吳龍龍 申鳳俊

NOX4與肝纖維化關(guān)系的研究進(jìn)展

吳龍龍 申鳳俊

還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶(NOX)是一種由多種蛋白質(zhì)亞基組成的復(fù)合體，其能生成消除病原微生物的活性氧簇(ROS)?，F(xiàn)已證實(shí)NOX介導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)與肝纖維化的發(fā)生密切相關(guān)，而NOX的亞基NOX4則起到了關(guān)鍵作用，它對(duì)引起肝纖維化的主要細(xì)胞——肝星狀細(xì)胞(HSC)具有顯著的活化效應(yīng)，并可通過(guò)介導(dǎo)多種細(xì)胞內(nèi)外的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與HSC的持續(xù)激活以及肝細(xì)胞的增殖、凋亡等過(guò)程，最終導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生。

NADPH氧化酶4；氧化應(yīng)激；細(xì)胞凋亡；肝纖維化

肝纖維化是由多種病因引起的急慢性肝臟損傷導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)在肝組織間質(zhì)過(guò)度沉積、降解減少而引起的一種病理改變。近年來(lái)的研究表明，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶(NOX)通過(guò)產(chǎn)生活性氧簇(ROS)介導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用?，F(xiàn)已證實(shí)NOX的多種亞基如NOX1、NOX2及NOX4等在實(shí)驗(yàn)性肝纖維化大鼠中表達(dá)增加，參與了肝纖維化過(guò)程[1]，而NOX4可能在其中起著更為重要的作用，其在活化的肝星狀細(xì)胞(HSC)中表達(dá)較前兩者更為豐富，并且可通過(guò)介導(dǎo)多條細(xì)胞信號(hào)通路，誘導(dǎo)HSC的持續(xù)激活[2-3]。此外，NOX4還可通過(guò)參與肝細(xì)胞的增殖、凋亡以及肌成纖維細(xì)胞的遷移等過(guò)程，促進(jìn)纖維化的發(fā)展，這提示NOX4可能將成為肝纖維化新的治療靶點(diǎn)。本文就NOX4在肝纖維化中作用的研究進(jìn)展作一綜述。

1 NOX家族與肝纖維化

NADPH氧化酶是一種由多種蛋白質(zhì)亞基組成的復(fù)合體，已證實(shí)在多種組織細(xì)胞中都存在NOX的表達(dá)。生理情況下，NOX處于低度表達(dá)、低活性狀態(tài)，其生成ROS的水平較低，并且主要是作為第二信使參與細(xì)胞增殖、分化等生物調(diào)節(jié)[4]。而肝臟在受到病毒等損傷因素刺激時(shí)，包括肝細(xì)胞及HSC在內(nèi)的NOX活化產(chǎn)生大量ROS，導(dǎo)致氧化應(yīng)激的發(fā)生。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，NOX激活產(chǎn)生ROS介導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。Bataller等[5]首先證實(shí)，HSC表面存在NOX1、NOX4等亞基以及p47phox等組件的表達(dá)，在HSC由靜止轉(zhuǎn)為活化時(shí)，它們的mRNA表達(dá)上調(diào)。在肝纖維化始動(dòng)階段，NOX可調(diào)節(jié)HSC的激活及細(xì)胞凋亡，并參與調(diào)控HSC向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，以及血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)、血小板生成素和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)等促纖維化因子作用下細(xì)胞的活化[6-7]。

NOX4作為NADPH氧化酶家族的重要成員，相較于其他NOX的同工酶有其獨(dú)特的特點(diǎn)，研究發(fā)現(xiàn)，NOX4可能在肝臟損傷及之后的纖維化過(guò)程中起著更為廣泛的作用。NOX4在肝細(xì)胞和HSC中高度表達(dá)，并且在活化的HSC中表達(dá)明顯增加。而在HCV感染者中，NOX4的上調(diào)比NOX2更為顯著，卻未能發(fā)現(xiàn)NOX1表達(dá)上的任何變化[8]。婁安妮等[9]發(fā)現(xiàn)在膽管結(jié)扎大鼠肝組織內(nèi)，NOX4蛋白表達(dá)明顯升高，并與膽管結(jié)扎時(shí)間呈正相關(guān)，當(dāng)手術(shù)解除膽管結(jié)扎后，NOX4蛋白的升高趨勢(shì)受到抑制。此外，Lan等[2]通過(guò)對(duì)比觀察長(zhǎng)期的NOX1和NOX4缺乏對(duì)肝纖維化進(jìn)程的影響，發(fā)現(xiàn)兩者通過(guò)促進(jìn)脂質(zhì)過(guò)氧化、HSC增殖等在肝纖維化中扮演重要角色，并且NOX4顯示了更強(qiáng)的促HSC活化作用，而NOX1和NOX4的共同抑制劑GKT137831則可減弱上述效應(yīng)[10]。以上結(jié)果表明，NOX4介導(dǎo)的氧化應(yīng)激參與了肝臟的損傷和纖維化等病理過(guò)程。

