高謀 徐如祥 許民輝 姚慧 董勤 張洪鈿 楊志軍 楊陽(yáng) 朱建偉

·基礎(chǔ)研究·

誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞與誘導(dǎo)多能干細(xì)胞在同源宿主腦內(nèi)的致瘤性及免疫原性研究

高謀 徐如祥 許民輝 姚慧 董勤 張洪鈿 楊志軍 楊陽(yáng) 朱建偉

目的對(duì)比研究誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞（iNSCs）與誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs）在同源宿主腦內(nèi)的致瘤性及免疫原性。方法采用腦立體定向儀將 1×106個(gè) C57BL/6（B6）小鼠胚胎干細(xì)胞（ESCs）、iPSCs、神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）及iNSCs分別移植到健康成年B6小鼠大腦運(yùn)動(dòng)皮層。于移植后14 d、28 d處死動(dòng)物，取材進(jìn)行形態(tài)學(xué)研究。結(jié)果IPSCs和ESCs均可在小鼠腦內(nèi)形成腫瘤導(dǎo)致組織壞死和免疫細(xì)胞浸潤(rùn)。然而，在iNSCs和NSCs移植組內(nèi)，本研究未觀察到腫瘤形成、腦損傷及免疫排斥反應(yīng)。結(jié)論INSCs移植物不具有致瘤性和免疫原性，因而較iPSCs移植物更安全。

致瘤性；免疫原性；誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞；誘導(dǎo)多能干細(xì)胞；移植

一直以來，干細(xì)胞療法的安全性評(píng)估是實(shí)驗(yàn)室和臨床研究的首要課題[1]。而安全性評(píng)估是一項(xiàng)系統(tǒng)工程，涉及面廣，其中干細(xì)胞的致瘤性和免疫原性是兩個(gè)非常重要的衡量指標(biāo)[2,3]。胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells，ESCs）和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）都具有無限增殖和多向分化的潛能，可形成腫瘤，限制其直接應(yīng)用于臨床[4]。此外，iPSCs由自體體細(xì)胞經(jīng)體外重編程操作而獲得，可能在回輸?shù)阶泽w體內(nèi)后引起免疫排斥反應(yīng)，類似于同種異體ESCs移植[5]。例如，有報(bào)道稱iPSCs不能在同源小鼠體內(nèi)形成畸胎瘤，因?yàn)閕PSCs的免疫原性引起了大量免疫細(xì)胞浸潤(rùn)[6]。可見，干細(xì)胞的致瘤性與免疫原性密切相關(guān)。然而，目前就體外重編程操作是否改變了iPSCs的免疫原性以及iPSCs能否在同源宿主體內(nèi)形成腫瘤仍有較多爭(zhēng)議[7-9]。與ESCs和iPSCs相比，神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells，NSCs）的增殖與分化能力均有限，體內(nèi)成瘤率較低，而且NSCs低表達(dá)主要組織相容性復(fù)合物等分子抗原，因而其移植安全性高于ESCs和iPSCs[2,10]。誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞（induced neural stem cells，iNSCs），直接由自體體細(xì)胞經(jīng)體外重編程操作而產(chǎn)生，不經(jīng)過iPSCs中間狀態(tài)，其增殖與分化特性類似于NSCs，并避免了NSCs因倫理學(xué)及細(xì)胞來源等限制。本研究前期通過在 小 鼠 胚 胎 成 纖 維 細(xì) 胞（mouse embryonic fibroblasts，MEFs）中過表達(dá) Oct4、Sox2、Klf4和 c-Myc等轉(zhuǎn)錄因子成功獲得iNSCs[11]。理論上，iNSCs類似于NSCs，體內(nèi)成瘤率低于ESCs和iPSCs[2,11]。然而，體外重編程操作可能引起工程干細(xì)胞在遺傳學(xué)或表觀遺傳學(xué)上的不穩(wěn)定[12]。目前尚無研究報(bào)道體外重編程操作是否改變了iNSCs的致瘤性和免疫原性。在本研究中，為評(píng)估干細(xì)胞療法應(yīng)用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的安全性，對(duì)比研究了C57BL/6（B6）小鼠ESCs、iPSCs、NSCs和iNSCs在同源宿主腦內(nèi)的致瘤性及免疫原性，現(xiàn)報(bào)道如下。

材料與方法

一、B6小鼠ESCs和iPSCs培養(yǎng)

C57BL/6（B6）小鼠ESCs和iPSCs均采用絲裂霉素處理后的B6小鼠MEFs作為飼養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，加入含15%胎牛血清 （fetal bovine serum，F(xiàn)BS），0.1 mmol/L非必須氨基酸（non-essential amino acids，NEAA），1% Nucleoside，2 mmol/L L-glutamine，10 ng/ml白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）和0.1 mmol/L β-Mercaptoethanol的杜爾伯科改良伊格爾培養(yǎng)基 （Dulbecco′s modified eagle medium，DMEM）培養(yǎng)基[11]。

