方繼紅，孫 軍，寧 波，李惠萍

發(fā)育性髖關(guān)節(jié)脫位患兒關(guān)節(jié)囊Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)量與術(shù)后關(guān)節(jié)功能康復(fù)的相關(guān)性研究

方繼紅1，2，孫 軍2，寧 波2，李惠萍1

目的探討發(fā)育性髖關(guān)節(jié)脫位（DDH）患兒關(guān)節(jié)囊中I、Ⅲ型膠原表達(dá)與術(shù)后關(guān)節(jié)功能康復(fù)的相關(guān)性，為術(shù)后關(guān)節(jié)功能鍛煉提供理論依據(jù)方法對(duì)160例2．5～3歲DDH患兒采用相似的術(shù)式，術(shù)后留取關(guān)節(jié)囊，對(duì)其中I、Ⅲ型膠原采用免疫組織化學(xué)和RT-PCR法進(jìn)行檢測(cè)，術(shù)后采用相同的功能鍛煉方法，術(shù)后6個(gè)月采用McKay進(jìn)行評(píng)分分組結(jié)果Ⅲ型膠原免疫組化和RT-PCR結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而Ⅰ型膠原在功能較差的患兒關(guān)節(jié)囊中表達(dá)明顯增高結(jié)論DDH患兒關(guān)節(jié)囊中I型膠原表達(dá)與術(shù)后關(guān)節(jié)功能恢復(fù)有相關(guān)性，I型膠原表達(dá)量高的患兒術(shù)后應(yīng)該加強(qiáng)功能鍛煉。

發(fā)育性髖關(guān)節(jié)脫位；膠原蛋白；功能鍛煉

發(fā)育性髖關(guān)節(jié)發(fā)育不良（developmental dysplasia of the hip，DDH）是小兒骨科的常見(jiàn)病。很多患兒進(jìn)行早期治療后，大部分得到相對(duì)穩(wěn)定正常的髖關(guān)節(jié)［1］。但對(duì)于18月以后診斷的及前期保守治療失敗的患兒，目前國(guó)內(nèi)外多數(shù)醫(yī)師推薦手術(shù)治療［2］。對(duì)于＞18個(gè)月采取手術(shù)治療的患兒，術(shù)后關(guān)節(jié)功能是主要考慮的問(wèn)題，Ⅰ、Ⅲ型膠原是關(guān)節(jié)囊的主要膠原成分，與關(guān)節(jié)功能密切相關(guān)［3］。同時(shí)術(shù)后功能鍛煉也是關(guān)節(jié)功能恢復(fù)的重要因素之一。該研究旨在通過(guò)檢測(cè)手術(shù)治療的DDH患兒關(guān)節(jié)囊內(nèi)Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)量，分析DDH患兒關(guān)節(jié)囊內(nèi)Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)量與術(shù)后關(guān)節(jié)功能康復(fù)的相關(guān)性，為患者實(shí)施有效的個(gè)體化康復(fù)訓(xùn)練提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 病例資料納入標(biāo)準(zhǔn)：從2010～2014年間，選取安徽省兒童醫(yī)院骨科行切開(kāi)復(fù)位＋關(guān)節(jié)囊成形＋骨盆截骨＋股骨短縮旋轉(zhuǎn)截骨＋石膏術(shù)的女性患兒160例，年齡2．5～3（2．7±0．3）歲，術(shù)前髖關(guān)節(jié)脫位程度在3°～4°，所有手術(shù)由2位副主任醫(yī)師及以上職稱醫(yī)師主刀。排除標(biāo)準(zhǔn)：病理性髖關(guān)節(jié)脫位、合并其他基礎(chǔ)疾病患兒及術(shù)后Severin放射線評(píng)分出現(xiàn)股骨頭壞死及再脫位的患兒。

