg）；LPS＋APAP組腹腔注射LPS（50 μg／kg），3 h后再經(jīng)腹腔注射APAP（300 mg／kg），分別在每組對應(yīng)時點取材。分離血清測丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT），用Beutler改良法測肝臟谷胱甘肽（GSH）含量結(jié)果①APAP組給藥4 h左右小鼠開始出現(xiàn)死亡情況，72 h存活率為50%；LPS＋APAP組72 h內(nèi)無死亡。②低劑量LPS預(yù)處理能降低血清ALT（P＜0．05），減少小鼠肝臟壞死情況（P＜0．01）。③APAP組與LPS＋APAP組肝臟GSH含量差異無統(tǒng)計學意義結(jié)論低劑量LPS預(yù)處理能顯著減輕APAP引起的急性肝損傷，這種作用不是通過減弱N-乙酰苯醌亞胺（NAPQI）耗竭GSH而產(chǎn)生的，可能與其激活了機體的免疫應(yīng)答，抑制了GSH耗竭的下游機制有關(guān)。

脂多糖；對乙酰氨基酚；急性肝損傷；谷胱甘肽

急性肝損傷（acute liver injury，ALJ）一般是短期接觸較大劑量肝毒物或肝臟功能不全時接觸某種肝毒物引起，病理改變常見于肝細胞壞死、脂肪變性、膽汁淤積等［1］。對乙酰氨基酚（acetaminophen，APAP）是過量引起急性肝損傷、肝衰竭的主要藥物［2－3］，由于其在體內(nèi)可被代謝生成高活性毒性產(chǎn)物N-乙酰苯醌亞胺（N-acetyl-p-benzoquinone imine，NAPQI），最終造成肝實質(zhì)細胞壞死［4－5］。脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）是革蘭陰性桿菌細胞壁的主要組分之一，它由類脂A、核心多糖和特異性多糖三部分組成［6－7］。近年來研究［8－10］表明，LPS與細胞膜上相應(yīng)受體作用后，啟動信號傳遞、基因轉(zhuǎn)錄，表達和釋放多種促炎因子。低劑量LPS刺激后所誘導的內(nèi)毒素耐受可減輕大劑量內(nèi)毒素所致肝損傷，但能否減輕APAP引起的急性肝損傷尚不明確。該課題擬在建立APAP引起小鼠急性肝損傷動物模型的基礎(chǔ)上，探討低劑量LPS預(yù)處理對APAP引起急性肝損傷的作用。

1 材料與方法

1．1 化學試劑A PAP與LPS購自美國Sigma公司；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）試劑盒購自南京建成生物工程研究所；標準飼料購于江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程責任有限公司；其他試劑均購自美國Sigma公司。

1．2 實驗動物清潔級ICR雄性小鼠，6～8周齡，體重28～30 g，共92只，購自安徽醫(yī)科大學實驗動物中心。實驗前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，自由進食標準飼料，維持12 h光照和12 h黑暗的晝夜節(jié)律，溫度20～25℃，濕度（50±5）%。實驗方案獲得了安徽醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會的批準，在實驗過程中對實驗動物給予了人文關(guān)懷。

1．3 動物分組與處理實驗一：為觀察LPS對APAP所致小鼠急性肝損傷存活率的影響，選取ICR雄性小鼠20只，隨機分成APAP組和LPS＋APAP組，每組10只。禁食10 h后，APAP組腹腔注射APAP（300 mg／kg）；LPS＋APAP組經(jīng)腹腔注射先給予LPS（50 μg／kg），3 h后再給予APAP（300 mg／kg）。給藥后，兩組均禁食不禁水，密切觀察小鼠存活狀況，72 h后剖殺剩余小鼠，摘眼球取血測生化指標，剪取部分肝臟組織用4%多聚甲醛固定做病理切片，其余肝臟組織放入－80℃冰箱中保存。實驗二：為探討LPS對小鼠APAP急性肝損傷作用發(fā)生與發(fā)展的時間過程，ICR雄性小鼠隨機分成APAP 0、0．5、6、12、24、72 h組和LPS＋APAP 0、0．5、6、12、24、72 h組，每組6只。禁食10 h后，APAP組腹腔注射APAP（300 mg／kg）；LPS＋APAP組腹腔注射LPS（50 μg／kg），3 h后再經(jīng)腹腔注射APAP（300 mg／kg）。給藥后，禁食不禁水，分別在每組對應(yīng)時點（0、0．5、6、12、24、72 h）取材。分離血清用于生化檢測，取部分肝組織用于病理檢查，其余置于－80℃冰箱中保存。

