王亞男，彭成鳳，2，甄毅嵐，董六一

◇藥學研究◇

注射用牡荊素與葛根素注射液抗大鼠心肌缺血／再灌注損傷量效關系的研究

王亞男1，彭成鳳1，2，甄毅嵐1，董六一1

目的研究牡荊素和葛根素對治療實驗性缺血再灌注大鼠心肌損傷的量效關系，探討在抗心肌缺血再灌注損傷（MIRI）方面更為優(yōu)效的治療藥物方法通過結扎大鼠左冠狀動脈前降支建立MIRI模型，分別尾靜脈注射給予5個劑量的注射用牡荊素（0．75、1．5、3、6、12 mg／kg）和葛根素注射液（3、6、12、24、48 mg／kg），記錄大鼠各時期心電圖ST段的變化，TTC染色檢測大鼠心肌梗死面積，同時根據心肌梗死抑制率繪制量效曲線圖，計算半數(shù)有效量（ED50）和95%可信區(qū)間（95%CI）結果與MIRI組比較，注射用牡荊素組在0．75～12 mg／kg劑量范圍內及葛根素注射液組在3～48 mg／kg劑量范圍對抑制大鼠心電圖ST抬高、減小心肌梗死面積均呈劑量依賴性；注射用牡荊素和葛根素注射液對MIRI大鼠心肌梗死抑制作用的ED50分別為5．321 mg／kg和32．950 mg／kg，95%CI分別為4．294～6．593 mg／kg和24．690～43．970 mg／kg結論注射用牡荊素對MIRI大鼠心肌梗死抑制率的ED50明顯低于葛根素注射液，提示注射用牡荊素在防治MIRI方面可能是更為優(yōu)效的藥物。

牡荊素；葛根素；心肌缺血再灌注損傷；量效關系；半數(shù)有效量

目前，對急性心肌梗死的治療是以梗死相關血管的早期再灌注為主［1］。隨著梗死血管的再通，缺血心肌重新得到血流灌注，但同時并發(fā)心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia／reperfusion injury，MIRI）［2］，加重患者的病情和預后。葛根素是從葛根中提取的黃酮類主要活性成分，具有抗氧化、抑制血栓形成、擴張冠脈血管及改善缺血心肌代謝等抗MIRI的保護作用［3］，現(xiàn)已廣泛應用于臨床，療效較確切。牡荊素是從山楂葉中提取的黃酮類有效成分，研究［4－6］表明牡荊素具有抗氧化、對抗心肌肥厚和抑制血小板聚集等作用。此外，前期研究［7－9］顯示，牡荊素對離體或在體大鼠MIRI具有良好的保護作用，同時對犬急性心肌缺血也具有保護作用。雖然牡荊素和葛根素對MIRI均有保護作用，但是對兩者在缺血心肌保護作用的量效關系比較方面尚無系統(tǒng)研究。該研究通過建立大鼠在體MIRI模型，首次觀察注射用牡荊素與葛根素注射液對MIRI大鼠心肌梗死抑制率及其量效關系的影響。

1 材料與方法

1．1 實驗動物SPF級SD大鼠，由安徽醫(yī)科大學省級實驗動物中心提供，230～250 g，雌雄各半。于（22±3）℃、40%～70%濕度范圍下飼養(yǎng)，照明周期：12 h明／12 h暗。

1．2 藥物與試劑注射用牡荊素（規(guī)格：30 mg／瓶，批號：20121216，純度：99．5%，合肥七星醫(yī)藥科技有限公司，常溫下保存，臨用前用生理鹽水稀釋至所需濃度）；葛根素注射液（規(guī)格：2 ml／0．1 g，批號：20120709，北京四環(huán)科寶制藥有限公司，常溫下保存，臨用前用生理鹽水稀釋成所需濃度）；水合氯醛（批號：20110322，上海白鶴化工廠）；TTC染料（批號：T8877，美國Sigma公司）；伊文思藍（批號：WC20050331，國藥集團化學試劑有限公司）；其他試劑均為分析純。

1．3 儀器與設備HX-200動物呼吸機、BL-420E生物機能實驗系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）；恒溫電熱水浴鍋（上海醫(yī)療器械廠）；JA1203A電子天平（上海精天電子儀器有限公司）；動物天平（上海友聲衡器有限公司）；MDF-192型超低溫冰箱（日本三洋公司）；D300s單反相機（日本尼康公司）。