1．2 研究方法

1．2．1 免疫組化 取所有患兒術(shù)中行關(guān)節(jié)囊緊縮切除的關(guān)節(jié)囊組織，將標(biāo)本在多聚甲醛液中室溫固定24 h，脫水、透明、石蠟包埋。每個(gè)標(biāo)本取有代表性的關(guān)節(jié)囊全層切面（厚度4 μm）切片。常規(guī)將切片脫蠟，PBS沖洗，檸檬酸鹽及微波進(jìn)行聯(lián)合抗原修復(fù)，0．3%過(guò)氧化氫封閉，PBS沖洗3次，每次5 min，羊血清封閉非特異性抗原，PBS沖洗3次，每次5 min，加入Ⅰ抗（兔抗人Ⅰ或Ⅲ型膠原蛋白抗體1∶200，北京博奧森公司），37℃孵育1 h，然后4℃過(guò)夜，PBS沖洗3次，每次5 min，加入Ⅱ抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司通用型二抗），37℃孵育30 min，PBS沖洗3次，每次5 min，最后用蘇木精復(fù)染，晾干后用中性樹(shù)膠封片，并在鏡下拍片存檔，每張切片在纖維層選擇5個(gè)不同的400倍視野，計(jì)數(shù)其中陽(yáng)性表現(xiàn)的成纖維細(xì)胞，并應(yīng)用軟件計(jì)算不同視野陽(yáng)性表達(dá)光密度，取5個(gè)不同視野的平均值。

1．2．2 RNA提取與qRT-PCR 深低溫保存的關(guān)節(jié)組織經(jīng)過(guò)研磨處理后，總組織和細(xì)胞的RNA通過(guò)使用TRIzol試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司）提示步驟進(jìn)行提取。提取的RNA純度和濃度用分光光度計(jì)測(cè)量光密度值，計(jì)算OD260／280來(lái)確定純度。瓊脂糖凝膠電泳，評(píng)價(jià)RNA的完整性。取1 μg總RNA，利用ReverTra Ace qPCR RT試劑盒（日本TOYOBO公司）逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，用分光光度計(jì)測(cè)量OD260／280來(lái)確定cDNA純度。利用SYBR Green Realtime PCR Masrer MiX試劑盒（日本TOYOBO公司）對(duì)cDNA進(jìn)行擴(kuò)增。Ⅰ型膠原上游引物5′-GGGAACATCCTCCTTCAACAG-3′，下游引物5′-GGAGCTGGCTACTTCTCGC-3′；Ⅲ型膠原上游引物5′-CAGATCACGTCATCGCACAAC-3′，下游引物5′-GAGGGCCAAGACGAAGACATC-3′結(jié)果用相對(duì)定量法（2－ΔΔCT）表示。

1．2．3 關(guān)節(jié)功能評(píng)分 圍手術(shù)期予以制定統(tǒng)一的功能康復(fù)方案，后期每?jī)芍軓?fù)診，并于術(shù)后半年根據(jù)Mckay（表1）臨床關(guān)節(jié)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)［4］及Severin（表2）放射線評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)［5］分為不同的等級(jí)。