2 NOX4通過(guò)TGF-β/Smad通路介導(dǎo)肝纖維化

TGF-β是肝纖維化重要的始動(dòng)因子，可通過(guò)TGF-β/Smad信號(hào)通路激活HSC，刺激包括Ⅰ、Ⅲ及Ⅳ型膠原蛋白等的合成與沉積。大量研究表明，NOX4的促纖維化反應(yīng)受TGF-β的介導(dǎo)，其在TGF-β誘導(dǎo)的纖維化反應(yīng)中具有促進(jìn)膠原蛋白產(chǎn)生等重要作用[11-12]。有實(shí)驗(yàn)對(duì)NOX4缺乏的HSC進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)TGF-β1介導(dǎo)的HSC的活化需要依賴NOX4產(chǎn)生ROS[13]。而Lee等[14]發(fā)現(xiàn)，保肝藥物三白草酮可通過(guò)抑制自噬作用及NOX4介導(dǎo)的氧化應(yīng)激作用，減弱TGF-β/Smad3通路誘導(dǎo)的纖維化及HSC的活化。

Boudreau等[15]采用丙型肝炎病毒(HCV)感染肝細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)性的HCV核心蛋白誘導(dǎo)了NOX4的高水平表達(dá)以及NOX4依賴的ROS的產(chǎn)生，這個(gè)效應(yīng)可以被TGF-β中和性抗體或占據(jù)優(yōu)勢(shì)的TGF-β負(fù)性受體弱化，表明HCV以自分泌的TGF-β所依賴的方式調(diào)控了NOX4的表達(dá)。蔡雙明[16]發(fā)現(xiàn)，Ang(1～7)能夠抑制AngⅡ?qū)SC-T6細(xì)胞的NOX4及抗氧化因子Nrf2、GCLC的誘導(dǎo)作用，該研究還表明AngⅡ可以誘導(dǎo)由NOX4介導(dǎo)的氧化應(yīng)激，激活Smad3通路，促進(jìn)HSC活化及膠原蛋白合成，因此認(rèn)為Smad3與NOX4是上下游信號(hào)的關(guān)系。以往研究證實(shí)，在腎和肺的肌成纖維細(xì)胞中，NOX4是Smad3的下游因子[17]。而有研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用針對(duì)NOX4表達(dá)/活化的藥理性抑制劑可以阻止纖維化進(jìn)程，但并不抑制TGF-β介導(dǎo)的其他有利效應(yīng)[8]，如可通過(guò)抑制上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)而阻止腫瘤的始動(dòng)階段等，因此NOX4同樣是TGF-β/Smad通路的一個(gè)重要的下游因子[18-19]。而且NOX4可以反饋形式調(diào)節(jié)TGF-β/Smad信號(hào)的促纖維化效應(yīng)[20]。NOX4介導(dǎo)ROS的產(chǎn)生與TGF-β/Smad信號(hào)通路相關(guān)聯(lián)，是一條關(guān)鍵的促纖維化通路。

3 NOX4誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡與肝纖維化

肝纖維化涉及多種細(xì)胞機(jī)制，NOX4除了介導(dǎo)HSC的活化，還可以通過(guò)誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡發(fā)揮促纖維化作用。在肝臟中，除了AngⅡ等受體激動(dòng)劑可以激活NOX外，肝細(xì)胞死亡后形成的凋亡小體被HSC吞噬后不僅可以刺激巨噬細(xì)胞生成TGF-β，還可以促進(jìn)HSC的活化，導(dǎo)致Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)上調(diào)[21]。Jiang等[18]發(fā)現(xiàn)，NOX4在死亡配體誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡中具有十分關(guān)鍵的作用，而敲除NOX4基因的肝細(xì)胞對(duì)FasL或腫瘤壞死因子-α/放線菌素D誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡更具有抵抗力。Tanaka等[22]通過(guò)觀察肝內(nèi)微循環(huán)障礙引起缺氧導(dǎo)致的肝細(xì)胞凋亡帶，發(fā)現(xiàn)大部分凋亡肝細(xì)胞與NOX4共定位，并且凋亡帶中NOX4介導(dǎo)的氧化應(yīng)激水平的增加可能促進(jìn)了肝細(xì)胞凋亡的連續(xù)發(fā)生。同樣的，用TGF-β刺激敲除NOX4基因的肝細(xì)胞，可發(fā)現(xiàn)NOX的活化、細(xì)胞凋亡蛋白酶的激活均被減弱，表明NOX4介導(dǎo)了TGF-β誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。以上研究表明，NOX4介導(dǎo)細(xì)胞凋亡促進(jìn)了纖維化的發(fā)展，而抑制凋亡則減弱了肝臟的促纖維化應(yīng)答。顏鳳[23]在對(duì)血管平滑肌細(xì)胞(HUVEC)的研究中發(fā)現(xiàn)，用TGF-β刺激HUVEC可以增加NOX4 mRNA的表達(dá)并上調(diào)NOX4蛋白的表達(dá)水平，而將腺病毒過(guò)表達(dá)NOX4后轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細(xì)胞，不僅抑制了內(nèi)皮細(xì)胞的基礎(chǔ)凋亡反應(yīng)，而且抑制了血清饑餓引起的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。此外，內(nèi)皮細(xì)胞中過(guò)表達(dá)NOX4后，再給予TGF-β刺激，并不能引起明顯的凋亡反應(yīng)，這一結(jié)果提示過(guò)表達(dá)外源性NOX4可能具有抗內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用。

