張曉寧，王建海，鞠明艷，景亞青，李克秋，李光

(天津醫(yī)科大學(xué)，天津300070)

·臨床研究·

他克莫司對(duì)肝移植患者外周靜脈血IL-2、IL-10基因表達(dá)的影響及意義

張曉寧，王建海，鞠明艷，景亞青，李克秋，李光

(天津醫(yī)科大學(xué)，天津300070)

目的 探討他克莫司(FK506)對(duì)肝移植患者外周靜脈血IL-2、IL-10基因表達(dá)的影響及意義。方法 選擇接受原位肝移植患者60例，均采用FK506+甲基強(qiáng)的松龍+嗎替麥考酚酯三聯(lián)用藥治療。肝移植術(shù)后第1、3周取外周血，檢測(cè)血清ALT、AST及外周靜脈血IL-2、IL-10基因表達(dá)。結(jié)果 與肝移植術(shù)后1周比較，肝移植術(shù)后3周患者血清ALT水平明顯降低(P<0.05)，而血清AST水平變化不明顯(P>0.05)；肝移植術(shù)后3周外周靜脈血IL-2基因表達(dá)明顯降低(P<0.05)，IL-10基因表達(dá)明顯升高(P<0.01)。血清ALT水平與IL-2基因表達(dá)呈正相關(guān)，與IL-10基因表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P均<0.05)；血清AST水平與IL-2、IL-10基因表達(dá)均無(wú)相關(guān)性(P均>0.05)。結(jié)論 FK506可能通過(guò)影響外周靜脈血IL-2、IL-10基因表達(dá)，從而抑制免疫排斥，誘導(dǎo)免疫耐受。

肝移植；他克莫司；白細(xì)胞介素2；白細(xì)胞介素10；天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶；丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶

肝移植是臨床終末期肝病最有效的治療方式。但移植受體對(duì)供體肝的免疫排斥反應(yīng)會(huì)造成一定程度的肝損傷[1]，這是影響移植肝存活的主要因素。肝移植后多種細(xì)胞因子參與受體的免疫調(diào)節(jié)過(guò)程，如Th1/Th2細(xì)胞調(diào)節(jié)因子[2]。Th1細(xì)胞可分泌IL-2，誘導(dǎo)T、B細(xì)胞活化增殖，參與免疫應(yīng)答；Th2細(xì)胞可分泌IL-10，通過(guò)抑制IL-2的分泌阻斷抗原遞呈作用，進(jìn)而抑制T細(xì)胞的活化[3]。兩種細(xì)胞調(diào)節(jié)因子與移植物的長(zhǎng)期存活和移植物的免疫耐受密切相關(guān)。因此，臨床上必須通過(guò)使用免疫抑制劑來(lái)抑制肝移植后的免疫排斥反應(yīng)。他克莫司(FK506)是從鏈霉菌屬中分離出的發(fā)酵產(chǎn)物，近年來(lái)被廣泛用于肝移植的免疫治療[4]。目前對(duì)FK506的研究主要集中在其代謝過(guò)程與CYP3A5基因多態(tài)性的關(guān)系，對(duì)其藥效學(xué)的研究相對(duì)較少。為此，我們進(jìn)行了如下研究。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2013～2014年在天津市第一中心醫(yī)院初次接受肝移植患者60例，男44例、女16例，年齡(53±9)歲，體質(zhì)量(71.57±15.84)kg；原發(fā)?。焊伟?9例，乙肝后肝硬化18例，丙肝后肝硬化9例，隱源性肝硬化10例，酒精性肝硬化1例，原發(fā)性膽汁性肝硬化3例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡18～65歲；②初次接受原位肝移植手術(shù)；③接受FK506+甲基強(qiáng)的松龍+嗎替麥考酚酯三聯(lián)用藥。排除標(biāo)準(zhǔn)：①年齡<18歲；②肝移植失敗或治療無(wú)效去世；③使用其他免疫抑制劑治療。本研究經(jīng)天津市第一中心醫(yī)院倫理委員會(huì)及天津醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者或家屬知情同意。

1.2 治療方法 所有患者肝移植術(shù)后采用聯(lián)合免疫抑制劑治療：FK506+甲基強(qiáng)的松龍+嗎替麥考酚酯?；颊哂诟我浦残g(shù)后第3天開(kāi)始口服FK506，初始劑量為4 mg/d，間隔12 h服用，每日晨起服用FK506前檢測(cè)血藥濃度，目標(biāo)血藥濃度為7～10 ng/mL，根據(jù)血藥濃度調(diào)整用藥劑量；甲基強(qiáng)的松龍術(shù)后即刻一次性靜脈給藥1 000 mg，術(shù)后次日靜脈給藥量自240 mg/d起，每日減少40 mg，直至給藥量為40 mg/d，之后改為口服強(qiáng)的松片20 mg/d；嗎替麥考酚酯術(shù)前即刻一次性口服500 mg，術(shù)后次日開(kāi)始口服100 mg/d。

1.3 相關(guān)指標(biāo)觀察

1.3.1 血清ALT、AST水平 所有研究對(duì)象肝移植術(shù)后1、3周取外周靜脈血3 mL，3 000 r/min離心10 min，取血清保存?zhèn)錂z。采用光電比色法檢測(cè)血清ALT、AST。

