汪嘉佳，陶莉莉，潘 瑩，王會平，晏開力，張家奎，倪合宇，翟志敏

◇臨床醫(yī)學研究◇

流式細胞術檢測血小板脫糖方法建立及意義

汪嘉佳1，陶莉莉1，潘 瑩1，王會平1，晏開力1，張家奎1，倪合宇2，翟志敏1

目的通過運用流式細胞術檢測正常人血小板在4、25℃下，0、4、8、24 h各個時間點，血小板脫糖的兩個標志物蓖麻凝集素（RCA）、雞冠刺桐凝集素（ECL）是否有所差異，確立運用流式細胞術檢測血小板脫糖水平的最佳條件。確立最佳條件后，運用流式細胞術檢測20例原發(fā)免疫性血小板減少癥（ITP）患者的血小板脫糖水平方法隨機選取正常成年人20例，運用多參數(shù)流式細胞術檢測正常成年人不同溫度（4、25℃），不同時間點（0、4、8、24 h）條件下血小板脫糖水平（RCA、ECL）是否存在差異。確立最佳條件后，運用流式細胞術檢測20例ITP患者血小板脫糖水平結果4、25℃下，4個時間點脫糖水平RCA%、ECL%均不明顯。常規(guī)治療效果較好的ITP患者脫糖水平RCA%、ECL%不明顯，但是治療效果不好的ITP患者脫糖水平RCA%、ECL%明顯高于治療效果理想的患者結論流式細胞術檢測血小板脫糖水平最好在標本收集后立即處理，脫糖水平（RCA、ECL）與ITP患者治療效果有關，即脫糖水平越低其治療效果越好。

血小板脫糖；原發(fā)免疫性血小板減少癥；RCA；ECL；流式細胞術

原發(fā)免疫血小板減少癥（autoimmune thrombocytopenia，ITP）是一種由體液免疫和細胞免疫共同介導的，以血小板破壞增加，骨髓中巨核細胞成熟障礙和血小板生成異常為特點的一種自身免疫性疾病，約占出血疾病的30%［1］。一直以來，研究者都認為ITP中血小板被清除主要是依靠FC受體途徑，脾臟被認為是血小板清除的主要場所［2］。但目前研究［3－5］表明在小鼠體內(nèi)，血小板清除可以通過非FC受體途徑，即血小板膜上糖蛋白發(fā)生脫糖，這些去糖蛋白通過肝臟庫普弗細胞以及肝細胞去唾液酸糖蛋白受體被清除。脫糖是指血小板膜上的糖蛋白在神經(jīng)酰胺酶作用下脫糖而暴露乙酰葡糖胺、半乳糖等殘基，雞冠刺桐凝集素（erythrina cristagalli lectin，ECL）可以標記半乳糖，蓖麻凝集素（ricinus communis agglutinin，RCA）可以標記乙酰葡糖胺［3－4，6］。該實驗利用檢測血小板在不同溫度（4、25℃），不同時間點是否脫糖及是否有區(qū)別，建立最佳血小板脫糖檢測條件。通過檢測20例ITP血小板脫糖水平，來分析血小板脫糖水平對于ITP的臨床意義。

1．1 實驗對象隨機選擇安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院體檢中心正常成年者20例，其中男10例，女10例，年齡19～65（30±9）歲，按照4、25℃分為2組，每個組中按照時間點（0、4、8、24 h）再次分組，命名為正常對照組4、25℃0、4、8、24 h 8組，運用流式細胞術檢測8組血小板脫糖水平（RCA、ECL）。同時收集ITP 20例，按照常規(guī)治療后血小板是否恢復正常，命名為治療有效、治療無效兩組，運用流式細胞術分別檢測20例ITP患者血小板脫糖水平（RCA、ECL）。