二、B6小鼠NSCs培養(yǎng)

B6小鼠NSCs取自13.5 d胎鼠腦組織，采用含2%B27，20 ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）和20 ng/ml表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）的DMEM/F12與Neurobasal等體積混合培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

三、B6小鼠iNSCs培養(yǎng)

B6小鼠iNSCs直接由自體體細(xì)胞經(jīng)體外重編程操作而產(chǎn)生，采用含2%B27，20 ng/ml bFGF，20 ng/ml EGF，0.05%牛血清白蛋白（albumin from bovine serum，BSA）和2 mmol/L L-glutamine的DMEM/F12與Neurobasal等體積混合培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)[11]。

四、B6小鼠ESCs、iPSCs、NSCs和iNSCs動(dòng)物移植實(shí)驗(yàn)

采用隨機(jī)數(shù)字表法將健康成年B6小鼠，體質(zhì)量20～28 g，隨機(jī)分為ESCs、iPSCs、NSCs和iNSCs移植組。分別制備ESCs、iPSCs、NSCs和iNSCs單細(xì)胞懸液并用PBS漂洗3遍，調(diào)整細(xì)胞密度后放置于離心管中冰浴。用硫噴妥40 mg/kg腹腔注射麻醉小鼠。麻醉成功后將小鼠固定于腦立體定向儀上，剪除鼠毛暴露頭部皮膚，碘伏消毒后，鋪無菌洞巾，切開皮膚暴露前囟。以lambda縫向喙側(cè)5.5 mm，中線偏右側(cè)1.0 mm，硬膜下2.0 mm為注射點(diǎn)，用25 μl 22 s微量進(jìn)樣器以0.5 μl/min的速度注射5 μl細(xì)胞懸液，細(xì)胞總量為1×106個(gè)，結(jié)束后留針5 min，緩慢拔針縫合頭皮。

五、腦組織冰凍切片、病理染色和免疫熒光染色

細(xì)胞移植后14 d和28 d采用隨機(jī)數(shù)字表法各選取6只動(dòng)物進(jìn)行處死，灌注固定后取出大腦，先觀察大體形態(tài)，再作大腦冠狀面連續(xù)冰凍切片，切片厚度為10 μm。采用HE染色觀察腦組織病理形態(tài)學(xué)特征。根據(jù)病理染色結(jié)果進(jìn)行免疫熒光染色，用10%BSA封閉后，加入CD3、CD11b和CD19抗體4℃孵育過夜。漂洗后，加入熒光標(biāo)記二抗，室溫避光孵育2 h。用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染細(xì)胞核，在熒光顯微鏡下觀察，在20×鏡下隨機(jī)選取6個(gè)視野，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（特異性抗體標(biāo)記）和總細(xì)胞數(shù)（DAPI標(biāo)記），計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分率（%）=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理分析。生存時(shí)間以中位生存時(shí)間表示，生存率的非參數(shù)估計(jì)法采用Kaplan-Meier法，生存曲線組間比較采用Logrank檢驗(yàn)。小鼠腦組織內(nèi)浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞數(shù)量以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，資料先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，各組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、干細(xì)胞移植后顱內(nèi)腫瘤形成

在28 d的觀察期內(nèi)，未發(fā)現(xiàn)NSCs和iNSCs移植組內(nèi)動(dòng)物死亡。然而，ESCs和iPSCs移植組內(nèi)動(dòng)物的生存率明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。例如，在ESCs移植后的14 d和28 d分別有超過50%和90%的小鼠死亡。而在iPSCs移植后的14 d和28 d分別有超過40%和85%的小鼠死亡。ESCs和iPSCs移植組的動(dòng)物生存率無明顯差異，兩組的中位生存期分別為13 d和14 d。此外，在連續(xù)24周的觀察期內(nèi)，發(fā)現(xiàn)NSCs和iNSCs移植組的動(dòng)物生存率無明顯差異。

大體形態(tài)上，NSCs和iNSCs移植后的14 d和28 d小鼠腦組織標(biāo)本未見明顯的變化。然而，ESCs和iPSCs移植組內(nèi)大部分動(dòng)物的腦組織標(biāo)本可見不同程度的形態(tài)學(xué)改變：腫瘤形成和組織破壞。根據(jù)光鏡下病理染色結(jié)果，ESCs和iPSCs移植后腦組織形態(tài)學(xué)特征可分為：（1）惡性畸胎瘤形成，以內(nèi)、中和外各胚層的低分化、未成熟組織的出現(xiàn)為特征，并伴有嚴(yán)重的腦損傷和大量免疫細(xì)胞浸潤(rùn)（圖1）；（2）良性畸胎瘤形成，以成熟分化的三胚層組織的出現(xiàn)為特征，可伴有腦損傷和免疫細(xì)胞浸潤(rùn)（圖2）；（3）交界性腫瘤形成，介于良惡性畸胎瘤之間；（4）未檢出腫瘤形成、腦損傷和免疫排斥反應(yīng)。與之相對(duì)，包括整個(gè)大腦組織在內(nèi)的連續(xù)病理切片未檢出NSCs和iNSCs移植后腫瘤形成。