1．4 實驗方法

1．4．1 大鼠在體MIRI模型的建立［10］大鼠稱重后，用10%水合氯醛腹腔麻醉，取仰臥位固定。將電極插入大鼠四肢皮下，通過BL-420E生物機能實驗系統(tǒng)連續(xù)記錄心電圖。于頸部正中切開皮膚，鈍性分離皮下組織和肌肉并切開氣管連接到動物呼吸機上（呼吸時比為1．5∶1．0，60次／min，潮氣量20 ml）。于左鎖骨中線切開大鼠皮膚，分離皮下組織及肌肉，在左第3、4肋骨間開胸，暴露心臟，打開心包膜，用6-0無損傷縫線在肺動脈圓錐左緣與左心耳下緣2 mm處輕輕進針經淺層心肌穿出，使左冠狀動脈前降支位于其上，套上雙層塑料套管，收緊扎線使前降支閉塞致急性心肌缺血。觀察大鼠心電圖出現(xiàn)R波增寬、ST段明顯抬高及心臟局部紫紺，則視為心肌缺血。缺血30 min后抽出內層套管并松開線結，恢復前降支的血流即再灌注60 min。假手術組在實驗中只穿線不結扎。

1．4．2 實驗分組 將大鼠完全隨機分為假手術組、MIRI組、注射用牡荊素5個劑量組（0．75、1．5、3、6、12 mg／kg）和葛根素注射液5個劑量組（3、6、12、24、48 mg／kg），每組10只。注射用牡荊素和葛根素注射液均于結扎冠狀動脈5 min后和再灌注時給藥，給藥容積為5 ml／kg（尾靜脈注射，分兩次給藥，每組總給藥量不變），假手術組和MIRI組給等量的生理鹽水。

1．4．3 心電圖監(jiān)測 在整個實驗過程中，通過BL-420E生物機能實驗系統(tǒng)連續(xù)記錄大鼠心電圖（Ⅱ導聯(lián)）。比較各組大鼠基礎狀態(tài)、缺血30 min和再灌注60 min的心電圖ST段變化。

1．4．4 心肌梗死面積測定 于再灌注60 min后再次結扎大鼠冠狀動脈前降支，并立刻取出心臟，清除心腔內的淤血，經主動脈向心腔內注入0．25%伊文思藍溶液，置于－80℃冰箱凍存。取出冷凍的心臟，從心尖到心基部將心臟平行切成5片2 mm的小片。用1%TTC（pH 7．4）溶液在37℃下溫孵15 min，再用10%福爾馬林固定后拍照。梗死區(qū)（infarction size，IS）的心肌為白色，缺血危險區(qū)（area at risk，AAR）的心肌為紅色，IS和AAR的面積計算通過圖象分析軟件完成，用IS／AAR來表示心肌梗死面積。

1．4．5 心肌梗死抑制率和半數(shù)有效量（median effective dose，ED50）計算 心肌梗死抑制率（%）＝（MIRI組大鼠IS／AAR平均值－給藥組大鼠IS／AAR平均值）／MIRI組大鼠IS／AAR平均值× 100%，根據心肌梗死抑制率繪制葛根素和牡荊素的量效關系曲線。采用GraphPad Prism 5軟件系統(tǒng)，以心肌梗死抑制率和給藥劑量的對數(shù)值計算ED50及95%CI。

1．5 統(tǒng)計學處理采用SPSS 15．0統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據以±s表示，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），注射用牡荊素和葛根素注射液的ED50采用t檢驗比較。

2 結果

2．1 注射用牡荊素和葛根素注射液靜脈給藥對MIRI大鼠心電圖的影響各組在缺血30 min及再灌注60 min時心電圖ST段變化（ΔST）差異有統(tǒng)計學意義（F30min＝7．81，F(xiàn)60min＝9．27；P＜0．01）。其中，假手術組大鼠在整個實驗的各時間點心電圖ST段無明顯變化。與假手術組比較，MIRI組的缺血30 min和再灌60 min的心電圖ST段明顯抬高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．01）。與MIRI組比較，注射用牡荊素1．5、3、6、12 mg／kg組和葛根素注射液24、48 mg／kg組的缺血30 min和再灌60 min的心電圖ST段有所降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．01，P＜0．05），但仍然高于各組基礎值。見表1。