1．2．4 功能鍛煉 在圍手術(shù)期為患兒制定詳細(xì)的功能鍛煉計(jì)劃：手術(shù)當(dāng)天麻醉清醒后即開(kāi)始讓患兒進(jìn)行足趾及踝關(guān)節(jié)活動(dòng)，術(shù)后2～3 d起當(dāng)患兒能耐受切口疼痛時(shí)鼓勵(lì)患兒主動(dòng)活動(dòng)足趾關(guān)節(jié)，主要為足趾背伸、跖屈活動(dòng)及股四頭肌收縮鍛煉；2～3次／d，每次30～60 min，鍛煉強(qiáng)度及時(shí)間逐漸增加。6周后拆除石膏，第7周，保持骨盆在水平位置，雙腿外展呈60°，指導(dǎo)患兒自仰臥坐起，上身挺直，屈髖90°，逐漸彎腰，用雙手觸碰足尖，達(dá)到鍛煉髖關(guān)節(jié)屈曲的目的，同時(shí)指導(dǎo)患兒屈膝、外展、內(nèi)收，4次／d，20～30 min／次。第8周，雙腿外展呈30°角方法同上。與此同時(shí)，可鼓勵(lì)患兒雙手交叉，手指越過(guò)足尖觸摸腳心。第9周，雙腿內(nèi)收至正常中立位，方法同上。由于患兒石膏固定已達(dá)6周，拆除石膏后很不適應(yīng)，康復(fù)鍛煉時(shí)非常疼痛，所以在康復(fù)鍛煉前給予熱毛巾濕敷關(guān)節(jié)30 min后再進(jìn)行鍛煉，也可與主管醫(yī)師一起給予髖關(guān)節(jié)手動(dòng)松解，即被動(dòng)活動(dòng)髖關(guān)節(jié)，將髖關(guān)節(jié)活動(dòng)范圍增大，大大減輕了因康復(fù)鍛煉給患兒帶來(lái)的痛苦。具體方法可在床尾正中系上長(zhǎng)條繃帶，繃帶上挽數(shù)個(gè)大結(jié)以利患兒抓握，也可做為目標(biāo)，逐漸握到更遠(yuǎn)的大結(jié)，達(dá)到鍛煉效果。同時(shí)為鼓勵(lì)患兒，在每個(gè)大結(jié)上放上孩子們感興趣的東西，比如糖果、小玩具等以作獎(jiǎng)勵(lì)，這樣可以提高患兒鍛煉的興趣，增強(qiáng)其信心。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 16．0軟件分析，結(jié)果資料采用方差分析檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2．1 不同關(guān)節(jié)功能的Ⅰ型膠原mRNA、免疫組化光密度比較根據(jù)McKay評(píng)分結(jié)果進(jìn)行分析（表3），總160髖中102髖術(shù)后關(guān)節(jié)功能評(píng)分為優(yōu)或良（優(yōu)良率為：63．7%）。在關(guān)節(jié)功能評(píng)分差的24髖中，Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)高的17髖，表達(dá)較低的和中間的分別為3髖和4髖。同時(shí)Ⅰ型膠原免疫組化光密度測(cè)定也得到相似的結(jié)果，在關(guān)節(jié)功能評(píng)分差的24髖中，平均光密度高的13髖，平均光密度值低和中間組分別為3髖和8髖。

2．2 不同關(guān)節(jié)功能Ⅰ型膠原免疫組化結(jié)果光學(xué)顯微鏡下觀察關(guān)節(jié)囊纖維層成纖維細(xì)胞胞核或基質(zhì)Ⅰ型膠原陽(yáng)性信號(hào)表達(dá)呈棕褐色或棕藍(lán)色，胞核深染，胞質(zhì)內(nèi)見(jiàn)波浪狀深染；Ⅲ型膠原陽(yáng)性信號(hào)表達(dá)較Ⅰ型膠原胞核染色淺主要分布在胞核周圍，在胞質(zhì)中呈細(xì)線狀。本研究中關(guān)節(jié)囊纖維層內(nèi)Ⅰ型膠原免疫組化表達(dá)（圖1）：纖維細(xì)胞排列分布不均、大小形態(tài)差異，基質(zhì)染色也存在明顯差異。本次研究DDH患兒髖關(guān)節(jié)囊免疫組化未見(jiàn)有Ⅲ型膠原陽(yáng)性染色。

2．3 各組間膠原表達(dá)量的結(jié)果比較Ⅰ型膠原免疫組化光密度檢測(cè)結(jié)果：術(shù)后關(guān)節(jié)功能McKay評(píng)分差的分組中Ⅰ型膠原的表達(dá)較其他組明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝42．273，P＜0．01）；Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)量結(jié)果：功能功能評(píng)分差的患兒Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)量較其他組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝52．282，P＜0．01）。通過(guò)RT-PCR檢測(cè)Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝3．313，P＞0．05）。見(jiàn)圖2。

