PI3K/Akt和JAK2/STAT3信號轉(zhuǎn)導通路在SO2抗大鼠肢體缺血再灌注致急性肺損傷中的作用*

趙彥瑞，劉洋，王東，單磊，周君琳△

(首都醫(yī)科大學附屬北京朝陽醫(yī)院骨科，北京 100020)

[摘要]目的： 探討PI3K/Akt和JAK2/STAT3信號轉(zhuǎn)導通路在二氧化硫(SO2)抗肢體缺血再灌注(I/R)致急性肺損傷中的作用。方法： 應(yīng)用雙大腿根部綁扎止血帶復制大鼠雙后肢缺血再灌注肺損傷模型。在再灌注前20 min腹腔注射Na2SO3/NaHSO3；在再灌注前1 h靜脈注射Stattic或LY294002。應(yīng)用TUNEL、ELISA、Western blot等方法檢測細胞凋亡、細胞因子表達及相關(guān)信號通路蛋白表達的情況。結(jié)果： 與對照組相比，I/R組的MDA及MPO含量、肺系數(shù)、細胞凋亡指數(shù)、細胞因子表達以及p-STAT3、p-Akt蛋白的水平均顯著增高；當應(yīng)用Na2SO3/NaHSO3后，上述反映肺損傷的各項指標均下降。Western blot檢測結(jié)果顯示I/R后，肺組織中p-STAT3和p-Akt蛋白的水平均明顯增加。而應(yīng)用Na2SO3/NaHSO3后，p-Akt蛋白的水平繼續(xù)增加，但p-STAT3蛋白的水平卻減少(P<0.05)。結(jié)論： JAK2/STAT3和PI3K/Akt信號通路都參與了SO2抗肢體缺血再灌注致急性肺損傷的作用。JAK2/STAT3通路的活化，能夠使I/R損傷加重；相反，PI3K/Akt信號通路的活化，可以使I/R損傷減弱。此外，JAK2/STAT3和PI3K/Akt信號通路之間存在交互作用。

[關(guān)鍵詞]PI3K/Akt信號通路； JAK2/STAT3信號通路； 二氧化硫； 缺血再灌注； 急性肺損傷

[中圖分類號]R363[文獻標志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.11.025

[文章編號]1000-4718(2015)11-2083-07

[收稿日期]2015-04-28[修回日期] 2015-07-09

[基金項目]*國家自然科學基金資助項目(No. 81471973)；廣東省社會發(fā)展領(lǐng)域科技計劃 (No.2013B021800043; No.2014A020212212)；廣東省自然科學基金資助項目(No. S2013010016736)

通訊作者△Tel: 020-85221165; E-mail: thshg@126.com

Roles of PI3K/Akt and JAK2/STAT3 signaling pathways in protection of SO2against limb ischemia/reperfusion-induced acute lung injury in ratsZHAO Yan-rui, LIU Yang, WANG Dong, SHAN Lei, ZHOU Jun-lin

(DepartmentofOrthopedics,BeijingChaoyangHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100020,China.E-mail:zhoujunlin@medmail.com.cn)

