基金項目:陜西省西安市科技局資助基金項目(2012014)。

郭　亮，宋艷萍，王　浩，賈學(xué)友，郭曉波

(西安市中心醫(yī)院血液科,陜西西安 710000)

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流式微球技術(shù)定量檢測血小板膜糖蛋白在ITP中的應(yīng)用價值探討*

*基金項目:陜西省西安市科技局資助基金項目(2012014)。

郭亮，宋艷萍，王浩，賈學(xué)友，郭曉波

(西安市中心醫(yī)院血液科,陜西西安 710000)

摘要:目的應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測血小板表面膜糖蛋白，評價其在血小板減少性紫癜(ITP)診斷中的價值。方法選取2013年1月至2015年2月門診及住院部收治的77例ITP患者(ITP組)、43例非免疫性血小板減少癥患者(NITP組)及同期進行健康體檢的健康者30例(健康對照組)為研究對象。應(yīng)用鼠抗人GPⅡb/Ⅲa單抗、GPIa/Ⅱa單抗、GP Ib/Ⅸ單抗包被微球，采集空腹靜脈血分離血樣中血小板，將血小板裂解后與包被過的微球共同孵育，應(yīng)用流式細(xì)胞儀結(jié)合間接熒光免疫法檢測并比較三組血小板表面膜糖蛋白。分析流式微球技術(shù)診斷ITP的敏感度與特異度。結(jié)果ITP組患者血小板表面GPⅡb/Ⅲa、GPIa/Ⅱa、GP Ib/Ⅸ的水平均明顯高于NITP組及健康對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0．05)，NITP組患者高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0．05)。流式微球技術(shù)對ITP的診斷敏感度為92.2%(71/77)，特異度為89.0%(65/73)，準(zhǔn)確度為90.7%(136/150)。結(jié)論應(yīng)用流式微球技術(shù)定量檢測血小板膜糖蛋白對診斷ITP有應(yīng)用價值。

關(guān)鍵詞:流式微球技術(shù)；血小板表面膜糖蛋白；血小板減少性紫癜；診斷價值

特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)是臨床常見的出血性疾病，約占出血性疾病的1/3,患者主要表現(xiàn)為血小板持續(xù)減少，皮膚、黏膜出血，嚴(yán)重者可發(fā)生內(nèi)臟甚至顱內(nèi)出血而危及生命[1]。目前ITP的國內(nèi)診斷標(biāo)準(zhǔn)仍為排除法，除血小板減少這一項較肯定外，其他診斷標(biāo)準(zhǔn)都是相對的，療效反應(yīng)在系統(tǒng)治療后才能判定，故臨床上存在一些難以確診的病例，影響臨床治療，因此，尋找敏感而特異的檢測方法，對提高ITP的診斷有重要意義[2-3]。本研究選取2013年1月至2015年2月本院收治的77例ITP患者為研究對象，探討流式微球技術(shù)定量檢測血小板膜糖蛋白在ITP中的應(yīng)用價值，為其診斷提供依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料ITP組：ITP患者77例，均本院2013年1月至2015年2月門診及住院患者，其中男32例，女45例，男∶女=1.4∶1，年齡14~78歲，平均年齡45歲，均符合ITP診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]。NITP組：非免疫性血小板減少患者43例，其中男性26例，女性17例，年齡16～78歲，平均年齡45歲，淋巴瘤患者9例，再生障礙性貧血患者27例，骨髓異常增生綜合征患者7例。健康對照組：本院體檢中心健康者30例，其中男12例，女18例，男：女為1.5∶1，年齡15～79歲，平均46歲。

1.2儀器與試劑FACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國Beckon Dickinson公司)。BD FACS Lysing Solution(溶血素)和BD Cailibrite 3 Beads(流式細(xì)胞儀校準(zhǔn)試劑)等全部為BD進口試劑。QuantumPlex4.4um-carboxy1全部為Bangslabs公司進口微球。

1.3方法微球包被：用200 mg/mL的血小板膜糖蛋白單克隆抗體(抗-GPⅡb/Ⅲa、抗-GPIa/Ⅱa、抗-GP Ib/Ⅸ)分別包被QuantumPlex4.4um微球，抗體包被按照微球熒光從低到高的順序進行[5]。包被過程如下：200 μL QuantumPlex4.4μm微球l 000 r/min離心15 min，棄上清液。加入400 μL蛋白偶聯(lián)緩沖液，1 000 r/min離心15 min，棄上清液。加入200 μL蛋白偶聯(lián)緩沖液和 20 μL濃度為20 mg/mL的EDAC活化劑，活化15 min，加入100 μg抗體，室溫包被4 h。1 000 r/min離心15 min，棄上清液，加入400 μL清洗/貯存液，4 ℃存放。流式檢測：用200 μL O型血小板和血清在37 ℃下孵育30 min后，用PBS(EDTA，BSA)洗3遍，加入 150 μL血小板裂解液后，放置4 ℃30 min，2 500 r/min離心15 min，取上清液。加入100 μL血小板裂解液，25 μL微球，避光孵育3 h，用PBS(Tween20，BSA)洗2遍，加入羊抗人IgG-FITC、IgM-PE10 μL，避光孵育60 min，用PBS(Tween20，BSA)洗1遍，加400 μL PBS(Tween20，BSA)，上機檢測并獲取10 000個微球。同時將30個健康體檢者人作為對照樣本，并得到正常對照幾何平均熒光強度(MFI)[5]。

