楊永紅，羅靜，袁軍，王樹輝

(1貴州省骨科醫(yī)院，貴陽550007；2貴州省人民醫(yī)院)

刀豆蛋白A對(duì)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞CCR4和CCR6表達(dá)的影響

楊永紅1，羅靜1，袁軍2，王樹輝2

(1貴州省骨科醫(yī)院，貴陽550007；2貴州省人民醫(yī)院)

目的 探討刀豆蛋白A(ConA)對(duì)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞趨化因子受體4(CCR4)和CCR6表達(dá)的影響。方法 采用密度梯度離心法分離1名健康志愿者的外周血單個(gè)核細(xì)胞，免疫磁珠陰性分選法富集CD4+T細(xì)胞。采用流式細(xì)胞術(shù)分選出CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和CD4+CD25-T細(xì)胞，并分析其純度及存活率。采用20 μg/mL ConA對(duì)細(xì)胞進(jìn)行刺激，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)兩種細(xì)胞刺激0、24、48 h的CCR4和CCR6表達(dá)。結(jié)果 流式細(xì)胞術(shù)分選CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的純度為97.8%，CD4+CD25-T細(xì)胞為90.1%，兩種細(xì)胞存活率均>90%。隨著ConA刺激時(shí)間延長(zhǎng)，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和CD4+CD25-T細(xì)胞CCR4表達(dá)均呈升高趨勢(shì)，CCR6表達(dá)均呈先升高后降低趨勢(shì)；ConA刺激0、24、48 h，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞CCR4、CCR6表達(dá)均高于CD4+CD25-T細(xì)胞(P均<0.01)。結(jié)論 CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞CCR4、CCR6表達(dá)均升高，經(jīng)ConA刺激后CCR4表達(dá)呈時(shí)間依賴性。

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；趨化因子受體4；趨化因子受體6；刀豆蛋白A；T淋巴細(xì)胞

在移植免疫學(xué)領(lǐng)域，誘發(fā)宿主對(duì)移植物的免疫耐受一直是臨床努力的方向。根據(jù)CD4+T細(xì)胞表面分子CD25表達(dá)的不同，可用流式細(xì)胞儀將其分選為功能不同的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和CD4+CD25-T細(xì)胞。二者均可被多克隆激活劑和自身抗原激活，但前者活化后可抑制免疫反應(yīng)和維持機(jī)體的耐受，后者則促進(jìn)免疫炎癥反應(yīng)。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是維持外周免疫耐受的主要細(xì)胞[1, 2]，尤其是CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，在誘發(fā)宿主對(duì)移植物的免疫耐受過程中發(fā)揮更為重要的作用[3]。趨化因子及其受體對(duì)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的游走與定植具有調(diào)節(jié)作用，其中比較重要的是趨化因子受體4(CCR4)和CCR6。2014年9月～2015年5月，我們采用非特異性多克隆激活劑刀豆蛋白A(ConA)激活CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和CD4+CD25-T細(xì)胞，觀察對(duì)其CCR4和CCR6表達(dá)的影響。將結(jié)果現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 試劑：免疫磁珠、雞尾酒抗體、FITC標(biāo)記鼠抗人CD4抗體、APC標(biāo)記鼠抗人CD25抗體、PE-Cy7標(biāo)記CCR4單抗、PE標(biāo)記CCR6單抗均購于美國(guó)BD公司，10% FBS購于美國(guó)HyClone公司，ConA購于深圳晶美生物工程有限公司，淋巴分離液購于天津生物化學(xué)制藥有限公司。儀器：CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購于美國(guó)Thermo公司，TDL-40B水平式離心機(jī)購于北京醫(yī)用離心機(jī)廠，流式細(xì)胞儀(FACS AriaTM) 購于美國(guó)BD公司，CK-31倒置顯微鏡購于日本Olympus公司。