ABSTRACT[]AIM: To investigate the role of PI3K/Akt and JAK2/STAT3 pathways in the protection of sulfur dioxide (SO2) against limb ischemia/reperfusion (I/R)-induced acute lung injury (ALI) in rats. METHODS: ALI was induced by limb I/R in the SD rats. Na2SO3(0.54 mmol/kg, ip)/NaHSO3 (0.18 mmol/kg, ip) as SO2 donor was injected at 20 min before reperfusion. The inhibitors of JAK2/STAT3 and PI3K/Akt pathways, Stattic (3 mg/kg, iv) and LY294002 (40 mg/kg, iv), respectively, were injected at 1 h before reperfusion. Peripheral blood and lung tissues were collected for determining the contents of the cytokines, the protein levels of the molecules related to the signaling pathways, apoptosis and histopathologic changes by ELISA, TUNEL and Western blot. RESULTS: Compared with control group, the content of MDA, the activity of MPO, lung coefficient, apoptotic index, cytokine expression, and the protein levels of p-Akt and p-STAT3 in I/R group all increased significantly, and administration of Na2SO3/NaHSO3 attenuated the damage in the lung. Besides, the results of Western blot showed that the rat lung tissues expressed p-STAT3 protein and p-Akt protein. After I/R, the protein levels of p-STAT3 and p-Akt were increased. After using Na2SO3/NaHSO3, p-Akt was increased, but p-STAT3 was decreased (P<0.05). CONCLUSION: Both JAK2/STAT3 and PI3K/Akt pathways are likely involved in the protective effect of SO2 against limb I/R-induced ALI in rats. The activation of JAK2/STAT3 signaling pathway increases I/R injury. Reversely, the activation of PI3K/Akt signaling pathway reduces I/R injury. Besides, JAK2/STAT3 and PI3K/Akt signaling pathways may have crosstalk during I/R-induced ALI and JAK2/STAT3 pathway may have an impact on the P13K/Akt pathway.

[KEY WORDS]PI3K/Akt signaling pathway; JAK2/STAT3 signaling pathway; Sulfur dioxide; Ischemia/reperfusion; Acute lung injury

PI3K/Akt和JAK2/STAT3分子信號轉(zhuǎn)道通路是重要的細胞信號轉(zhuǎn)導通路。它們參與調(diào)節(jié)機體細胞活化、凋亡、炎癥反應(yīng)和趨化等多種病理生理學過程[12-13]。許多研究報道這2條信號轉(zhuǎn)導通路均參與了多種干預措施的心肌保護作用[14-15]。這2條信號轉(zhuǎn)導通路是否參與了SO2抗大鼠肢體缺血再灌注致急性肺損傷尚有待研究。因此，本研究擬應(yīng)用PI3K/Akt和JAK2/STAT3信號通路的特異性抑制劑LY294002和Stattic探討這2條信號通路在SO2抗肢體缺血再灌注致急性肺損傷中的作用。

材料和方法

1材料

健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，體重180～230 g，由中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所提供；Na2SO3/NaHSO3，分析純，購于北京康普匯維科技有限公司；髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)比色法活性檢測試劑盒及丙二醛(malondialdehyde，MDA)測定試劑盒購自南京建成生物有限公司；細胞凋亡TUNEL檢測試劑盒和Bradford蛋白測定試劑盒購自碧云天公司；Stattic(STAT3抑制劑)和LY294002(Akt抑制劑)購自Selleck；STAT3、Akt、GAPDH、p-STAT3和p-Akt抗體購自恩晶生物公司；II抗購自于上海研卉生物有限公司；5% 牛血清白蛋白封閉液購自北京索萊寶公司；蛋白酶抑制劑混合物和蛋白磷酸酶抑制劑混合物購自北京普利萊公司；大鼠IL-1、IL-6、TNF-α 和IL-10 ELISA試劑盒購自達科為公司。

2動物模型

按照Cohen等[16]提供的方法復制肢體I/R致ALI動物模型。健康雄性SD大鼠應(yīng)用苯巴比妥鈉(40 mg/kg，ip)麻醉。分離左側(cè)頸外靜脈及右側(cè)頸總動脈插管用予補液(乳酸林格氏液2 mL/h)、給藥及采血。用橡皮止血帶綁扎雙后肢根部造成肢體缺血，4 h后松開止血帶使肢體血流再灌注2 h。應(yīng)用激光多普勒(PERIMED)探測血流以確認肢體的缺血和再灌注。