1．4 血清生化指標檢測小鼠血液樣品室溫靜置1 h后，3 500 r／min離心15 min，取上清液，用ALT試劑盒測定血清ALT活性，測定方法采取改良賴氏法。

1．5 HE染色法觀察肝組織病理學變化、計算肝臟壞死面積比例取部分受試動物同部位肝組織，置于4%多聚甲醛中固定。經(jīng)乙醇溶液脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、5 μm連續(xù)切片、HE染色、中性樹脂封片后，于光學顯微鏡下觀察肝臟組織病理改變。同時拍攝（×100）病理圖片，使用美國國立衛(wèi)生研究院Image J軟件（http：／／rsb．info．nih．gov／ij／）測量壞死區(qū)域面積和目標肝小葉總面積，計算壞死面積比例。

1．6 肝臟組織GSH含量檢測稱取0．1 g小鼠肝臟組織，運用Beutler改良法測定肝臟GSH含量。

1．7 統(tǒng)計學處理采用SPSS 13．0統(tǒng)計軟件處理，定量實驗資料以±s表示，統(tǒng)計方法選用方差分析及t檢驗。

2 結(jié)果

2．1 LPS對小鼠存活率的影響選取ICR雄性小鼠20只，隨機分成APAP組和LPS＋APAP組。兩組在給藥前，體重差異無統(tǒng)計學意義，兩組小鼠狀態(tài)良好。APAP組經(jīng)腹腔注射APAP（300 mg／kg）；LPS＋APAP組經(jīng)腹腔注射先給予LPS（50 μg／kg），3h后再給予APAP（300 mg／kg）。給藥后，單純APAP組小鼠精神狀態(tài)持續(xù)萎靡，活動量明顯減少，對外界刺激反應(yīng)遲鈍。給藥4 h左右小鼠開始出現(xiàn)死亡情況，72 h存活率僅為50%；LPS＋APAP聯(lián)合處理組，在腹腔注射APAP后，小鼠狀態(tài)出現(xiàn)輕度萎靡，活動量減少，4 h后，小鼠精神狀態(tài)好轉(zhuǎn)，活動量有所恢復(fù)，72 h內(nèi)無死亡。見圖1。

2．2 LPS對小鼠體重、肝重及ALT的影響為了探討LPS對小鼠APAP急性肝損傷作用發(fā)生與發(fā)展的時間過程，對禁食10 h后的ICR小鼠腹腔注射APAP（300 mg／kg），LPS＋APAP組提前3 h給予腹腔注射LPS（50 μg／kg）預(yù)處理，并分別在每組對應(yīng)時點（0、0．5、6、12、24、72 h）取材，測定生理及生化指標，結(jié)果見表1。

通過時點效應(yīng)關(guān)系實驗發(fā)現(xiàn)，APAP組在0．5～24 h內(nèi)隨著藥物作用時間的延長，小鼠的肝臟系數(shù)（肝重／體重×100%）、血清ALT值都呈逐漸升高趨勢，在24 h時點，兩者都達到最高值，與APAP 0 h相比，差異均有統(tǒng)計學意義。之后，小鼠的肝臟系數(shù)、ALT值逐漸下降，在72 h時點分別降至（5．36± 0．01）%、（376．90±153．32）U／L。

LPS＋APAP組在給予APAP處理后0～24 h內(nèi)，與APAP 0 h相比，小鼠肝臟系數(shù)都有一定程度的增加，但沒有呈現(xiàn)逐漸增高的趨勢，而是在0．5 h時點達到最高，之后逐漸降低，在72 h時點已恢復(fù)正常；此外，與APAP組各對應(yīng)時點進行比較后發(fā)現(xiàn)，12、24 h時點，小鼠的肝臟系數(shù)要低于APAP 12、24 h時點（P＜0．05）。

在生化指標方面，經(jīng)血清ALT檢測，LPS＋APAP組小鼠在給藥后ALT值的變化趨勢同APAP組相類似，逐漸增高，并在24 h時點達到最高值，但升高幅度顯著低于APAP組，APAP組與LPS＋APAP組ALT峰值比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．01）。

