決明子對便秘小鼠結(jié)腸肌電和水通道蛋白3表達的影響

劉旭杜愛林1姜洪波2陳亞云1張小艷1楊社敏1張瑞嶺1劉曉麗1

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453003)

摘要〔〕目的探討決明子對慢傳輸型便秘小鼠結(jié)腸肌電活動和水通道蛋白3(AQP3)在結(jié)腸黏膜表達的影響。方法40只雄性小鼠隨機分為四組，對照組、便秘組、決明子組和酚酞組(陽性對照組)。建立小鼠慢傳輸便秘模型，用決明子，酚酞灌胃治療決明子組和酚酞組。檢測4組小鼠首便時間，6 h排便數(shù)量，結(jié)腸肌電信號，結(jié)腸黏膜AQP3的表達。結(jié)果決明子組與便秘組相比，首便時間縮短，6 h糞便數(shù)量增加(P<0.05)，結(jié)腸肌電慢波頻率振幅均有極顯著差異(P<0.01)，頻率變異系數(shù)有顯著差異(P<0.05)，結(jié)腸黏膜AQP3平均光密度有極顯著差異(P<0.01)。結(jié)論決明子能夠有效地改善小鼠結(jié)腸運動功能，減少結(jié)腸黏膜AQP3的表達，對慢傳輸型便秘治療具有顯著療效。

關(guān)鍵詞〔〕便秘；結(jié)腸；肌電；水通道蛋白3

中圖分類號〔〕R337.4〔文獻標識碼〕A〔

項目基金

通訊作者：劉曉麗(1968-)，女，高級實驗師，主要從事結(jié)腸肌電生理研究。

1新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院2新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院

第一作者：劉旭(1990-)，女，本科在讀，主要從事臨床醫(yī)學(xué)研究。

Effects of Semen Cassiae on colonic myoelectrical activity and AQP3 in mice

LIU Xu，DU Ai-Lin，JIANG Hong-Bo,etal.

Sanquan College of Xinxiang Medical University， Xinxiang 453003,Henan,China

Abstract【】ObjectiveTo study Semen Cassiae on the colonic myoelectrical activity and the effect of the expression of aquaporin-3(AQP3) in the colonic mucosa of mice with slow transit constipation.Methods40 male mice were randomly divided into:control,constipation,Semen Cassiae and phenolphthalein groups(positive control group).The compound diphenoxylate tablets for intragastric mice was used to establish mice model of slow transit constipation,and then the Semen Cassiae,and phenolphthalein were given by intragastric administration to treat the mice of Semen Cassiae group and phenolphthalein group,respectively.The constipation group were orally administered with the same volume of distilled water.The bowel transit function was measured by eosin propulsion test and the first defecation time and the number of red stool in the initiative 6 hours were recorded.BL-420F system was used for collecting change of myoelectrical signals of the mice colon.Immunohistochemical was used to detect the expression of AQP3 in colon mucosa of mice.ResultsThe effect of Semen Cassiae on the first defecation time and the number defecation of red stool in the initiative 6 hours had obviously changed.The grain number of red stool in 6 hours of constipation group was less than that of control group,associated with prolong of the first defecation time (P<0.01).Compared with constipation group,Semen Cassiae group and phenolphthalein group shortened the first defecation time and increased the grain number of the defecation red stool in 6 hours of the mice (P<0.05).The constipation group of colonic myoelectrical activity of mice slow-waves frequency was (7.78±1.59) Hz,slow-waves amplitude was (0.06±0.01) mV,and the Semen Cassiae group of slow-waves frequency was (3.32±0.55)Hz,slow-waves amplitude was (0.07±0.02) mV.Compared with the constipation group,there were all significant differences (P<0.01).Compared with the Semen Cassiae group 〔(12.49±0.99)%〕,c slow-waves frequency variation coefficient of constipation group was significantly increased 〔(21.09±2.40)%,P<0.01〕.There was no significant difference in the slow-waves amplitude variation coefficient between constipation and Semen Cassiae groups(16.91%±8.45%,vs 15.75%±4.09%,P>0.05).There was significant difference in the expression of the mean optic density of AQP3 in colonic mucosa between constipation and Semen Cassiae groups(0.23±0.02 and 0.15±0.01,P<0.01).ConclusionsSemen Cassiae could improve motor function in mice colon,reduce expression of AQP3 in colon mucosa,and has significant effects on the treatment of slow transit constipation.