圖1 胚胎干細(xì)胞移植后14 d病理學(xué)檢查（HE染色，×100）

圖2 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞移植后14 d病理學(xué)檢查（HE染色，×100）

根據(jù)腦腫瘤的特征、組織損傷和免疫細(xì)胞浸潤(rùn)程度，本研究統(tǒng)計(jì)分析了ESCs和iPSCs移植物在移植后14 d和28 d小鼠顱內(nèi)形成腫瘤的比率，具體內(nèi)容見表1。結(jié)果發(fā)現(xiàn)ESCs和iPSCs移植物形成腫瘤的比率明顯高于二者未形成腫瘤的比率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），并且2級(jí)腫瘤的比率在ESCs和iPSCs移植組內(nèi)均為最高。此外，發(fā)現(xiàn)腫瘤的重量和組織損傷面積在3級(jí)腫瘤組內(nèi)是顯著高于2級(jí)和1級(jí)腫瘤組的，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而在同等級(jí)別腫瘤組內(nèi)，腫瘤檢出的比率、腫瘤的重量以及組織損傷面積在ESCs和iPSCs移植組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

二、干細(xì)胞移植后顱內(nèi)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)

為了明確干細(xì)胞移植后浸潤(rùn)到顱內(nèi)免疫細(xì)胞的類型，本研究采用小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞（CD11b）、T細(xì)胞（CD3）和B細(xì)胞（CD19）等特異性抗體分別進(jìn)行腦組織冰凍切片的免疫熒光染色。結(jié)果發(fā)現(xiàn)這幾類免疫細(xì)胞均可在ESCs和iPSCs移植物形成腫瘤的腦組織中檢測(cè)到。在激光共聚焦顯微鏡下，可見由ESCs和iPSCs移植物形成的腫瘤組織表達(dá)綠色熒光蛋白，因此，采用特異性抗體標(biāo)記的各類免疫細(xì)胞可與腫瘤組織和干細(xì)胞移植物相區(qū)別。此外，主要分布在腫瘤生長(zhǎng)和腦損傷區(qū)域內(nèi)的免疫細(xì)胞，其數(shù)量是與腫瘤惡性程度及腦損傷嚴(yán)重程度呈正相關(guān)的。

例如，在ESCs和iPSCs移植物形成3級(jí)腫瘤組內(nèi)，小鼠腦組織均可見大量免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和嚴(yán)重的組織破壞。然而，在ESCs和iPSCs移植物形成的2級(jí)和1級(jí)腫瘤組內(nèi)，小鼠腦組織內(nèi)浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞數(shù)量相對(duì)低于3級(jí)腫瘤組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。此外，在同等級(jí)別腫瘤組內(nèi)，顱內(nèi)浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞數(shù)量在ESCs和iPSCs移植組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與之相對(duì)，本研究發(fā)現(xiàn)具有綠色熒光蛋白標(biāo)簽的iNSCs移植物在移植后28 d小鼠顱內(nèi)未檢測(cè)出腫瘤形成和免疫排斥反應(yīng)。而且，在NSCs移植物以及ESCs和iPSCs移植物未形成腫瘤的腦組織中均罕見上述幾類免疫細(xì)胞浸潤(rùn)。

表1 ESCs和iPSCs移植組腫瘤分級(jí)

討論

目前，以移植干細(xì)胞為主的治療方法給中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的患者帶來了新的希望。因而，評(píng)估干細(xì)胞移植物在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的安全性是首先需要研究的課題[2,3]。本研究主要檢測(cè)了ESCs、iPSCs、NSCs和iNSCs在同源宿主腦內(nèi)的致瘤性及免疫原性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)iPSCs和ESCs均可在小鼠腦內(nèi)形成腫瘤導(dǎo)致組織壞死和免疫細(xì)胞浸潤(rùn)。然而，在iNSCs和NSCs移植組內(nèi)，未觀察到腫瘤形成、腦損傷及免疫排斥反應(yīng)。由此可見iNSCs移植物不具有致瘤性和免疫原性，因而較iPSCs移植物更安全。