3實驗分組

將40只SD大鼠隨機分為對照組、I/R組、I/R+SO2組、I/R+SO2+ LY294002組和I/R+SO2+Stattic組。對照組動物給予同樣的麻醉和操作，只是不造成肢體缺血；I/R組動物雙后肢缺血4 h再灌注2 h；I/R+SO2組于再灌注前20 min給予SO2供體Na2SO3(0.54 mmol/kg, ip)/NaHSO3(0.18 mmol/kg, ip)；I/R+SO2+LY294002組和I/R+SO2+Stattic組除了給予SO2外，在再灌注前1 h分別給以抑制劑LY294002 (40 mg/kg，iv)及Stattic(3 mg/kg，iv)。實驗結(jié)束時，麻醉處死大鼠。留取血樣并離心(4 000 r/min，10 min，0～4 ℃)，血漿儲存在-80 ℃冰箱用于日后檢測細胞因子IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α。肺組織取出稱重后一部分固定于10%甲醛中，用于病理切片；剩余肺組織保存于-80 ℃冰箱，用于日后檢測MDA含量和MPO活性，細胞因子IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α的表達，信號通路分子STAT3、Akt、p-STAT3和p-Akt蛋白的水平。

4檢測指標和方法

4.1組織學檢查及細胞凋亡情況檢測肺組織取出后，一部分固定于10%甲醛中，常規(guī)石蠟包埋、切片及HE染色，光鏡下觀察肺組織形態(tài)學變化。我們應(yīng)用TUNEL技術(shù)進行細胞凋亡情況檢測。按照公司提供的試劑盒說明書所述方法進行操作。凋亡細胞胞核經(jīng)TUNEL染色呈綠色，未凋亡細胞胞核DAB復染后呈藍色。隨機計數(shù)5個高倍鏡下的凋亡細胞數(shù)。每張片子至少觀察500個細胞，計算每100個細胞內(nèi)的陽性細胞，即凋亡指數(shù)(apoptotic index，AI)。

4.2肺系數(shù)檢測自氣管分叉以上第5及第6軟骨環(huán)之間剪斷氣管，將肺組織完整取出，用濾紙吸干肺組織表面的血污后稱重。肺系數(shù)=全肺濕質(zhì)量(g)/體質(zhì)量(kg)。

4.3肺組織中MDA含量和MPO活性的檢測應(yīng)用MDA和MPO試劑盒，按照公司說明進行操作檢測肺組織勻漿中MDA和MPO的含量變化。

4.4血清及肺組織中IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α水平的測定使用ELISA試劑盒測定血清及肺組織中IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α的濃度，按試劑公司說明書進行操作。以檢測IL-1β為例步驟如下：首先，將IL-1β標準品按梯度稀釋后加入標準品孔，檢測樣品加入樣品孔。然后加入biotinylated antibody，混勻后，蓋上封板膜，37 ℃溫育90 min。溫育后，扣去孔內(nèi)液體，加入1×washing buffer洗板，停留1 min后棄去孔內(nèi)液體；重復4 次，每一次在濾紙上扣干。再加入稀釋后的streptavidin-HRP，蓋上封板膜，37 ℃溫育30 min。按上述方法再次洗板4次。加入TMB進行顯色，37 ℃避光溫育5～30 min之間。最后迅速加入stop solution終止反應(yīng)。終止后10 min內(nèi)，應(yīng)用酶標儀在波長450 nm處進行檢測。繪制出標準曲線，計算樣品IL-1β的濃度。應(yīng)用同樣的方法對IL-6、IL-10和TNF-α進行檢測。

4.5Western blot檢測STAT3、Akt、p-STAT3和P-Akt的蛋白水平將肺組織解凍，切成小塊后，采用電子天平稱量大約20 mg，按照每10 mg組織加入200 μL蛋白裂解液的比例加入預冷的總蛋白抽提試劑，同時加入50×蛋白酶抑制劑和100×蛋白磷酸酶抑制劑。在冰上進行研磨勻漿，直至充分裂解。將組織勻漿轉(zhuǎn)移至預冷的1.5 mL的EP管中，置于冰上15 min充分裂解。裂解后放置在預冷的離心機中離心(12 000 r/min、4 ℃、10 min)，取上清液，-20 ℃保存?zhèn)溆?。上清液依次進行蛋白定量、聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉之后，采用兔抗大鼠I抗孵育，4 ℃過夜。用TBST洗膜3次，每次10 min。采用5% BSA封閉液稀釋的山羊抗兔IgG II抗抗體孵育2 h。孵育結(jié)束后，應(yīng)用TBST再次洗膜3次，每次10 min。隨后進行化學發(fā)光、顯影定影和圖像分析。