2．3 LPS對小鼠肝臟病理組織學的影響給藥后，隨著APAP作用時間的延長，肝臟損傷情況進行性加重，壞死面積占比不斷增高。APAP組6 h時點，肝臟就出現(xiàn)明顯的充血現(xiàn)象和典型的肝臟小葉中心壞死，壞死面積占32．51%；12 h時點，肝小葉結(jié)構(gòu)進一步遭到破壞，可見多處壞死，壞死面積占51．25%；24 h時點，可見大面積壞死，壞死面積占65．64%。而LPS＋APAP組雖然肝臟損傷情況也呈進行性加重趨勢，但與APAP組相同時點進行比較發(fā)現(xiàn)，LPS＋APAP組肝臟受損情況明顯改善，24 h壞死面積僅為28．44%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．01）。

2．4 LPS對小鼠肝臟GSH的影響通過時點效應(yīng)關(guān)系實驗，對不同時點小鼠肝臟組織的GSH含量進行測定后發(fā)現(xiàn)，LPS＋APAP組0 h時點GSH含量為（0．90±0．15）μmol／g，APAP組0 h為（0．92± 0．20）μmol／g，差異無統(tǒng)計學意義，提示單純給予LPS對肝臟GSH含量沒有影響。但是在給予APAP 0．5 h時，兩組GSH濃度都迅速下降至谷值，APAP組（0．36±0．21）μmol／g，LPS＋APAP組（0．37± 0．17）μmol／g，差異無統(tǒng)計學意義，但同APAP 0 h相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．01）。之后，兩組的GSH含量逐漸升高恢復(fù)。見圖4。

3 討論

APAP是非甾體解熱鎮(zhèn)痛藥的代表性藥物，由于其能夠抑制前列腺素（prostaglandin，PG）的合成而具有退熱，緩解輕、中度疼痛的作用，臨床上主要用于發(fā)熱、關(guān)節(jié)痛、神經(jīng)痛等。近年來，伴隨著藥物的廣泛應(yīng)用，因APAP過量或長期使用而導致的ALJ事件的發(fā)生率呈逐年增長的趨勢。據(jù)統(tǒng)計APAP相關(guān)的急性肝衰竭發(fā)生率已達42%，由此引發(fā)了嚴重的公共健康安全問題［3，11］。因此，建立APAP急性肝損傷模型，研究其毒性機制，具有極其重要的意義。

本研究中，選取了ICR雄鼠作為實驗動物，給藥前予以禁食處理，排除了攝取食物對小鼠GSH合成及貯備的影響［12］。給藥方案設(shè)定為腹腔注射中等劑量的APAP 300 mg／kg，結(jié)果在生存曲線試驗中72 h小鼠存活率為50%，同時與APAP 0 h相比，小鼠ALT、病理組織學、壞死面積比例等肝損傷指標呈明顯的時間效應(yīng)關(guān)系，表明過量APAP能引發(fā)小鼠肝功能降低、炎癥反應(yīng)甚至肝壞死。

通過生存曲線實驗發(fā)現(xiàn)，給藥后APAP組小鼠精神狀態(tài)持續(xù)萎靡、活動量減少，而LPS＋APAP組小鼠的精神狀態(tài)、活動量要明顯優(yōu)于APAP組，持續(xù)觀察72 h，APAP組存活率為50%，而LPS＋APAP組則無死亡情況出現(xiàn)，表明低劑量LPS預(yù)處理能顯著提高小鼠的存活率。另一方面，在給藥后，APAP組與LPS＋APAP組在血清ALT值、病理組織學等肝損傷指標方面都有隨著APAP作用時間的延長而逐漸升高或加重的趨勢，但是LPS預(yù)處理組損傷程度要明顯輕于APAP組，顯示低劑量LPS預(yù)處理能顯著減輕APAP所致ALJ。

而APAP的毒性與其代謝產(chǎn)物相關(guān)，正常劑量下，只有少量的APAP通過Ⅰ相代謝，經(jīng)肝臟細胞色素P450（cytochromeP450，CYP450）系統(tǒng)（CYP2E1、1A2、3A4）氧化生成親電子高活性代謝產(chǎn)物NAPQI，并與肝內(nèi)具有還原性的谷胱甘肽（GSH）進一步結(jié)合生成水溶無毒性的APAP谷胱甘肽結(jié)合物由腎臟排出。但當機體攝入過量的APAP時，剩余的APAP會生成大量高活性代謝產(chǎn)物NAPQI。過量的NAPQI會耗竭肝細胞內(nèi)能與其結(jié)合形成共價產(chǎn)物的GSH，當GSH消耗70%～80%左右時，剩余的NAPQI則與細胞膜分子反應(yīng)，進而導致氧化應(yīng)激反應(yīng)、線粒體異常和DNA損傷等，造成ALJ甚至壞死［4－5］。

