劉曉丹，吳 濤，杜 露，楊 亮，王 斌，吐魯洪·沙吾列，趙 倩，迪力夏提·金斯汗，朱麗萍

新疆多民族地區(qū)三陰性乳腺癌BRCA1基因突變分析

劉曉丹，吳 濤，杜 露，楊 亮，王 斌，吐魯洪·沙吾列，趙 倩，迪力夏提·金斯汗，朱麗萍

目的研究新疆多民族地區(qū)三陰性乳腺癌（TNBC）BRCA1基因的突變情況及突變者與未突變者臨床、病理組織特征的差異方法以新疆多民族地區(qū)130例TNBC患者為研究對象，從靜脈血提取基因組DNA，采用PCR聯(lián)合直接測序法檢測BRCA1基因突變情況結(jié)果130例TNBC患者BRCA1突變率為17．7%（23／130），其中漢族與少數(shù)民族TNBC患者BRCA1突變率分別為20．5%（17／83）、12．8%（6／47），差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝1．856，P＝0．869）。130例TNBC患者中發(fā)現(xiàn)23例BRCA1突變的19個位點，其中8個為新發(fā)現(xiàn)的位點；4個BRCA1基因突變“熱點”；此外還發(fā)現(xiàn)了9例（6．9%，9／130）致病性突變，5例無義突變，4例移碼突變。早發(fā)性TNBC組BRCA1突變率28．3%（13／46）高于晚發(fā)性TNBC組11．9%（10／84），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝5．460，P＜0．05）。BRCA1基因突變組與BRCA1基因未突變組相比，發(fā)病年齡早，腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高，TNM分期晚，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）結(jié)論新疆多民族地區(qū)TNBC患者BRCA1基因突變率高；突變者與未突變者相比，存在臨床病理組織差異。

三陰性乳腺癌；BRCA1基因；突變；DNA序列測定；臨床病理特征

三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）是指雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）和人表皮生長因子受體（human epidermal growth factor-2，HER-2）表達(dá)均為陰性的乳腺癌，占乳腺癌總數(shù)的10%～17%［1］。TNBC因缺乏內(nèi)分泌和分子靶向治療，主要治療為化療，但療效不佳，預(yù)后差［2］。BRCA1基因是重要的抑癌基因，其結(jié)構(gòu)和功能的異常與乳腺癌的發(fā)生密切相關(guān)［3］。BRCA1相關(guān)性乳腺癌中TNBC占48%［4］，表明BRCA1基因的破壞是TNBC發(fā)展的關(guān)鍵步驟。該研究通過對新疆多民族地區(qū)130例TNBC患者BRCA1基因進(jìn)行檢測，以研究其突變情況和相關(guān)的臨床、病理組織特征。

1 材料與方法

1．1 病例資料選取2012年4月～2014年1月新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院乳腺外科收治的經(jīng)病理確診，符合TNBC標(biāo)準(zhǔn)的女性乳腺癌患者130例，其中漢族83例，少數(shù)民族47例。發(fā)病年齡26～73（44．83±11．18）歲。均首次診斷為原發(fā)性乳腺癌，既往無其他腫瘤史。將年齡≤35歲和＞35歲TNBC患者分為早發(fā)性TNBC組（n＝46）和晚發(fā)性TNBC組（n＝84）。按BRCA1基因突變與否分為BRCA1基因突變組（n＝23）與BRCA1基因未突變組（n＝107），所有入組患者根據(jù)倫理委員會要求簽署知情同意。抽取外周靜脈血，置入5 ml含EDTAK2抗凝的真空采血管中，放入－80℃冰箱保存。

1．2 主要試劑與器材血液基因組DNA提取系統(tǒng)（非離心柱型）、Pfu DNA Polymerase、Super Pure dNTP Mix（北京天根公司）；瓊脂糖、50×TAE（上海生工公司）；Marker DL2000、6×Loading Buffer（大連TAKARA公司）；臺式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器制造廠）；核酸蛋白定量儀（北京凱奧公司）；電泳儀電源、電泳槽（北京市六一儀器廠）；凝膠成像系統(tǒng)（美國UVP公司）；梯度PCR儀（美國Bio-Rad公司）。