1．2 主要試劑與儀器RCA（克隆號為FL-1081）、ECL（克隆號為FL-1141）均購自美國Vector Laboratories公司；藻紅蛋白（PE）標記的CD42b單抗（克隆號為SZ2）、異硫氰酸熒光素（FITC）標記的山羊抗兔IgG單抗（克隆號為ZF-0311）均購自美國Beckman-Coulter公司；前列環(huán)素（克隆號為18220）購自美國Cayman Chemical公司；HEPES溶液（140 mmol／L NaCl、3 mmol／L KCl、0．5 mmol／L MgCl2、10 mmol／L HEPES、10 mmol／L glucose、0．5 mmol／L NaHCO3，pH＝7．4）、ACD溶液（2．5%檸檬酸三鈉、1．5%檸檬酸和2%D-葡萄糖），以及陰性對照試劑；流式細胞儀為FC500-MCL，熒光激發(fā)光波長為488 nm和633 nm，分析系統(tǒng)軟件為CXP系統(tǒng)，購自美國Beckman-Coulter公司。

1．3 檢測方法①離心血小板及標記抗體：首先將正常人外周血2 ml放置于枸櫞酸鈉管中并且加入2 μl前列環(huán)素（濃度為10 μg／ml），946 r／min離心15 min，運用微量移液器取得高濃度血小板血漿，加入ACD（量為1／10 PRP）保存血小板，再次1 360 r／min離心15 min，制備血小板完畢后，用HEPES溶液（pH＝6．5）調(diào)制PRP，保證血小板濃度為200× 109／L。取調(diào)制后血小板50 μl，標記單抗CD42b（2．5 μl）及檢測脫糖試劑（ECL／RCA 2．5 μl），孵育20 min。后加入HEPES溶液（pH＝7．4）到500 μl用流式細胞儀檢測脫糖水平（ECL、RCA），在此之前先同份標本進行陰性對照確定流式細胞儀界值。②在不同溫度（4、25℃），不同時間點（0、4、8、24 h）條件下依照上述步驟檢測血小板脫糖。③在上述確立最佳條件后，運用流式細胞術分別檢測20例患者的血小板脫糖水平（RCA、ECL）。④檢測前常規(guī)對流式細胞儀進行光流路質(zhì)量調(diào)控和熒光補償，使儀器各項指標在質(zhì)量控制允許值范圍。檢測時首先根據(jù)前向（forward scatter，F(xiàn)SC）和側向（side scatter，SSC）散射光信號對有核細胞群進行設門，每份標本獲取設門內(nèi)血小板約10 000個，檢測后數(shù)據(jù)以Listmode文件形式保存。

1．4 統(tǒng)計學處理采用SPSS 17．0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以中位數(shù)（P25，P75）表示，兩組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗方法分析，兩組以上采用Kruskal-Wallis秩和檢驗方法分析。

2 結果

2．1 血小板脫糖水平（RCA、ECL）在流式細胞儀上的表達運用陰性對照以及空白對照確立正常人臨界值（圖未給出）。確立好方案后，正常對照組血小板不發(fā)生脫糖，RCA%、ECL%均為0。見圖1。ITP患者血小板發(fā)生脫糖，RCA%為68．3%，ECL%為20．9%；CD42b與RCA共陽性為53．2%，CD42b與ECL共陽性為15．6%。見圖2。

2．2 正常組血小板在4℃條件下所有時間點脫糖水平（RCA、ECL）比較在4℃條件下，各時間點血小板脫糖水平RCA%、ECL%值見表1、2。運用Kruskal-Wallis秩和檢驗分別檢測4個時間點下脫糖水平RCA%、ECL%，差異均有統(tǒng)計學意義（P＝0．032，P＝0．016）。即4個時間點下脫糖水平RCA、ECL均分別有差異。進一步在4℃條件下，運用Wilcoxon秩和檢驗進行時間點兩兩相互比較，24 h脫糖水平RCA%分別與0 h脫糖水平RCA%、4 h點脫糖水平RCA%、8 h點脫糖水平RCA%相互比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）。而其他相互比較時，差異均無統(tǒng)計學意義。24 h點脫糖水平ECL%分別與0 h點ECL%、4 h點ECL%、8 h點ECL%比較時，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）。而其他兩兩比較，差異均無統(tǒng)計學意義。