5統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析。組間比較采用單因素方差分析(方差齊的應(yīng)用LSD或S-N-K法，方差不齊的應(yīng)用Dunnett’s T3或Dunnett’s C法)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

1肺組織形態(tài)學和肺系數(shù)的變化

光鏡下觀察可見大鼠肢體缺血4 h再灌注2 h后，肺組織出現(xiàn)間質(zhì)水腫、肺泡增厚及PMN浸潤的組織學變化。應(yīng)用Na2SO3/NaHSO3后肺組織學改變明顯減輕；應(yīng)用Stattic抑制劑后，肺組織學改變也明顯減輕；應(yīng)用LY294002抑制劑后，肺組織學改變減輕，但不如應(yīng)用Na2SO3/NaHSO3和Stattic明顯。與對照組相比，I/R組肺系數(shù)顯著增大(P<0.01)；與I/R組相比，I/R+SO2組明顯變小(P<0.01)；與I/R+SO2組比較，I/R+SO2+LY294002組的肺系數(shù)增大，而I/R+SO2+Stattic組則進一步減小(P<0.05)，見圖1、表1。

Figure 1.Lung morphological changes in limb I/R-induced ALI rats with different treatments.

圖1不同實驗組肺組織病理學的改變

2肺組織中MDA含量和MPO活性的變化

各組大鼠MDA含量和MPO活性的變化趨勢一致。與對照組相比，I/R組明顯增高(P<0.01)，與I/R組相比，I/R+SO2組明顯減少(P<0.01)；與I/R+SO2組比較，I/R+SO2+LY294002組增加，然而I/R+SO2+Stattic組進一步減少(P<0.05)，見表1。

3TUNEL結(jié)果

對照組中僅見少量凋亡細胞，凋亡指數(shù)為1.45%。與對照組相比，I/R組的凋亡細胞明顯增加，凋亡指數(shù)達17.2%；與I/R組相比，當應(yīng)用Na2SO3/NaHSO3后，凋亡細胞明顯減少，凋亡指數(shù)降到6.5%；在I/R+SO2+Stattic組，凋亡細胞也明顯減少，凋亡指數(shù)為5.5%；但在I/R+SO2+LY294002組，凋亡細胞減少不明顯，凋亡指數(shù)為10.33%，見圖2。

表1肺組織中MDA、MPO及肺系數(shù)變化情況

Table 1.The changes of MPO activity, MDA content and lung coefficient in the lung of limb I/R-induced ALI rats with different treatments (Mean±SD.n=8)

GroupMDA(μmol/L)MPO(U/g)LW/BW(g/kg)Control36.62±1.782.43±0.364.86±0.16I/R49.78±1.84**4.98±0.89**6.02±0.29**I/R+SO244.87±0.96##3.39±0.41##5.24±0.15##I/R+SO2+LY29400247.74±1.30?3.94±0.14?5.45±0.14?I/R+SO2+Stattic43.34±1.03?2.90±0.31?5.05±0.15?

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsI/R group;?P<0.05vsI/R+SO2group.

Figure 2.Apoptosis analysis of the lung tissues in limb I/R-induced ALI rats with different treatments. Mean±SD.n=8.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsI/R group;△P<0.05vsI/R+SO2group.

圖2肺組織細胞凋亡TUNEL染色結(jié)果及凋亡指數(shù)變化

Figure 3.The contents of IL-1β, IL-6, IL-10 and TNF-α in the plasma and lung tissues from limb I/R-induced ALI rats with different treatments. Mean±SD.n=8.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsI/R group;△P<0.05vsI/R+SO2group.