1．3 實驗方法

1．3．1 基因組DNA提取 應(yīng)用血液基因組DNA提取系統(tǒng)按試劑盒說明提取DNA，并電泳、保存。

1．3．2 PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系：10×Pfu Buffer 3 μl，dNTP Mix（10 mmol／L）0．6 μl，Primer F（10 μmol／L）0．6 μl，Primer R（10 μmol／L）0．6 μl，Template 0．6 μl，Pfu DNA Polymerase 0．3 μl，ddH2O224．3 μl，相對應(yīng)的DNA為50 ng，總反應(yīng)體系為30 μl。PCR程序：95℃5 min，95℃30 s，退火溫度30 s，72℃60 s，40個循環(huán)，然后72℃延伸5 min，4℃保存，引物序列和退火溫度見表1。

1．3．3 直接測序與分析 取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5 μl在2．0%瓊脂糖凝膠電泳確定為單一亮條帶，取目的片段送至烏魯木齊歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司進(jìn)行正反雙向測序，將測序結(jié)果與GenBank中的BRCA1標(biāo)準(zhǔn)序列（NM＿007300．3）進(jìn)行比對，判斷有無基因突變，再將突變的位點在乳腺癌信息中心網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫（breast cancer information core，BIC）上作對照，判定是核苷酸多態(tài)性位點、致病性突變位點，還是新發(fā)現(xiàn)的突變位點。根據(jù)HUGO推薦的規(guī)則對堿基插入和丟失進(jìn)行命名。

1．4 ER、PR、HER-2檢測方法和結(jié)果判定患者均采用PV9000法檢測ER、PR、Her-2的表達(dá)。ER、PR以細(xì)胞核內(nèi)有棕色顆粒者視為陽性細(xì)胞，著色陽性細(xì)胞數(shù)＞10%視為陽性；Her-2以＞10%細(xì)胞膜出現(xiàn)連續(xù)性的棕黃色表達(dá)視為陽性，10%～30%為（＋），31%～50%為（＋＋），＞50%為（＋＋＋）。對于Her-2（＋＋）者再行熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）法檢測確定擴(kuò)增情況。

1．5 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 17．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以±s表示，計數(shù)資料以n或%表示，組間率的比較采用χ2檢驗。

2 結(jié)果

2．1 BRCA1基因突變情況130例新疆TNBC中有23例發(fā)生BRCA1基因突變，突變率17．7%，其中漢族、少數(shù)民族患者突變率分別為20．5%（17／83）、12．8%（6／47）；漢族突變率稍高于少數(shù)民族，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝1．856，P＝0．869）。此外7例（5．4%）BRCA1致病性突變，均為漢族，2例患者有家族史。見表2。

2．2 BRCA1基因突變位點130例新疆TNBC患者中23例BRCA1突變19個位點，位于Exon10共13個（6個MS，4個NS，3個FS），其余6個分別在2、5、16、24號外顯子及16號內(nèi)含子；其中有8個位點在BIC中未有報道，為新發(fā)現(xiàn)的位點。見表2、圖1。9例BRCA1致病性突變（5例NS，4例FS）中7個均在10號外顯子，剩余2個分別在2號、24號外顯子；其中4個位點（Exon2 34C＞T、Exon10 3294delT、2073delA、1234G＞A）在BIC中未有報道，為新發(fā)現(xiàn)的位點。此外還發(fā)現(xiàn)了4個BRCA1基因突變“熱點”：Exon2 25G＞A，Exon10 2566T＞C、2077G＞A和Exon5 212＋1G＞T。見表2。

2．3 BRCA1基因突變臨床病理特征在130例新疆TNBC中，BRCA1基因突變組在年齡≤35歲的比例56．5%（13／23）高于BRCA1基因未突變組30．8%（33／107），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝5．460，P＝0．019）。腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率在BRCA1基因突變組60．9%（14／23）高于BRCA1基因未突變組36．4%（39／107），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝4．675，P＝0．031）。BRCA1基因突變組較BRCA1基因未突變組在TNM分期晚，BRCA1基因突變組在3、4期比例為52．2%（12／23）高于BRCA1基因未突變組27．1%（29／107），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝8．370，P＝0．039）。但在民族、腫瘤大小、組織學(xué)分級、病理類型以及Ki-67方面，BRCA1基因突變組與BRCA1基因未突變組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。早發(fā)性TNBC（≤35歲）組BRCA1突變率28．3%（13／46）明顯高于晚發(fā)性TNBC組11．9%（10／84），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝5．460，P＝0．019）。見表3。