3 討論

DDH在嬰幼兒呈現(xiàn)一種動(dòng)態(tài)的發(fā)育過(guò)程，可隨著年齡的增加而逐漸好轉(zhuǎn)或逐漸加重。隨著早期B超篩查的普及［6］，早期治療獲得很好療效，但大齡DDH的治療仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)，術(shù)后會(huì)出現(xiàn)多種并發(fā)癥［7－8］，主要包括：再脫位，術(shù)后再脫位發(fā)生率不高；股骨頭缺血性壞死；關(guān)節(jié)僵硬，發(fā)生率較高。Tukenmez et al［9］認(rèn)為產(chǎn)生髖關(guān)節(jié)僵直的原因是術(shù)中損傷、出血多、破壞髖臼及股骨頭軟骨，導(dǎo)致術(shù)后關(guān)節(jié)廣泛粘連，長(zhǎng)期固定髖關(guān)節(jié)及術(shù)后缺乏鍛煉等?；俭y固定不動(dòng)導(dǎo)致的關(guān)節(jié)囊及結(jié)締組織收縮變厚變硬，失去彈性在早期是可逆的，可通過(guò)關(guān)節(jié)活動(dòng)恢復(fù)功能［10］。但患兒因年幼不易掌握功能鍛煉方法，加上手術(shù)創(chuàng)傷引起的疼痛往往不愿鍛煉。為此制定詳細(xì)的術(shù)前術(shù)后康復(fù)訓(xùn)練計(jì)劃對(duì)術(shù)后髖關(guān)節(jié)功能康復(fù)有很大的幫助［11］。人類出生時(shí)髖臼較淺，股骨頭表面呈平滑的弧線，在隨后的生長(zhǎng)發(fā)育的過(guò)程中不斷的加深，股骨頭弧度加大，髖關(guān)節(jié)逐漸穩(wěn)定，而這需要頭臼同心的相互作用才能達(dá)到。而關(guān)節(jié)囊及周圍軟組織則具有保持這種頭臼同心的重要作用［3］。DDH關(guān)節(jié)囊的病理改變是DDH術(shù)后關(guān)節(jié)功能恢復(fù)的重要因素，既往研究［12－13］也表明髖關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)囊主要由Ⅰ型和Ⅲ型膠原構(gòu)成，Ⅰ型膠原是? 2～10 μm粗纖維，主要功能是抵抗外界的拉力；而Ⅲ型膠原是? 0．5～1．5 μm的細(xì)纖維，主要功能是保持延展性器官結(jié)構(gòu)，并提出了膠原分子含量及比例對(duì)結(jié)締組織生物學(xué)特征有很大的影響。1984年，Skirving et al［14］采用生化方法發(fā)現(xiàn)1～4歲DDH患兒關(guān)節(jié)囊中Ⅰ、Ⅲ型膠原比例異常，近年來(lái)國(guó)內(nèi)有研究從基因［3］（DNA及RNA）及分子水平［15］（膠原蛋白免疫組化分析）指出DDH患者關(guān)節(jié)囊內(nèi)的Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)量與正常兒童存在明顯差異。本研究采用相同年齡段進(jìn)行DDH手術(shù)患兒以去除年齡因素，手術(shù)主要由同級(jí)別兩位高年資醫(yī)師主刀，關(guān)節(jié)囊采用相同的標(biāo)準(zhǔn)的方法進(jìn)行處理，術(shù)后采用前述相同的標(biāo)準(zhǔn)的功能鍛煉方法，觀察關(guān)節(jié)功能恢復(fù)情況，本研究首次將關(guān)節(jié)囊Ⅰ型和Ⅲ型膠原表達(dá)情況與術(shù)后關(guān)節(jié)功能相聯(lián)系起來(lái)。