1.2 外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)分離 無菌操作抽取1名健康志愿者的外周血100 mL，肝素抗凝。采用密度梯度離心法[3]分離外周血PBMC，方法如下：取肝素抗凝血與等量Hank′s液充分混勻，吸取2 mL淋巴細(xì)胞分離液，用滴管沿管壁緩慢疊加于分層液面上，注意保持清楚的界面。2 000 r/min離心20 min，離心后管內(nèi)分為三層，上層為血漿和Hank′s液，下層為紅細(xì)胞和粒細(xì)胞，中層為淋巴細(xì)胞分離液，在上、中層界面處有一白色云霧狀狹窄帶為PBMC層。用毛細(xì)吸管吸取后置于另一試管中，加入5倍以上體積的Hank′s液，1 500 r/min離心10 min，洗滌2次，獲得外周血PBMC。

1.3 CD4+T細(xì)胞富集 采用免疫磁珠陰性分選法。用PBS將PBMC密度調(diào)整成1×107個(gè)/mL，每1×106個(gè)細(xì)胞加入雞尾酒抗體5 μL，室溫放置15 min。PBS洗滌細(xì)胞，3 000 r/min離心7 min，棄上清液。每1×106個(gè)細(xì)胞加入5 μL免疫磁珠充分混勻,室溫放置30 min。用PBS將細(xì)胞密度調(diào)整為5×107個(gè)/mL，加入到12×75 mm圓底無菌試管中，每管不超過2 mL。將試管放置在磁力架上8 min，取上清液加入另一無菌試管中。磁力架上的試管加入同樣體積PBS，混勻后置于磁力架上8 min，取上清液加入到第一次收集上清液的無菌試管中，再重復(fù)一次上述操作。將收集三次上清液的試管置于磁力架上8 min，吸取上清液(其中富含CD4+T細(xì)胞)。

1.4 CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與CD4+CD25-T細(xì)胞分選及純度檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù)。每1×106個(gè)細(xì)胞加入5 μL FITC標(biāo)記抗人CD4，5 μL APC標(biāo)記抗人CD25,室溫孵育30 min，上流式細(xì)胞儀分選CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與CD4+CD25-T細(xì)胞，并檢測(cè)其純度。分選后的細(xì)胞經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色，死細(xì)胞可被染成藍(lán)色，活細(xì)胞不著色。計(jì)數(shù)200個(gè)淋巴細(xì)胞，以活細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比計(jì)算存活率。存活率>90%方可進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。

1.5 CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與CD4+CD25-T細(xì)胞CCR4和CCR6表達(dá)檢測(cè) 將ConA濃度配制為20 μg/mL。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與CD4+CD25-細(xì)胞用RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為2×106個(gè)/mL。將 ConA和CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、CD4+CD25-T細(xì)胞各100 μL加入3個(gè)復(fù)孔，置于5% CO2、37 ℃孵箱中。分別于培養(yǎng)0、24、48 h時(shí)收集細(xì)胞,每1×106個(gè)細(xì)胞加入20 μL PE-Cy7標(biāo)記的CCR4單抗及PE標(biāo)記的CCR6單抗，室溫孵育30 min，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CCR4和CCR6表達(dá)(以熒光強(qiáng)度表示)，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

2 結(jié)果

2.1 純度及存活率鑒定 流式細(xì)胞術(shù)分選CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的純度為97.8%，CD4+CD25-T細(xì)胞為90.1%，兩種細(xì)胞存活率均>90%。

2.2 CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和CD4+CD25-T細(xì)胞CCR4、CCR6表達(dá)比較 隨著ConA刺激時(shí)間延長(zhǎng)，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和CD4+CD25-T細(xì)胞CCR4表達(dá)均呈升高趨勢(shì)；刺激0、24、48 h CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞CCR4表達(dá)均高于CD4+CD25-T細(xì)胞(P均<0.01)。見表1。隨著ConA刺激時(shí)間延長(zhǎng)，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和CD4+CD25-T細(xì)胞CCR6表達(dá)均呈先升高后降低趨勢(shì)；刺激0、24、48 h CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞CCR6表達(dá)均高于CD4+CD25-T細(xì)胞(P均<0.01)。見表2。

表1 CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和CD4+CD25- T細(xì)胞 CCR4表達(dá)比較