表1 注射用牡荊素及葛根素注射液對MIRI大鼠心電圖的影響（n＝10，±s）

與假手術組比較：＃＃P＜0．01；與MIRI組比較：*P＜0．05，**P＜0．01

組別劑量（mg／kg）ΔST（mV）基礎值缺血30 min再灌注60 min假手術－0．072±0．0150．092±0．0330．092±0．027 MIRI－0．089±0．0330．285±0．062＃＃0．308±0．070＃＃注射用牡荊素0．750．085±0．0330．269±0．0740．279±0．076 1．50．089±0．0180．232±0．0680．249±0．051*30．090±0．0360．210±0．053**0．232±0．054*60．083±0．0200．169±0．035**0．195±0．071**120．080±0．0170．153±0．040**0．161±0．051**葛根素注射液30．094±0．0380．260±0．0700．284±0．071 60．083±0．0360．250±0．0820．258±0．057 120．090±0．0360．236±0．0880．248±0．082 240．086±0．0300．204±0．074*0．232±0．065*480．087±0．0250．176±0．050**0．191±0．050**

2．2 注射用牡荊素和葛根素注射液靜脈給藥對MIRI大鼠IS／AAR的影響注射用牡荊素各組和葛根素注射液各組MIRI大鼠心肌組織TTC染色圖片。見圖1、2。經圖像分析軟件及方差分析處理后可知，各組IS／AAR差異有統(tǒng)計學意義（F＝34．76，P＜0．01）。MIRI組大鼠IS／AAR相比于假手術組顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．01）。注射用牡荊素1．5、3、6、12 mg／kg 4個劑量組的IS／AAR相比于MIRI組顯著減小，其中12 mg／kg組大鼠心肌梗死范圍較MIRI組降低了63．43%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．01）。葛根素注射液6、12、24、48 mg／kg 4個劑量組的IS／AAR相比于MIRI組減小明顯，其中48 mg／kg組大鼠心肌梗死范圍較MIRI組降低了54．90%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．01）。見表2。

表2 注射用牡荊素和葛根素注射液對MIRI大鼠IS／AAR的影響（n＝10，±s）

與假手術組比較：＃＃P＜0．01；與MIRI組比較：*P＜0．05，**P＜0．01

組別劑量（mg／kg）IS／AAR（%）假手術－0 MIRI－35．72±5．73＃＃注射用牡荊素0．7529．89±6．95 1．525．36±4．59**3 22．18±4．92**6 16．15±3．39**1213．06±3．79**葛根素注射液331．86±6．16 6 28．95±5．75*1224．52±6．56**2418．97±5．62**4816．11±5．78**

2．3 注射用牡荊素和葛根素注射液靜脈給藥對MIRI大鼠心肌梗死抑制作用的量效關系及對比分析 通過計算心肌梗死的抑制率得出，6 mg／kg注射用牡荊素與48 mg／kg葛根素注射液的心肌梗死抑制率分別為54．79%和54．90%，藥效基本相當；3 mg／kg注射用牡荊素與12 mg／kg葛根素注射液的心肌梗死的抑制率分別為37．91%和31．35%，藥效基本相當。根據牡荊素和葛根素對心肌梗死抑制率的量效關系曲線圖，計算注射用牡荊素對心肌梗死抑制率的ED50為5．321 mg／kg，95%CI為4．294～6．593 mg／kg；葛根素注射液對心肌梗死抑制率的ED50為32．950 mg／kg，95%CI為24．690～43．970 mg／kg。通過顯著性檢驗比較注射用牡荊素和葛根素注射液的ED50，結果顯示注射用牡荊素對MIRI大鼠心肌梗死抑制作用的ED50明顯低于葛根素注射液的ED50（t＝5．84，P＜0．05）。見圖3。

3 討論

MIRI是指心肌在缺血的基礎上恢復血流灌注后，組織損傷反而進行性加重的現(xiàn)象［2］。通過結扎大鼠左冠狀動脈前降支而造成的心肌缺血是目前應用最廣的首選動物模型。該模型與急性心肌梗死患者的血流動力學和心肌代謝的改變等有著相似之處，且通過心電圖和梗死心肌面積的測定較易確定心肌梗死的范圍和損傷程度。本研究顯示，在大鼠MIRI模型的基礎上，注射用牡荊素與葛根素注射液均可抑制MIRI大鼠心電圖ST段抬高，并可減小心肌梗死范圍。其中，注射用牡荊素在0．75～12 mg／kg劑量范圍內，對MIRI大鼠心肌梗死范圍的抑制作用呈現(xiàn)明顯劑量依賴效應。葛根素注射液在3～48 mg／kg劑量范圍內，對MIRI大鼠心肌梗死范圍的抑制作用也呈現(xiàn)一定的量效關系。