【Key words】Constipation;Colon;Myoelectrical;AQP3

便秘會因體內(nèi)有害物質(zhì)不能及時排除，從而引起腹脹、噯氣、胃酸、中毒的反應(yīng)，導(dǎo)致腸道生態(tài)平衡失調(diào)，增加大腸癌發(fā)生的危險〔1〕。慢性便秘還可誘發(fā)老年癡呆癥、心腦血管疾病、腦血管意外、心肌梗死等嚴重疾病。同時，便秘還是多種疾病的并發(fā)癥。目前臨床常用來治療便秘的藥物多具有依賴性，副作用明顯，刺激性大。而決明子作為一種藥食同源品種，具有刺激性小，服用方便，價格便宜等優(yōu)點。目前普遍認為蒽醌類是決明子起瀉下作用的主要成分，但對決明子治療慢傳輸型便秘的作用機制尚未完全清楚，因此，本研究利用結(jié)腸肌電和免疫組織化學(xué)技術(shù)，探討慢傳輸型便秘小鼠結(jié)腸肌電活動和結(jié)腸黏膜AQP3表達的影響。

1材料與方法

1.1動物48只雄性昆明小鼠，體質(zhì)量為20~25 g，由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。按體重隨機分為4組，對照組、便秘組、酚酞組、決明子組，每組6只。

1.2主要試劑復(fù)方地芬諾酯片(河南鼎昌藥業(yè)有限公司，批號：12060701)，酚酞片(山西亨瑞達制藥有限公司，批號：130106)，曙紅Y來源于上海永綠生物有限公司(CAS 號:17372-87-1)，決明子(新鄉(xiāng)市同仁堂藥房提供)，一抗兔抗鼠單抗AQP3，(北京博奧森生物有限公司，Lot:980590W)，兔SP檢測試劑盒(北京中杉金橋有限公司，批號：13152A04)，磷酸鹽緩沖液(PBS 0.01 mol/L，pH7.2~7.4)，DAB顯色試劑盒ZLI-9018(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號：K1352222E)等。

1.3主要儀器BL-420F生物機能實驗系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)，自制銅絲電極直徑0.5 mm，長度4 mm。

1.4造模每天中午12時，除對照組外，其余三組小鼠均灌胃復(fù)方地芬諾酯片25 mg/kg〔2〕，對照組灌胃等體積蒸餾水。決明子組和酚酞組每天下午18：00，分別灌胃決明子3 g/kg(按小鼠用藥量是成人9倍計算，決明子研磨成粉沸水沖泡冷卻至室溫時灌胃〔3〕)，酚酞30 mg/kg，其他組灌胃等體積蒸餾水，除對照組外，其他組均限水。連續(xù)造模1 w。1 w后，四組小鼠均按照10 mg/kg灌胃曙紅懸濁液，然后觀察并記錄小鼠首便時間和最初6h紅便數(shù)量。

1.5結(jié)腸肌電測定用BL-420F生物機能實驗系統(tǒng)進行肌電測定，具體方法參照盧智敏等〔4〕描述，靈敏度選擇:增益2 mV，時間常數(shù)3 s，高頻濾波為10 Hz，連續(xù)記錄1 h左右。將每組的記錄結(jié)果5 min作為一個時間段，分別計算出每一時間段的頻率和振幅的均值、標準差及變異系數(shù)，再取各組均值、標準差及變異系數(shù)進行比較。慢波頻率變異系數(shù)(%)=慢波頻率標準差/慢波頻率均值×100%。慢波振幅變異系數(shù)(%)=慢波振幅標準差/慢波振幅均值×100%。