圖3肺組織及血漿中細胞因子IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α的含量

4肺組織及血漿中細胞因子含量的變化

和對照組相比，I/R組肺組織及血漿中的IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α的含量均明顯增加(P<0.01)。與I/R組相比，I/R+SO2組肺組織及血漿中的IL-1β、IL-6和TNF-α含量明顯減少，但IL-10的含量卻明顯增加(P<0.01)。與I/R+SO2組比較，I/R+SO2+LY294002組肺組織及血漿中的IL-1β、IL-6和TNF-α含量增加(P<0.05)，IL-10的含量無明顯變化；然而，I/R+SO2+Stattic組肺組織及血漿中的IL-1β、IL-6和TNF-α含量卻減少(P<0.05)，IL-10含量無明顯變化，見圖3。

5肺組織中STAT3、p-STAT3、Akt和p-Akt蛋白水平的變化

Western檢測結(jié)果顯示大鼠肺組織中存在p-STAT3蛋白(36.22%)及p-Akt蛋白(39.12%)。和對照組相比，I/R組肺組織中p-STAT3和p-Akt的蛋白水平均明顯增加，分別為82.27%和61.60%(P<0.01)。與I/R組相比，I/R+SO2組肺組織中p-Akt蛋白水平增加達82.56%，但p-STAT3蛋白水平卻減少為52.56% (P<0.01)。與I/R+SO2組比較，I/R+SO2+LY294002組肺組織中p-Akt水平明顯減少(P<0.05)，p-STAT3蛋白水平無明顯變化(P>0.05)；I/R+SO2+Stattic組肺組織中p-STAT3蛋白水平明顯減少(P<0.05)，p-Akt卻增加至92.13% (P<0.05),見圖4。

討論

JAK2/STAT3信號通路是近年來研究較多的一條信號轉(zhuǎn)導途徑。STAT3信號通路可將細胞膜感受到的信號直接傳遞至核內(nèi)，激活靶基因的轉(zhuǎn)錄，環(huán)節(jié)少而簡潔。許多細胞因子(CNTF、IL-2、IL-6等)和生長因子(PDGF、EGF、CSF等)都利用該信號轉(zhuǎn)導途徑

Figure 4.The protein levels of Akt, p-Akt, STAT3 and p-STAT3 in the lung tissues of limb I/R-induced ALI rats with different treatments determined by Western blot. Mean±SD.n=8.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsI/R group;△P<0.05vsI/R+SO2group.

圖4肺組織中STAT3、p-STAT3、Akt和p-Akt蛋白水平的變化

誘導細胞的分化、增殖或凋亡，它們在免疫功能調(diào)節(jié)、腫瘤的發(fā)生以及造血細胞生成中發(fā)揮著特異、多效的生物學功能。有研究顯示[7]，A9490(一種STAT3通路抑制劑)具有心血管保護作用，能減輕心肌缺血再灌注損傷。Macchi等[17]報道STAT3通路參與磺達肝癸(fondaparinux，F(xiàn)DX)誘導的心臟保護效應(yīng)。

PI3K屬于定位于肌醇環(huán)D3位置的磷酸化磷脂酰肌醇磷脂激酶家族，PI3K家族的一級結(jié)構(gòu)參與細胞外信號轉(zhuǎn)導，其反應(yīng)產(chǎn)物為第二信使，其靶基因為絲氨酸/蘇氨酸激酶。Akt位于PI3K下游，通過細胞外刺激激活PI3K，Akt從胞漿轉(zhuǎn)移至胞膜，在胞膜Akt的2個殘基(蘇氨酸308和絲氨酸473)磷酸化，使Akt完全激活。Akt通路可以抑制細胞凋亡，促進細胞生長。Zhao等[18]報道PI3K/Akt通路參與調(diào)節(jié)SO2預處理能減輕大鼠心肌缺血損傷。