2．3 正常組血小板在25℃條件下所有時間點脫糖水平（RCA、ECL）比較在25℃條件下，各時間點血小板脫糖水平RCA%、ECL%值見表1、2。運用Kruskal-Wallis秩和檢驗檢測，差異均無統(tǒng)計學意義（P＝0．301，P＝0．632）。即4個時間點下脫糖水平RCA、ECL均無差異。進一步在25℃條件下，運用Wilcoxon秩和檢驗分別進行血小板脫糖水平RCA%、ECL%4個時間點兩兩相互比較，差異均無統(tǒng)計學意義。

2．4 正常組血小板不同溫度、相同時間點下脫糖水平（RCA、ECL）比較在不同溫度下，運用Wilcoxon秩和檢驗檢測相同時間點脫糖水平（RCA／ECL）是否存在差異，首先分析RCA，4℃條件下4 h與25℃條件下4 h相互比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＝0．005）。4℃條件下8 h與25℃條件下8 h相互比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＝0．046）。4℃條件下24 h與25℃條件下24 h相互比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＝0．080）。分析ECL，4℃條件下4 h與25℃條件下4 h相互比較，4℃條件下8 h與25℃條件下8 h相互比較，4℃條件下24 h與25℃條件下24 h相互比較，差異均無統(tǒng)計學意義。

2．5 運用流式細胞術檢測ITP患者血小板脫糖將20例ITP患者運用流式細胞術檢測血小板脫糖水平，見表3。其中常規(guī)治療后，治療有效組及治療無效組的血小板脫糖水平見表4。運用Wilcoxon秩和檢驗分析上述前后兩組RCA%，差異有統(tǒng)計學意義（P＝0．001）。上述前后兩組ECL%相互比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＝0．023）。

3 討論

血小板脫糖是指血小板膜表面上的糖蛋白在唾液酸酶作用下，暴露殘基。血小板脫糖是一種有別于既往依靠FC受體導致血小板破壞的新理論。已經(jīng)在哺乳動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)4種導致糖蛋白脫糖的神經(jīng)酰胺酶，且4種神經(jīng)酰胺酶中起主導作用的是NEU-1，一般這些酶通常位于血小板的內(nèi)部。當冷藏保存時能過“翻轉”作用，表達于血小板表面［4］。NEU-1主要作用于糖蛋白GPIb復合體，脫糖后的糖蛋白殘基，在肝臟細胞中被破壞［5］。這區(qū)別于以往的血小板在脾臟中破壞的理論。

為了使得檢測血小板脫糖水平誤差降到最低，本實驗主要研究最佳檢測血小板脫糖的實驗條件。之所以選擇4℃和25℃，主要是因為實驗標本大部分保存在2種溫度下。通過本實驗，該實驗表明4℃時候血小板的脫糖水平（RCA、ECL）在4個時間點條件下，存在差異，漸近增高。在25℃時，血小板脫糖水平（RCA、ECL）在4個時間點條件下無差異。在4℃條件下，4個時間點之間進一步相互兩兩比較，該實驗表明血小板標本立即檢測比其他3個時間點檢測時間更適宜，本實驗4℃條件下4個時間點之間相互兩兩比較，總體趨勢隨著時間推移脫糖水平增高。在25℃條件下，雖然脫糖水平（RCA、ECL）在4種時間點下均無差異，但是在各個時間點離心懸浮血小板上機檢測，可以表明隨著時間的推移血小板數(shù)目逐步減少，并且更容易在血小板中混有紅細胞干擾檢測。所以該實驗檢測血小板脫糖應在取得標本后立即檢測，標本保存干擾血小板的脫糖水平檢測。

在檢測ITP患者血小板脫糖水平（RCA／ECL）時，本實驗可檢測到ITP患者的脫糖水平呈陽性，本實驗運用CD42b標記血小板膜上的糖蛋白—GPIbα，但是CD42b與RCA／ECL共陽性只占ITP患者全部脫糖表達的一部分，RCA／ECL單陽性占其余部分。所以本實驗表明，區(qū)別如小鼠體內(nèi)血小板脫糖（主要針對糖蛋白GPIbα），人體內(nèi)血小板膜上糖蛋白脫糖不是主要針對GPIbα，膜上其它糖蛋白在脫糖過程中也起著主要作用。同時檢測20例ITP患者，比較治療過程、療效與脫糖水平之間是否有關系，可以證實脫糖水平越低，其療效越好，常規(guī)治療就能使得血小板恢復正常。所以本實驗表明血小板脫糖水平的檢測可以用來提示ITP患者的治療效果，為臨床醫(yī)師最初選擇治療方案提供參考［7］。同時血小板脫糖是一種有別于既往依靠FC受體導致血小板破壞的新理論，可以為今后研制治療難治性ITP患者的藥物帶來新的思路。本實驗將繼續(xù)研究人體內(nèi)血小板膜上其余糖蛋白參與血小板脫糖的過程，同時檢測其他血小板減少的患者是否也會出現(xiàn)血小板脫糖。