牡荊素和葛根素均是從中藥材中提取的黃酮類化合物單體，關于牡荊素和葛根素對實驗性MIRI的保護作用已有較多研究。本課題組前期藥效學研究［8－9，11］顯示，在抗MIRI療效方面，在不同動物模型上低劑量的牡荊素即可達到相對較高劑量的葛根素的治療效應。而在本研究中，通過分別考察5個不同劑量組的注射用牡荊素和葛根素注射液對MIRI大鼠心肌梗死抑制率的影響，發(fā)現(xiàn)兩者在抗MIRI時療效差異較大。1．5 mg／kg注射用牡荊素與12 mg／kg葛根素注射液，6 mg／kg注射用牡荊素與48 mg／kg葛根素注射液可達到的心肌梗死抑制率分別為29．00%和31．35%，54．79%和54．90%。即在相當?shù)闹委熜Ч?，牡荊素的給藥劑量均低于葛根素，與前期藥效學研究［8－9，11］結果一致。出現(xiàn)這種療效差異的原因可能與兩者的植物來源、化學結構差異以及作用機制不同等有關。有關牡荊素抗心肌缺血再灌注損傷的作用機制有待進一步的深入研究。

ED50是指能引起50%的受試對象出現(xiàn)陽性反應時的藥物劑量，其是藥理學研究、毒理學研究以及食品安全性評價中的常用指標。在藥理學研究中，ED50的值越小則表明藥物安全度越高，常與半數(shù)致死量結合以評價藥物的相對安全性。本研究中，注射用牡荊素和葛根素注射液對MIRI大鼠心肌梗死抑制率的ED50分別為5．321 mg／kg和32．950 mg／kg。即當兩者對MIRI大鼠心肌梗死抑制率同為50%時，注射用牡荊素的給藥劑量明顯低于葛根素注射液的劑量，這表明在改善MIRI方面注射用牡荊素可能比葛根素注射液相對更為安全有效。

綜上所述，注射用牡荊素與葛根素注射液均可降低MIRI大鼠心肌梗死范圍，注射用牡荊素的ED50約為葛根素注射液的1／6，明顯低于葛根素注射液，提示注射用牡荊素可能在防治MIRI方面是更為優(yōu)效的藥物。

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A study of dose-effect relationship between vitexin and puerarin injections on myocardial ischemia／reperfusion injury in rats

Wang Yanan1，Peng Chengfeng1，2，Zhen Yilan1，et al
（1Dept of Pharmacology，Anhui Medical University，Hefei 230032；2Dept of Cardiology，Lu’an Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Lu’an 237000）

ObjectiveTo investigate the dose-effect relationship of vitexin and puerarin in the rat models with myocardial ischemia／reperfusion injury（MIRI），and explore the more effective treatment drugs in the aspects of MIRI．Methods The model of MIRI was carried out by ligation of left anterior descending coronary artery in rats．Five doses of vitexin（0．75，1．5，3，6，12 mg／kg）and puerarin（3，6，12，24，48 mg／kg）were administered via tailvein．The changes of ST-segment at different time and the infarct size of rat heart were determined by electrocardiogram and TTC staining，respectively．Draw the dose-effect curve based on the inhibition rate of myocardial infarction．Then，the median effective dose（ED50）and 95%confidence interval（95%CI）of vitexin and puerarin were calculated．Results Compared with MIRI group，vitexin within 0．75～12 mg／kg dose range and puerarin within 3～48 mg／kg dose range could inhibit the ST-segment elevation，reduce myocardial infarct size in a dose-dependent manner．ED50of vitexin and puerarin inhibition the rate of myocardial infarction were respectively 5．321 mg／kg and 32．950 mg／kg in the rat model with MIRI，95%CI were respectively 4．294～6．593 mg／kg and 24．690～43．970 mg／kg．Conclusion ED50of vitexin inhibition the rate of myocardial infarction was significantly lower than puerarin．It suggests that vitexin is probably more effective in the rat model with MIRI than puerarin．

vitexin；puerarin；myocardial ischemia／reperfusion injury；dose-effect relationship；ED50

R 286．2

A

1000－1492（2015）03－0314－05

2014－10－06接收

國家自然科學基金（編號：81470432）

1安徽醫(yī)科大學藥理學教研室，合肥 230032

2安徽醫(yī)科大學附屬六安醫(yī)院心血管內科，六安 237000

王亞男，女，碩士研究生；董六一，男，教授，碩士生導師，責任作者，E-mail：dongly＠ahmu．edu．cn