1.6免疫組織化學(xué)技術(shù)造模完成后，四組小鼠禁食24 h，20%烏拉坦腹腔注射麻醉(5 mg/kg)，取小鼠結(jié)腸近段進行常規(guī)固定，脫水，石蠟包埋，切片，切片厚度7 μm。常規(guī)免疫組織化學(xué)技術(shù)染色(其中二抗?jié)舛葹?∶150)每次試驗以酚酞組作為陽性對照，用PBS代替一抗做陰性對照，光學(xué)顯微鏡下觀察AQP3的表達情況，以細胞中出現(xiàn)明顯的棕褐色顆粒為陽性細胞，在400倍光鏡下選擇5個完整不重疊視野，用Image pro-Plus6.0軟件分析每個視野平均光密度值。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS11.0進行t檢驗。

2結(jié)果

2.1糞便性質(zhì)的改變便秘組、決明子組和酚酞組小鼠糞便比對照組粒小、干燥、質(zhì)硬。便秘組與對照組相比，首粒紅便時間顯著延長(P<0.01),便秘組6 h紅便粒數(shù)少于對照組(P<0.01)。決明子組與便秘組相比首粒紅便時間縮短(P<0.05)，便秘組6 h紅便粒數(shù)與決明子組相比，決明子組6 h紅便粒數(shù)顯著增加(P<0.05)。酚酞組首粒糞便時間與便秘組相比顯著縮短(P<0.05)，便秘組6 h紅便粒數(shù)與酚酞組相比顯著減少(P<0.05)。見表1。

2.2結(jié)腸黏膜AQP3表達情況AQP3陽性表達為棕褐色顆粒，結(jié)腸黏膜AQP3主要分布在吸收細胞和杯狀細胞基底側(cè)細胞膜及靠近基底部的細胞質(zhì)和細胞頂部。對照組AQP3主要表達于吸收細胞，杯狀細胞表達較少。便秘組吸收細胞和杯狀細胞幾乎都有AQP3表達，染色較深。決明子組、酚酞組與便秘組相比AQP3表達主要以吸收細胞為主，表達較少。對照組AQP3表達的平均光密度值為0.147±0.014，便秘組為0.235±0.023，便秘組AQP3表達強度明顯高于對照組(P<0.01)，決明子組AQP3表達的平均光密度值為0.153±0.014，便秘組明顯高于決明子組(P<0.01)，酚酞組AQP3表達的平均光密度值為0.179±0.010，便秘組明顯高于酚酞組(P<0.01)。見圖1。

表1　四組小鼠排便情況比較

與便秘組比較：1)P<0.01,2)P<0.05，下表同

圖1　四組小鼠結(jié)腸上皮細胞AQP3的免疫組化 染色表達(DAB，×400)

2.3 結(jié)腸肌電活動四組小鼠的結(jié)腸慢波表現(xiàn)近似于正弦波樣曲線。對照組慢波頻率、振幅規(guī)律。便秘組慢波波形不規(guī)則，慢波頻率、振幅較不規(guī)律。決明子組和酚酞組慢波表現(xiàn)有不明顯雙峰，慢波頻率、振幅較規(guī)律。見圖2。與對照組比較，便秘組慢波頻率加快(P<0.01)，慢波振幅減小(P<0.01)。與對照組比較，便秘組慢波頻率變異系數(shù)較大(P<0.01)，兩組慢波振幅變異系數(shù)比較無顯著差異(P>0.05)。與決明子組相比，便秘組慢波頻率加快(P<0.01)，慢波振幅減小(P<0.01)。

圖2　四組小鼠的慢波波形

與決明子組相比，便秘組慢波頻率變異系數(shù)較大(P<0.05)，兩組慢波振幅變異系數(shù)比較，無顯著差異(P>0.05)。與酚酞組比較，便秘組慢波頻率加快(P<0.01)，慢波振幅減小(P<0.01)。與酚酞組比較，便秘組慢波頻率變異系數(shù)比較(P<0.05)。兩組慢波振幅變異系數(shù)比較減慢，無顯著差異(P>0.05)。見表2。