［1］ Watson Williams E J，Macpherson A I，Davidson S．The treatment of idiopathic thrombocytopenic purpura：a review of ninety-three cases［J］．Lancet，1958，2（7040）：221－6．

［2］ Hoffmeister K M，F(xiàn)elbinger T W，F(xiàn)alet H，et al．The clearance mechanism of chilled blood platelets［J］．Cell，2003，112（1），87－97．

［3］ Hoffmeister K M，Josefsson E C，Isaac N A，et al．Glycosylation restores survival of chilled blood platelets［J］．Science，2003，301（5639）：1531－4．

［4］ Jansen A J，Josefsson E C，Rumjantseva V，et al．Desialylation accelerates platelet clearance after refrigeration and initiates a metalloproteinase－mediated cleavage in mice［J］．Blood，2012，119（5）：1263－73．

［5］ Kaplan C．Toddy for chilled platelets？［J］．Blood，2012，119（5）：1100－2．

［6］ Li J，van der Wal D E，Zhu L，et al．Fc-independent phagocytosis：Implications for IVIG and other therapies in immune-mediated thrombocytopenia［J］．Cardiovasc Hematol Disord Drug Targets，2013，13（1）：50－8．

［7］ 秦 平，候 明．2012版成人原發(fā)免疫性血小板減少癥診治的中國專家共識解讀［J］．臨床血液學雜志，2013，26（3）：151－5．

The test method about desialylation of platelet to establish and its significance

Wang Jiajia，Tao Lili，Pan Ying，et al
（Dept of Hematology，The Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Bio-medical Research Center of Anhui Medical University，Hefei 230601）

ObjectiveTo detect desialylation of platelets in normal，and research influence about ricinus communis agglutinin（RCA）and erythrina cristagalli lectin（ECL）which are two factors of desialylation of platelets in different time periods（0，4，8，24 h）and different temperatures（4，25℃），thus establish the test method which can detect desialylation of platelets in autoimmune thrombocytopenia（ITP）．Methods 20 normal subjects were selected and researched for the differences about RCA and ECL which were two factors of desialyation of platelets in different time periods（0，4，8，24 h）and different temperatures（4，25℃）with flow cytometry．Under this condition，the best test method that could detect desialylation of platelets in 20 cases of ITP could be established in the end．Results The results showed that the median of the desialylation of platelets（RCA%and ECL%）was not significant in 4 periods under 4，25℃，respectively．The results showed that the median of the desialylation of platelets（RCA%and ECL%）in effective responses to conventional therapy（corticosteroids，IVIG etc）was lower than the group which were inferior responses to conventional therapy．Conclusion The test method about desialylation of platelets in ITP should be better to detect in one day．The desialylation of platelets（RCA，ECL）is interrelated with treatment of ITP．And the lower desialyation prompts better outcome in ITP which is effective response to conventional therapy．

platelet desialylation；autoimmune thrombocytopenia；RCA；ECL；flow cytometry

R 733．711

A

1000－1492（2015）03－0329－04

2014－12－10接收

國家自然科學基金（編號：81141104）；安徽高校省級自然科學研究重大項目（編號：KJ2014Z017）

1安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院血液內(nèi)科（安徽醫(yī)科大學血液病研究中心），合肥 230601

2加拿大多倫多大學實驗醫(yī)學與病理生物學系，加拿大M2J46A

汪嘉佳，男，碩士研究生；翟志敏，女，教授，主任醫(yī)師，博士生導師，責任作者，E-mail：zzzm889＠163．com