4 NOX4介導(dǎo)的其他促纖維化途徑

近期研究發(fā)現(xiàn)，NOX4誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS介導(dǎo)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生，這種應(yīng)激反應(yīng)在體外或體內(nèi)都可以提高HSC對(duì)凋亡的敏感性[24-25]。Kim等[26]發(fā)現(xiàn)，水飛薊賓可通過(guò)介導(dǎo)NOX4的產(chǎn)生，誘發(fā)線粒體ROS依賴的細(xì)胞凋亡，這一過(guò)程與Ca2+穩(wěn)態(tài)的破壞及伴發(fā)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)聯(lián)。在對(duì)心臟和腎的研究中發(fā)現(xiàn)，NOX4還可能通過(guò)介導(dǎo)內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)解偶聯(lián)，促進(jìn)纖維化的發(fā)生。Lee等[27]的研究采用AngⅡ刺激腎小球系膜細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)NOX4是過(guò)氧亞硝酸鹽依賴的eNOS解偶聯(lián)作用以及由此導(dǎo)致的一氧化氮(NO)生物利用度下降的重要中介，NOX4和線粒體ROS不僅是AngⅡ誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要介質(zhì)，而且導(dǎo)致了eNOS的功能障礙和系膜細(xì)胞的纖維化損傷。在對(duì)心臟的研究中也證實(shí)了eNOS 的脫偶聯(lián)可引起心肌肥厚和纖維化。關(guān)于eNOS解偶聯(lián)作用在肝纖維化過(guò)程中的作用尚需要進(jìn)一步研究。

上述研究均證實(shí)了NOX4在肝纖維化中扮演著重要的角色，基于此，許多研究致力于探索新型的NOX4抑制劑，以期用于臨床上改善纖維化。有研究認(rèn)為，TGF-β具有抑制生長(zhǎng)和誘導(dǎo)凋亡的能力，是一種上皮細(xì)胞腫瘤抑制因素[28]。Crosas-Molist等[29]發(fā)現(xiàn)，NOX4可能對(duì)肝細(xì)胞癌的發(fā)生起保護(hù)作用，因?yàn)門GF-β誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞的衰老是NOX4依賴性的。他們通過(guò)沉默肝癌細(xì)胞株中的NOX4基因，發(fā)現(xiàn)可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖，提示NOX4可能在肝臟中具有抑制腫瘤的功能，其主要證據(jù)如下：(1)在實(shí)驗(yàn)大鼠模型中肝臟腫瘤的發(fā)生與NOX4的下調(diào)相關(guān)聯(lián)；(2)在人類肝癌細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)NOX4的表達(dá)處于低水平。

5 小結(jié)與展望

綜上所述，NOX4可通過(guò)多種途徑參與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。它不僅可介導(dǎo)TGF-β/Smad信號(hào)通路，誘導(dǎo)HSC的持續(xù)活化，而且參與了TGF-β或凋亡配體誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡。此外，還需要關(guān)注NOX4可能在肝臟中起著抑制腫瘤的作用。肝纖維化往往會(huì)進(jìn)展為肝硬化，而肝硬化是一種癌前狀態(tài)，有較大概率會(huì)發(fā)展為肝細(xì)胞癌，這種長(zhǎng)期持續(xù)性的NOX4抑制是否會(huì)產(chǎn)生不利的后果仍需要更多的研究進(jìn)行驗(yàn)證，但也不能因此而否認(rèn)NOX4作為新型抗纖維化治療靶點(diǎn)的重要意義。對(duì)NOX介導(dǎo)的氧化應(yīng)激的調(diào)控機(jī)制作進(jìn)一步的研究，將有助于臨床肝纖維化治療策略的改善。

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(本文編輯：周駿)

030001 太原，山西醫(yī)科大學(xué)(吳龍龍)；030001 太原，山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院消化內(nèi)科(申鳳俊)

申鳳俊，Email: 919016603@qq.com

10.3969/j.issn.1673-534X.2016.06.003

2016-5-30)