本研究顯示在DDH關(guān)節(jié)囊中Ⅰ型膠原表達(dá)有所不同，對(duì)術(shù)后6個(gè)月關(guān)節(jié)功能鍛煉后發(fā)現(xiàn)部分患兒功能欠佳（McKay標(biāo)準(zhǔn)），分析了其中Ⅰ型膠原的表達(dá)量，關(guān)節(jié)囊中Ⅰ型膠原表達(dá)高的患兒術(shù)后關(guān)節(jié)功能較差。Ⅲ型膠原差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同時(shí)進(jìn)一步對(duì)關(guān)節(jié)囊中Ⅰ型和Ⅲ型膠原基因表達(dá)進(jìn)行定量檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)相似的結(jié)果，由此根據(jù)前人研究表明，DDH患兒關(guān)節(jié)囊Ⅰ型和Ⅲ型膠原比例失常，可能主要是Ⅰ型膠原的異常表達(dá)有關(guān)。結(jié)合膠原的功能，推測(cè)Ⅰ型膠原的異常表達(dá)，有可能是術(shù)后關(guān)節(jié)功能鍛煉后仍然欠佳的原因之一。

本研究?jī)H僅通過(guò)DDH關(guān)節(jié)囊手術(shù)標(biāo)本來(lái)證實(shí)膠原表達(dá)情況。缺乏正?；純宏P(guān)節(jié)囊Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)情況，這需要進(jìn)一步收集標(biāo)本研究。另外需要進(jìn)一步的體外研究證實(shí)髖關(guān)節(jié)應(yīng)力下的關(guān)節(jié)囊膠原表達(dá)量的表達(dá)改變。盡管如此，本研究也具有很大的臨床意義，認(rèn)為術(shù)中留取標(biāo)本進(jìn)行Ⅰ型和Ⅲ型膠原的檢測(cè)，有助于判定術(shù)后關(guān)節(jié)功能的恢復(fù)情況，同時(shí)為術(shù)后提供合理的康復(fù)訓(xùn)練計(jì)劃提供理論依據(jù)。

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Relevant study of expression of collagenⅠandⅢin capsule of developmental dislocation of the hip and post-operative joint functional impairment

Fang Jihong1，2，Sun Jun2，Ning Bo2，et al
（1School of Nursing，Anhui Medical University，Hefei 230601；2Dept of Orthopaedics，Anhui Provincial Childen′s Hospital，Hefei 230022）

ObjectiveTo explore correlation of the expression of collagen I andⅢin capsule of developmental dislocation of the hip（DDH）and joint functional impairment after operation．The purpose of the study is to offer a theoretical basis for post-operative rehabilitation exercise．Methods The patients with DDH at the age of 2．5～3 years old who received similar operation were included in our hospital from 2010 to 2013．The redundant capsules were preserved for detecting expression of collagen I andⅢby immunohistochemistry and RT-PCR．The same way of rehabilitation exercise was used．The patients were divided into different groups by McKay score．Results There was no statistical significance in expression of collagenⅢboth immunohistochemistry and RT-PCR．However，higher expression of collagen I was observed in patients with worse joint function．Conclusion The expression of collagen I in capsule of DDH patients is of correlation with post-operative joint functional rehabilitation．The patients with higher expression of collagen I should strengthen the function exercise after operation．

developmental dislocation of the hip；collagen；function exercise

R 726．8

A

1000－1492（2015）03－0345－04

2015－01－17接收

安徽省衛(wèi)生廳醫(yī)學(xué)科研課題（編號(hào)：13FR016），安徽省自然科學(xué)基金（編號(hào)：1408085QH153）

1安徽醫(yī)科大學(xué)護(hù)理學(xué)院，合肥 230601

2安徽省兒童醫(yī)院骨科，合肥 230022

方繼紅，女，副主任護(hù)師，碩士研究生；李惠萍，女，教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：hulihuizi＠163．com