3 討論

健康人群中BRCA1突變率＜0．5%。Kwon et al［5］報道不同的研究人群TNBC中BRCA1突變率為11%～38%；本研究顯示新疆地區(qū)130例TNBC患者BRCA1突變率為17．7%（23／130），與文獻(xiàn)［6］報道基本一致。Lidereau et al［7］研究70例法國婦女≤35歲侵襲性乳腺癌中BRCA1的基因突變，顯示BRCA1突變率在ER陰性、高級別腫瘤的患者（28．6%）顯著高于無這些特征的患者（3．6%）。而國內(nèi)薛偉男等［9］研究92例黑龍江省家族性和早發(fā)性乳腺癌BRCA1突變率為7．6%。本研究顯示早發(fā)性TNBC組BRCA1突變率為28．3%（13／46），與國外同類報道［7］基本一致，高于國內(nèi)同類報道［8］，提示BRCA1突變可能與新疆地區(qū)早發(fā)性TNBC密切相關(guān)。這也支持NCCN指南關(guān)于＜50歲的TNBC患者應(yīng)當(dāng)做BRCA基因突變檢測的建議。通過對BRCA基因檢測能夠降低23%的患者對側(cè)發(fā)生乳腺癌風(fēng)險，降低41%患者再次患卵巢癌的風(fēng)險［9］。

本研究顯示的4個BRCA1基因突變“熱點”，可能為新疆地區(qū)遺傳易感位點；此外還發(fā)現(xiàn)8個在BIC中未報道的位點，豐富了中國BRCA1突變攜帶譜。這些突變可能與新疆地區(qū)TNBC患者的地域或種族不同有關(guān)系。但并沒有表明中國人群的“始祖位點”，可能樣本量較少，因此未來還需要對不同民族、不同地域、不同遺傳背景的群體進(jìn)行大樣本研究。篩查BRCA1基因突變對于乳腺癌患病風(fēng)險評估、早期診斷及基因治療均具有重要的臨床意義，但費用較高而無法在臨床上普及，本研究表明的BRCA1基因突變的“熱點”也許可以為以后新疆多民地區(qū)開展BRCA1基因篩選工作提供幫助，降低成本，提高檢測率。

Levanat et al［10］報道BRCA1相關(guān)性乳腺癌具有與散發(fā)性乳腺癌完全不同的病理組織學(xué)特征，兩者相比，BRCA1基因突變組具有髓樣癌及Luminal A亞型比例高、腫瘤細(xì)胞分級高等特點。但本研究中23例BRCA1基因突變組TNBC病理類型多為浸潤性導(dǎo)管癌87．0%（20／23），僅3例髓樣癌，與BRCA1基因未突變組相比組織學(xué)分級無統(tǒng)計學(xué)意義，這與西方患者病理組織特點不同。但本研究中BRCA1基因突變組具有發(fā)病年齡早、腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高以及TNM分期晚的特點。與楊云振等［11］報道的漢族散發(fā)性乳腺癌患者BRCA1基因突變研究組織病理學(xué)特點一致。通過本研究顯示，新疆地區(qū)TNBC患者BRCA1基因突變率較高，BRCA1基因突變組與BRCA1基因未突變組相比，發(fā)病年齡早且淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高、TNM分期較晚，提示預(yù)后較差，應(yīng)考慮個體化治療。

［1］ Reis-Filho J S，Tutt A N．Triple negative tumours：a critical review［J］．Histopathology，2008，52（1）：108－18．

［2］ Krishnamurthy S，Poornima R，Challa V R，et al．Triple negative breast cancer-our experience and review［J］．Indian J Surg Oncol，2012，3（1）：12－6．

［3］ Narod S A，Salmena L．BRCA1 and BRCA2 mutations and breast cancer［J］．Discov Med，2011，12（66）：445－53．