表2　四組小鼠的慢波頻率和振幅比較 ± s, n=6)

3討論

傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)認為決明子性味甘苦，咸微寒，入肝經(jīng)、大腸經(jīng)。主要功效為清肝、明目、潤腸通便。決明子在治療便秘方面效果顯著，后遺癥低、并發(fā)癥低、不良反應(yīng)小，常應(yīng)用在便秘的臨床治療中〔5〕。經(jīng)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明決明子在降壓、降脂、保肝、抗氧化等方面也有一定療效〔6〕，擁有諸多優(yōu)點，應(yīng)被廣泛推廣使用。

慢波是相對規(guī)律的一種周期性電活動，控制著腸道收縮節(jié)律，無論收縮與否始終存在〔7〕。結(jié)腸肌電動作電位產(chǎn)生于慢波之上，與平滑肌收縮一致，是結(jié)腸推進性運動的主要動力，所以，結(jié)腸慢波的頻率和振幅也就可以作為反映結(jié)腸功能的一項客觀電生理指標〔8〕。本實驗表明決明子在一定程度上可以恢復(fù)慢傳輸型便秘小鼠慢波頻率、振幅，減小頻率變異系數(shù)，提示恢復(fù)慢傳輸型便秘小鼠結(jié)腸慢波的頻率和振幅是決明子治療慢傳輸型便秘的機制之一。

AQPs廣泛存在于人體的各個器官組織細胞中，是一種可使水通過漿膜的膜蛋白家族，AQP3是水通道蛋白家族中的一個亞型，AQP3主要在結(jié)腸表達〔9〕，在結(jié)腸內(nèi)容物水的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，抑制結(jié)腸內(nèi)AQP3的功能將導(dǎo)致腹瀉〔10〕。結(jié)腸黏膜AQP3主要分布在細胞基底側(cè)及腔面細胞質(zhì)〔11〕，其主要功能是將腸腔內(nèi)的水從基底側(cè)轉(zhuǎn)移到細胞間隙中。因此，結(jié)腸黏膜內(nèi)AQP3表達強度和功能與結(jié)腸內(nèi)水分的多少有關(guān)，從而對便秘的形成，具有一定影響。本實驗結(jié)果說明便秘小鼠經(jīng)決明子治療后AQP3表達強度減弱。由此，可能提示決明子治療慢傳輸型便秘的機制之一是通過下調(diào)結(jié)腸黏膜AQP3的表達，增加腸道水分，起到潤滑腸道內(nèi)容物的作用。

腸道神經(jīng)系統(tǒng)主要的抑制性遞質(zhì)是血管活性腸多肽(VIP)。VIP是廣泛存在的腦腸肽，在消化系統(tǒng)中十二指腸和結(jié)腸含量最高〔12〕，能松弛腸道平滑肌，對胃腸運動起抑制性調(diào)節(jié)作用。有研究指出，蔥醌類物質(zhì)能顯著提高糖尿病大鼠血漿的VIP水平，從而使糖尿病所致的胃腸推進功能減退〔13〕。本實驗中決明子可能通過其蒽醌類物質(zhì)作用于VIP，增加結(jié)腸推進功能，緩解便秘，而其推進功能的提高可能經(jīng)慢波頻率和振幅的顯著增加的形式來表現(xiàn)。Itoh等〔14〕研究發(fā)現(xiàn)VIP通過cAMP依賴的途徑上調(diào)AQP3 mRNA和蛋白表達，推測VIP參與便秘發(fā)生與上調(diào)AQP3的表達。本實驗中決明子組AQP3的表達減少提示決明子可能通過調(diào)節(jié)結(jié)腸VIP的含量，下調(diào)AQP3的表達，減少結(jié)腸內(nèi)水分的吸收，減輕腸壁水腫，提高腸黏膜敏感性，增大的腸道內(nèi)容物體積，刺激腸黏膜，增加腸道蠕動，而緩解小鼠慢傳輸型便秘。

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〔2014-07-09修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)