為了探索JAK2/STAT3和PI3K/Akt信號通路在SO2抗肢體缺血再灌注致急性肺損傷中的作用。我們應(yīng)用其特異性阻滯劑Stattic及LY294002進行研究。結(jié)果顯示，與I/R組比較，I/R+SO2組p-Akt的蛋白水平增加，肺組織中MDA、MPO的含量表達減少，肺系數(shù)變小，肺組織及血漿中IL-1β、IL-6和TNF-α表達減少。與I/R+SO2組比較，I/R+SO2+LY294002組肺組織中p-Akt表達明顯減少，而肺組織中MDA、MPO含量表達增加，肺系數(shù)增大，肺組織及血漿中IL-1β、IL-6和TNF-α表達也增加。這表明抑制PI3K/Akt信號通路，減弱了SO2對肢體缺血再灌注致急性肺損傷的拮抗作用。與I/R+SO2組比較，I/R+SO2+Stattic組肺組織中p-STAT3的蛋白水平明顯減少，肺組織中MDA、MPO含量表達減少，肺系數(shù)變小，肺組織及血漿中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量也減少。這表明抑制JAK2/STAT3信號通路，增強了SO2對肢體缺血再灌注致急性肺損傷的拮抗作用。也就是說，JAK2/STAT3和PI3K/Akt信號通路都參與了SO2抗肢體缺血再灌注致急性肺損傷的作用；JAK2/STAT3通路的活化，加重了I/R損傷；PI3K/Akt信號通路的活化，減弱了I/R損傷。

Western blot的結(jié)果顯示，大鼠肺組織中存在p-STAT3蛋白及p-Akt蛋白。當I/R后，肺組織中p-STAT3和p-Akt的蛋白水平均明顯增加，而應(yīng)用Na2SO3/NaHSO3后，肺組織中p-Akt的蛋白水平增加，但p-STAT3的蛋白水平卻減少。說明p-STAT3蛋白加重肺損傷，而p-Akt蛋白可減輕肺損傷。因此，我們推測SO2通過抑制JAK2/STAT3信號通路減少p-STAT3的蛋白水平，通過活化PI3K/Akt信號通路促進Akt蛋白磷酸化來實現(xiàn)對肢體缺血再灌注致急性肺損傷的拮抗作用。

與I/R+SO2組比較，當應(yīng)用LY294002抑制劑后，肺組織中p-Akt的蛋白水平明顯減少，p-STAT3的蛋白水平卻無明顯變化；但當應(yīng)用Stattic抑制劑后，除了p-STAT3的蛋白水平明顯減少外，p-Akt的蛋白水平進一步增加。這表明JAK2/STAT3和PI3K/Akt信號通路之間存在交互作用。我們推測JAK2/STAT3信號通路可以影響PI3K/Akt信號通路，但PI3K/Akt信號通路卻不能影響JAK2/STAT3信號通路。Stattic通過抑制JAK2/STAT3信號通路促進了p-Akt蛋白的生成，進而達到肺保護的作用。Suleman等[19]研究報道，JAK2/STAT3和PI3K/Akt通路間也存在交互作用。Goodman等[20]在研究心肌缺血預處理時，也發(fā)現(xiàn)RISK通路(包括Akt)和SAFE(包括STAT)通路之間存在交互作用。

總之，SO2對肢體缺血再灌注致急性肺損傷具有拮抗作用，JAK2/STAT3和PI3K/Akt信號通路都參與了這一過程當中。JAK2/STAT3通路的活化能夠加重I/R損傷；相反，PI3K/Akt信號通路的活化可以減弱I/R損傷。另外，JAK2/STAT3和PI3K/Akt信號通路之間存在交互作用，JAK2/STAT3信號通路可以影響PI3K/Akt信號通路。抑制劑Stattic通過抑制JAK2/STAT3信號通路促進了Akt的磷酸化，進而達到肺保護作用。然而，確切的機制需要我們進一步研究。

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(責任編輯： 林白霜， 羅森)

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