2結(jié)果

2.13組血小板膜糖蛋白表達(dá)結(jié)果比較ITP組患者血小板表面GPⅡb/Ⅲa、GPIa/Ⅱa、GP Ib/Ⅸ的水平均明顯高于NITP組及健康對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0．05)，NITP組患者高于健康對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0．05)。結(jié)果見表1。

表1　　三組血小板膜糖蛋白表達(dá)結(jié)果比較±s)

2.2流式微球技術(shù)對ITP診斷價值分析ITP組熒光強度比率均值及上下限為5.47(0.48~19.75)，NITP組為1.23(0.70~4.12)，健康對照組為0.98(0.41~1.62)，ITP組高于NITP組及健康對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0．05)。以健康對照組上限為分界值，大于1.62為陽性，小于1.62為陰性，流式微球技術(shù)對ITP的診斷敏感度為92.2%(71/77)，特異度為89.0%(65/73)，準(zhǔn)確度為90.7%(136/150)。

3討論

目前ITP的診斷標(biāo)準(zhǔn)主要依據(jù)臨床表現(xiàn)和多次化驗結(jié)果，血小板相關(guān)免疫球蛋白 (PAIg) 的檢測是輔助診斷條件之一，但大量研究顯示PAIg升高缺乏特異性，對ITP診斷幫助甚微，因此有研究者探索使用單克隆抗體固定血小板抗原法(MAIPA)及改良的MAIPA來檢測血小板膜糖蛋白自身抗體，雖然可以有限的提高自身抗體檢測的特異度，但因敏感度低、檢測方法繁瑣、耗時長等因素而限制了其臨床應(yīng)用。

ITP的發(fā)生是由于自身抗體致敏的血小板被單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)過度破壞所致，而自身抗體通常針對的是血小板膜糖蛋白GPⅡb/Ⅲa、GPIb/Ⅸ這些較為重要的靶抗原，除此之外還有GPIa/Ⅱa、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、GMP140等。這些少見類型的抗原決定簇有助于進一步揭示血小板自身抗體加劇ITP的發(fā)病機制[6-7]。流式微球技術(shù)(CBA)是一種新的高通量檢測方法，通過使用不同熒光編碼大小的聚合微球，可以同時分析復(fù)雜樣品中的多種分析物[8]。每一種微球表面被修飾使其與相應(yīng)的待測抗原或抗體反應(yīng)，將不同微球混合即可進行多重復(fù)合測定，該技術(shù)結(jié)合了熒光編碼微球的特異性與流式細(xì)胞儀的高度敏感性。本研究應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測血小板表面膜糖蛋白，評價其在ITP診斷中的價值，結(jié)果顯示：ITP患者GPⅡb/Ⅲa、GPIa/Ⅱa、GP Ib/Ⅸ的水平均明顯高于NITP組及健康對照組，而流式微球技術(shù)對ITP的診斷敏感度為92.2%(71/77)，特異度為89.0%(65/73)，高于目前臨床上應(yīng)用的PAIg檢測(特異度19%~27%)及MAIPA(敏感度39.0%~51.8%)，提示作為一個技術(shù)分析平臺，流式熒光微球技術(shù)大大提高ITP診斷敏感度及特異度，具有較高的推廣價值和應(yīng)用價值。

參考文獻(xiàn)

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[3]任娜，邱廣斌，王成彬．流式細(xì)胞術(shù)檢測血小板相關(guān)抗體在免疫性血小板減少癥中的應(yīng)用[J]．國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2014，35(13)：1689-1690．

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[5]李金霖．流式微球技術(shù)檢測特發(fā)性血小板減少性紫癜患者血小板糖蛋白自身抗體的方法建立及臨床應(yīng)用[D]．廣州：南方醫(yī)科大學(xué)，2010．

[6]趙赟霄，何楊，朱明清，等．流式免疫微球芯片技術(shù)檢測血小板膜糖蛋白特異性自身抗體的方法及其臨床應(yīng)用[J]．蘇州大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版，2012，32(6)：826-829．

[7]何楊，李錦霞，朱明清，等．流式微球技術(shù)檢測血小板膜糖蛋白特異性自身抗體法的建立臨床應(yīng)用[J]．中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2011，34(3)：1-6．

[8]常麗賢，楊林花，陳劍芳，等．應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測原發(fā)免疫性血小板減少癥患者血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa的表達(dá)及其臨床意義[J]．中華血液學(xué)雜志，2011，32(9)：630-632．

·臨床研究·

收稿日期：(2015-09-22)

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2015.24.044A

文章編號：1673-4130(2015)24-3614-02