如前已述，筆者將干細(xì)胞移植物注射入同源小鼠大腦中作為研究對(duì)象主要基于以下幾方面原因。首先，本研究的目的是評(píng)估移植的干細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的安全性。而且，在大腦內(nèi)部獨(dú)特的微環(huán)境中，研究不同類型干細(xì)胞移植物的致瘤性和免疫原性具有重大意義[2,13]。然而，目前少有研究對(duì)比iNSCs與iPSCs在腦內(nèi)的致瘤性和免疫原性。此外，由于顱內(nèi)容積有效，不斷生長(zhǎng)的腫瘤可以引起顱內(nèi)壓增高和腦組織破壞，這些都與動(dòng)物死亡率升高密切相關(guān)[14,15]。因而，可以通過觀察小鼠的行為改變來分析腫瘤形成。除此之外，中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的免疫反應(yīng)非常復(fù)雜而多樣，目前也是研究的熱點(diǎn)[16,17]。因而，本研究選取了具有正常免疫功能的同源近交系小鼠大腦作為干細(xì)胞移植的位點(diǎn)。

為了比較干細(xì)胞移植物的致瘤性，本研究首次將腦腫瘤進(jìn)行分類并統(tǒng)計(jì)分析了各類型腫瘤的比率。這種新的研究方法較以往研究能更加系統(tǒng)而全面地評(píng)估干細(xì)胞移植物的致瘤性[6]。本研究發(fā)現(xiàn)雖然ESCs和iPSCs移植物具有致瘤性，但二者在顱內(nèi)也并非100%形成腫瘤。此外，同種類型的干細(xì)胞移植物可在顱內(nèi)形成多種類型的腫瘤，包括良性、交界性和惡性腫瘤。本研究結(jié)果與之前的研究部分相符，不同之處可能是腦內(nèi)微環(huán)境對(duì)干細(xì)胞移植物的行為產(chǎn)生了復(fù)雜的作用而導(dǎo)致的[3,16]。

接下來，本研究檢測(cè)了干細(xì)胞移植物能否在同源宿主腦內(nèi)引起免疫排斥反應(yīng)。結(jié)果與之前的研究有所不同，可以歸納為以下幾個(gè)方面。首先，在接受ESCs移植物的同源宿主腦內(nèi)，本研究檢測(cè)到免疫細(xì)胞同樣浸潤(rùn)于形成腫瘤的區(qū)域，而這些未經(jīng)過體外重編程操作的ESCs本應(yīng)該避免自體免疫排斥反應(yīng)。此外，在同等級(jí)別腫瘤組內(nèi)，顱內(nèi)浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞數(shù)量在ESCs和iPSCs移植組間無明顯差異。并且，如上所述，免疫細(xì)胞的數(shù)量與形成腫瘤的良惡性分級(jí)以及腦損傷嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。因此，本研究推測(cè)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)可能并非由干細(xì)胞移植物的免疫原性所導(dǎo)致，而是由ESCs和iPSCs移植物形成腫瘤和組織破壞等引起。

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Tumourigenicity and immunogenicity of induced neural stem cell grafts versus induced pluripotent stem cell grafts in syngeneic mouse brain

Gao Mou,Xu Ruxiang,Xu Minhui,Yao Hui, Dong Qin,Zhang Hongtian,Yang Zhijun,Yang Yang,Zhu Jianwei.Affiliated Bayi Brain Hospital, General Hospital of PLA Army,Beijing 100700,China

Xu Ruxiang,Email:zjxuruxiang@163.com

ObjectiveTo provide scientific basis for evaluating the tumourigenicity and immunogenicity of induced neural stem cells(iNSCs)and induced pluripotent stem cells(iPSCs)in syngeneic mouse brain.M ethodsA total of 1×106C57BL/6(B6)embryonic stem cells(ESCs),iPSCs, neural stem cells(NSCs)or iNSCs were separately transplanted into the motor cortex of syngeneic adult mouse with normal immunologic function.At 14 and 28 d post-implantation,animals were sacrificed for morphological analysis.ResultsBoth iPSCs and ESCs were able to form tumours in the mouse brain, leading to tissue destruction along with immune cell infiltration.In contrast,no evidence of tumour formation,brain injury or immune rejection was observed with iNSCs or NSCs.ConclusionINSC grafts,which lacked any resulting tumourigenicity or immunogenicity,are safer than iPSC grafts.

Tumourigenicity;Immunogenicity;Induced neural stem cell;Induced pluripotent stem cell;Transplantation

2016-09-26）

（本文編輯：張麗）

10.3877/cma.j.issn.2095-9141.2016.06.007

100700 北京，中國(guó)人民解放軍陸軍總醫(yī)院附屬八一腦科醫(yī)院

徐如祥，Email：zjxuruxiang@163.com

高謀,徐如祥,許民輝,等.誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞與誘導(dǎo)多能干細(xì)胞在同源宿主腦內(nèi)的致瘤性及免疫原性研究[J/CD].中華神經(jīng)創(chuàng)傷外科電子雜志,2016,2(6):350-354.