1.3.2 外周靜脈血IL-2、IL-10基因表達(dá) 采用TRIzol法抽提外周靜脈血總RNA，超微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA純度和濃度，RNA濃度>200 ng/μL，OD260/OD280為1.8～2.2，說(shuō)明提取的總RNA質(zhì)量合格。采用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，測(cè)定cDNA的純度和濃度，cDNA濃度>200 ng/μL，OD260/OD280為1.8～2.2，說(shuō)明逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA質(zhì)量合格。IL-2、IL-10基因表達(dá)檢測(cè)采用Real-time PCR法。引物序列：IL-2：上游引物5′-CTGGAGCATTTACTGCTGGATT-3′，下游引物5′-GCCTTCTTGGGCATGTAAAAC-3′，PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度110 bp；IL-10：上游引物5′-CCACGCTTTCTAGCTGTTGA-3′，下游引物5′-GCTCCCTGGTTTCTCTTCCT-3′，PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度114 bp；GAPDH：上游引物5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′，下游引物5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′，PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度87 bp。PCR反應(yīng)體系為10 μL：模板cDNA 2 μL，上下游引物各0.2 μL，SYBR Green熒光染料5 μL，無(wú)核酸酶水2.6 μL。PCR反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，95 ℃ 15 s。采用2-ΔΔCt法計(jì)算外周靜脈血IL-2、IL-10基因的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 肝移植術(shù)后血清ALT、AST水平變化 肝移植術(shù)后1、3周血清ALT水平分別為(135.92±22.52)、(85.88±12.55)U/L，血清AST水平分別為(38.84±4.34)、(38.77±4.60)U/L。與肝移植術(shù)后1周比較，肝移植術(shù)后3周血清ALT水平明顯降低(P<0.05)，血清AST水平變化不明顯(P>0.05)。

2.2 肝移植術(shù)后外周靜脈血IL-2、IL-10基因表達(dá)變化 肝移植術(shù)后1、3周外周靜脈血IL-2基因的相對(duì)表達(dá)量分別為1.89±1.25、1.28±1.04，IL-10基因的相對(duì)表達(dá)量分別為2.19±2.16、4.25±3.26。與肝移植術(shù)后1周比較，肝移植術(shù)后3周IL-2基因的相對(duì)表達(dá)量明顯降低(P<0.05)，IL-10基因的相對(duì)表達(dá)量明顯升高(P<0.01)。

2.3 血清ALT、AST與IL-2、IL-10基因表達(dá)的關(guān)系 相關(guān)性分析顯示，血清ALT水平與IL-2基因表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.412，P<0.05)，與IL-10基因表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.393，P<0.05)；血清AST水平與IL-2、IL-10基因表達(dá)無(wú)相關(guān)性(r分別為0.115、-0.025，P均>0.05)。

3 討論

肝移植后受體對(duì)移植肝的免疫排斥是影響移植肝存活的主要因素。FK506是一種鈣調(diào)磷酸酶抑制劑，與FK506結(jié)合蛋白結(jié)合后，可抑制鈣調(diào)蛋白依賴(lài)的蛋白磷酸酶抑制活化T細(xì)胞核因子的活性，進(jìn)而抑制IL-2的表達(dá)，最終發(fā)揮免疫抑制作用[5，6]。目前臨床主要通過(guò)監(jiān)測(cè)肝移植患者FK506血藥濃度及肝功能(ALT、AST)來(lái)調(diào)整用藥劑量[7]，并未深入研究肝移植患者外周血免疫因子的變化，不能準(zhǔn)確反映患者的免疫狀態(tài)。 IL-2可誘導(dǎo)T、B細(xì)胞活化增殖，為調(diào)控免疫應(yīng)答的重要因子，具有廣泛的生物學(xué)活性；IL-10是一種多功能負(fù)性調(diào)節(jié)因子，通過(guò)抑制IL-2的分泌阻斷抗原遞呈作用，進(jìn)而抑制T細(xì)胞的活化[8]。研究表明，免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生常伴有外周靜脈血IL-2基因高表達(dá)和IL-10基因低表達(dá)、甚至不表達(dá)，免疫耐受時(shí)與之相反[9～12]。二者與移植物的長(zhǎng)期存活和移植物的免疫耐受密切相關(guān)[13～15]。本研究中，患者肝移植術(shù)后3周血清ALT水平較肝移植術(shù)后1周時(shí)顯著降低，說(shuō)明機(jī)體免疫排斥造成的肝損傷明顯減輕，移植肝肝功能逐漸趨于穩(wěn)定；肝移植術(shù)后1、3周血清AST水平均在正常范圍，說(shuō)明移植肝未出現(xiàn)明顯肝損傷。因此，本研究以肝移植術(shù)后1、3周為觀察點(diǎn)，觀察了外周靜脈血IL-2、IL-10基因表達(dá)。與肝移植術(shù)后1周比較，肝移植術(shù)后3周外周靜脈血IL-2基因表達(dá)明顯降低，而IL-10基因表達(dá)顯著升高，說(shuō)明FK506可抑制患者體內(nèi)IL-2基因的表達(dá)，減輕免疫排斥反應(yīng)；同時(shí)可增強(qiáng)IL-10基因的表達(dá)，誘導(dǎo)免疫耐受。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，血清ALT水平與IL-2基因表達(dá)呈正相關(guān)，與IL-10基因表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明肝移植患者免疫狀態(tài)可影響術(shù)后早期的肝功能；而血清AST水平與IL-2、IL-10基因表達(dá)均無(wú)相關(guān)性，說(shuō)明一定程度的免疫狀態(tài)改變并不會(huì)加重肝損傷。

綜上所述，F(xiàn)K506可通過(guò)影響外周靜脈血IL-2、IL-10基因表達(dá)，抑制免疫排斥反應(yīng)，誘導(dǎo)免疫耐受。

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國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展技術(shù)(2012AA021003)；國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21177091)。

李光(E-mail： lig@tmu.edu.cn)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.24.013

R392.4

B

1002-266X(2016)24-0040-03

2015-10-13)