［4］ Lee E，Mckean-Cowdin R，Ma H，et al．Characteristics of triplenegative breast cancer in Patients with a BRCA1 mutation：results from a population-based study of young women［J］．J Clin Oncol，2011，29（33）：4373－80．

［5］ Kwon J S，Gutierrez-Barrera A M，Young D，et al．Expanding the criteria for BRCA mutation testing in breast cancer survivors［J］．J Clin Oncol，2010，28（27）：4214－20．

［6］ 吳 濤，王秀梅，歐江華，等．新疆維吾爾自治區(qū)高風(fēng)險三陰性乳腺癌30例BRCA基因突變及臨床病理特征對比［J］．腫瘤研究與臨床，2013，25（11）：738－41．

［7］ Lidereau R，Eisinger F，Champeme M H，et al．Major improvement in the efficacy of BRCA1 mutation screening using morphoclinical features of breast cancer［J］．Cancer Res，2000，60（5）：1206－10．

［8］ 薛偉男，王勁松，宋燕妮，等．家族性和早發(fā)性乳腺癌BRCA1基因突變分析［J］．實用腫瘤學(xué)雜志，2010，24（5）：408－12．

［9］ King T A，Sakr R，Patil S，et al．Clinical management factors contribute to the decision for contralateral prophylactic mastectomy［J］．J Clin Oncol，2011，29（16）：2158－64．

［10］Levanat S，Cvok M L．Molecular basis of breast cancer related to BRCA1 and BRCA2 genes：characteristics and targeting therapy［J］．Lijec Vjesn，2010，132（1－2）：34－7．

［11］楊云振，余建軍，余 輝，等．漢族散發(fā)性乳腺癌患者BRCA1基因突變研究［J］．寧夏醫(yī)學(xué)雜志，2010，32（2）：108－10．

BRCA1 mutations in patients with triple negative breast cancer in multi-ethnic region of Xinjiang

Liu Xiaodan，Wu Tao，Du Lu，et al
（Dept of Surgery of Breast，Affiliated Tumor Hospital of Xinjiang Medical University，Urumqi 830011）

ObjectiveTo analyze the prevalence of BRCA1 mutations in patients with triple negative breast cancer（TNBC）in multi-ethnic region of Xinjiang and to discuss the difference of clinical and pathological features between patients with BRCA1 gene mutation and without it．Methods BRCA1 mutations in 130 TNBC cases were detected by PCR-DNA sequencing．Genomic DNA was extracted from blood，and BRCA1 mutations were detectedby combined use of PCR and direct sequencing．Results The prevalence of BRCA1 mutations in 130 TNBC cases was 17．7%（23／130）．There was no statistically significant difference in prevalence of BRCA1 mutations between Han（20．5%，17／83）and minority cases（12．8%，6／47）（χ2＝1．856，P＝0．869）．There had been 23 cases of BRCA1 mutations with 19 loci in 130 cases of TNBC patients，8 of which were new loci．4 BRCA1 gene mutation＂hot spots＂were found．In addition，9 cases of pathogenic mutations（6．9%，9／130），including 5 cases of nonsense mutations，4 cases of frameshift mutations．The prevalence of BRCA1 mutations in 46 early onset breast cancer cases was 28．3%（13／46），which was higher than that in the late onset group（11．9%，10／84），and the difference was statistically significant（χ2＝5．460，P＜0．05）．Compared with patients without BRCA1 mutations，who with it had earlier age of onset，higher rate of axillary lymph node metastasis and later of TNM stage，the differences were statistically significant（P＜0．05）．Conclusion The prevalence of BRCA1 mutations in patients with TNBC is higher in multi-ethnic region of Xinjiang．Differences exist in clinical and pathological features between patients with BRCA1 gene mutation and without it．

TNBC；BRCA1 genes；mutation；DNA sequence analysis；clinical pathological features

R 737．9

A

1000－1492（2015）03－0376－05

2014－12－10接收

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金（編號：2012211A031）

新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院乳腺外科，烏魯木齊 830011

劉曉丹，女，碩士研究生；朱麗萍，女，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：zlp＿1005＠sina．com