氧化應(yīng)激最早被認為APAP肝毒性的重要機制之一。研究［12］表明，GSH耗竭后，導致細胞內(nèi)過氧化物含量的增加，并與亞鐵離子發(fā)生氧化還原反應(yīng)生成高活性羥基自由基（芬頓機制），氧化脂質(zhì)，導致脂質(zhì)和蛋白質(zhì)、核酸過氧化。此外，還有研究［13－14］表明一氧化氮及誘導型一氧化氮合酶也參與了APAP的氧化應(yīng)激。線粒體通透性（mitochondrial permeability transition，MPT）改變是APAP肝毒性的另一個重要機制［15］，氧化劑促進MPT，體內(nèi)超氧化物水平增高，鈣穩(wěn)態(tài)改變。伴隨膜通透性的改變，線粒體腫脹，減少ATP合成。另有研究［16］報道炎性因子的激活，JNK信號通路也都參與了APAP的毒性作用機制。

為了探究LPS是否通過減弱NAPQI耗竭GSH而發(fā)揮減輕肝毒性的作用，筆者對小鼠肝臟組織GSH的含量進行了測定，結(jié)果顯示兩組小鼠都產(chǎn)生了GSH的耗竭，表明LPS預(yù)處理對小鼠肝臟GSH含量沒有影響，提示其可能不是通過抑制APAP的代謝而產(chǎn)生的作用。LPS預(yù)處理產(chǎn)生的這種效應(yīng)可能與其激活了機體的免疫應(yīng)答，抑制了GSH耗竭的下游機制有關(guān)。

綜上所述，低劑量LPS預(yù)處理能顯著減輕APAP引起的ALJ，這種作用不是通過減弱NAPQI耗竭GSH而產(chǎn)生的，可能與其激活了機體的免疫應(yīng)答，抑制了GSH耗竭的下游機制有關(guān)。

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Lipopolysaccharides pretreatment reduces
acetaminophen-induced acute liver injury in mice

Xu Yuanbao1，2，Xu Dexiang1，Zhang Cheng1，et al

（1Dept of Toxicology，Anhui Medical University，Hefei 230032；2Dept of Pharmacy，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

ObjectiveTo establish an animal model of APAP-induced acute liver injury in mice，and investigate the protective effect of acute liver injury caused by APAP on the low-dose LPS pretreatment．Methods ①20 ICR male mice were randomly divided into APAP group and LPS＋APAP group．APAP group was injected APAP（300 mg／kg）；LPS＋APAP group was injected intraperitoneally LPS（50 μg／kg），3 h later giving APAP（300 mg／kg）．After administration，the mice survival situation was closely observed，72 h later，biochemical indicator was measured．②ICR male mice were randomly divided into APAP 0，0．5，6，12，24，72 h groups and LPS＋APAP 0，0．5，6，12，24，72 h groups．APAP group was intraperitoneally injected with APAP（300 mg／kg）；LPS＋APAP group was injected with LPS（50 μg／kg）3 h before APAP（300 mg／kg）．After administration，serum ALT and other indicator were measured at the corresponding time point．Results ①The survival rate of APAP group was 50%within 72 h；while LPS＋APAP group had no deaths．②Low-dose LPS pretreatment could reduce serum ALT（P＜0．05），reducing liver necrosis（P＜0．01）．③APAP group and LPS＋APAP group liver GSH content differences were not statistically significant．Conclusion Low-dose LPS pretreatment could significantly reduce the APAP-induced acute liver injury．Low-dose LPS pretreatment could not reduce GSH depletion，it may activate the body＇s immune response，and inhibit the downstream mechanisms of GSH depletion．

lipopolysaccharides；acetaminophen；acute liver injury；glutathione

R 971．1

A

1000－1492（2015）03－0310－05

2015－01－16接收

國家自然科學基金（編號：81373495，81172711）

1安徽醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院衛(wèi)生毒理學系，合肥230032

2安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院藥劑科，合肥 230022

許元寶，男，碩士研究生；徐德祥，男，教授，博士生導師，責任作者，E-mail：xudex＠126．com