注：與CD4+CD25-T細(xì)胞比較，*P<0.01。

表2 CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和CD4+CD25- T細(xì)胞 CCR6表達(dá)比較

注：與CD4+CD25-T細(xì)胞比較，*P<0.01。

3 討論

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞具有免疫低反應(yīng)性和免疫調(diào)節(jié)功能，在自身免疫性疾病、腫瘤的治療以及移植耐受誘導(dǎo)等方面具有廣闊的應(yīng)用前景[5，6]。目前認(rèn)為，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞為一種專職的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞群，能夠防止自身反應(yīng)性T細(xì)胞的活化，并抑制其效應(yīng)功能[7，8]。機(jī)體能通過調(diào)節(jié)性T細(xì)胞以“主動(dòng)”方式來獲得和維持自身免疫耐受。T細(xì)胞表面穩(wěn)定表達(dá)CD25被認(rèn)為是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的顯著特征，細(xì)胞調(diào)節(jié)功能則集中體現(xiàn)在高表達(dá)CD25的CD4+T細(xì)胞上[9，10]。

CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可被多克隆激活劑和自身抗原激活，活化后的細(xì)胞能減少自身反應(yīng)性T細(xì)胞的活化，并抑制其效應(yīng)功能。經(jīng)T細(xì)胞抗原受體(TCR)激活后，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)多克隆激活劑激活的CD4+和CD8+T細(xì)胞均有明顯的增殖抑制作用[11]。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)反應(yīng)性T細(xì)胞的抑制具有抗原特異性，即調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可因特異性抗原刺激而活化，其抑制效應(yīng)只針對(duì)因同一特異性抗原刺激而活化的效應(yīng)性T細(xì)胞。由于調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)效應(yīng)性T細(xì)胞的特異性和高效抑制性，其在移植免疫耐受誘導(dǎo)中的作用越來越受到重視。

T淋巴細(xì)胞CCR的表達(dá)取決于其活化或分化狀態(tài)、組織定位等[12，13]。人外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可選擇性表達(dá)CCR4，成熟的樹突狀細(xì)胞可通過分泌CCR4的趨化因子配體17(CCL17)及CCL22引導(dǎo)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的游走。CCR6可表達(dá)于未成熟樹突狀細(xì)胞、B細(xì)胞及記憶性T細(xì)胞，與同種異體反應(yīng)性CD4+T細(xì)胞引起的急性移植物抗宿主反應(yīng)有關(guān)[14]。CCR6只表達(dá)于抗原遭遇T細(xì)胞上，效應(yīng)-記憶性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞上可有CCR6表達(dá)，CCR6陽性表達(dá)的效應(yīng)-記憶性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可對(duì)抗原特異反應(yīng)性T細(xì)胞直接發(fā)揮免疫抑制作用[15]。本研究中流式細(xì)胞術(shù)分選調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的純度為97.8%，CD4+CD25-T細(xì)胞為90.1%，說明分選出的細(xì)胞純度較高。本研究結(jié)果顯示，隨著ConA刺激時(shí)間延長(zhǎng)，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和CD4+CD25-T細(xì)胞CCR4表達(dá)均呈升高趨勢(shì)，CCR6表達(dá)均呈先升高后降低趨勢(shì)；ConA刺激0、24、48 h CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞CCR4、CCR6表達(dá)均明顯高于CD4+CD25-T細(xì)胞。說明CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞CCR4、CCR6表達(dá)均與細(xì)胞活化狀態(tài)有關(guān)，可能在調(diào)節(jié)性T細(xì)胞游走和定植局部誘導(dǎo)免疫耐受過程中發(fā)揮作用，而CCR4表達(dá)升高可能與其關(guān)系更為密切。本研究有助于利用CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的活化誘導(dǎo)免疫耐受，可能為有效降低移植免疫排斥反應(yīng)提供依據(jù)。

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貴州省優(yōu)秀科技人才省長(zhǎng)專項(xiàng)基金資助項(xiàng)目[資黔省專字(2005)144號(hào)]。

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.32.012

R557.3

A

1002-266X(2016)32-0038-03

2015-12-21)