秦曉威 吳剛 李付鵬 賴劍雄 陳鵬 郝朝運 宋應輝

摘 要 以86份可可核心種質資源為試材，利用計算機圖像信息及其處理技術對可可果實色澤數(shù)字圖像進行解析，采集果實色澤典型色域的CMYK模式參數(shù)，通過聚類分析及主成分分析方法對色澤指標參數(shù)進行統(tǒng)計分析。結果表明：C、M、Y、K值能較準確科學地表現(xiàn)可可果實色澤，可以反映種質間的差異。UPGMA聚類分析和主成分分析將可可果實色澤分為2大類9組，區(qū)分結果符合可可果實色澤的自然分類屬性。其中綠色為果實的基礎色，紅色為漸變的渲染色，形成豐富的9組色澤：墨綠色、青綠色、灰綠色、淺綠色、青白色、棗紅色、紅綠色、紫紅色和深紫色?？梢?，可可果實色澤能夠作為一項重要的分類參考指標，為可可新品種選育和優(yōu)異種質資源開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

關鍵詞 可可；果實色澤；數(shù)字化描述；多樣性

中圖分類號 S685.99 文獻標識碼 A

The Diversity Analysis of Cocoa Pod Color of

Theobroma cacao L. Accessions

QIN Xiaowei1，2， WU Gang1， LI Fupeng1， LAI Jianxiong1，

CHEN Peng1， HAO Chaoyun1，2， SONG Yinghui1，2 *

1 Spice and Beverage Research Institute， CATAS， Wanning， Hainan 571533， China

2 Key Laboratory of Genetic Resources Utilization of Spice and Beverage Crops，

Ministry of Agriculture， Wanning， Hainan 571533， China

Abstract The colors of the pod collected from 86 cocoa accessions were digitally described and determined by using the computer information technology combined with digital images to extract the parameters of CMYK pattern in the typical color region. The UPGMA clustering analysis and PCA analysis were carried out based on the data. The results showed that the value of C， M， Y， and K could more accurately and scientifically represent the colors of pod and reflect differences among accessions of cocoa. The 86 cocoa accessions could be divided into two types， and nine groups on the basis of pod color parameters. The clustering analysis results were basically consistent with the natural classification. Additionally， cocoa pod color is determined by the degree of red pigment that is superimposed over the base green color of the pod during development. Thus， it formed nine groups， black green， dark green， gray green， light-green， bluish white， purplish red， red-green， purple red， and deep-purple. The results showed that pod color parameters in cocoas might be a suitable index to assess the classification of the different cocoa accessions. The investigation could provide a reference for future breeding new varieties and the utilization of the germplasm resources.

Key words Theobroma cacao L.； Cocoa pod color； Digital description； Diversity

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.02.007

可可（Theobroma cacao L.， 2n=20），又稱巧克力樹，為梧桐科（Sterculiaceae）可可屬（Theobroma）多年生熱帶經(jīng)濟作物。據(jù)Henderson等[1]考古證實，可可約有3 000多年的食用歷史。截至2013年，世界可可收獲面積達1.01×107 hm2，產量約4.6×106 t，其中，主產國科特迪瓦占總產量的29.4%，其次為印度尼西亞（19.1%）、加納（14.9%）、尼日利亞（10.1%）、喀麥?。?.2%）和巴西（5.5%）[2]。中國可可引種歷史相對較短，1922年首次由印度尼西亞和爪哇地區(qū)引入臺灣嘉義、高雄等地試種[3]，20世紀50年代又先后從越南、泰國、馬來西亞、巴布新幾內亞等國家引進可可種質，在海南萬寧等地試種成功。目前，主要栽培于海南和臺灣地區(qū)，云南、廣東、福建等地也有零星分布[4-5]。作為一種深受人們喜愛的飲料食品以及具有重要用途的熱帶農產品，可可長期以來存在需求旺盛與供應不足的問題，我國每年僅原料豆就需進口約1.5×105 t，且年進口增長率約為10%～15%[6]。隨著生活水平不斷提高和飲食結構變化，我國對可可的需求量還將大幅增加。

可可果實的鮮艷色澤常吸引松鼠、猴子等動物取食以完成種子散布與后代繁衍[7-8]，這也是研究其起源、進化與遺傳分類的重要性狀之一。最早從事可可種質資源形態(tài)學分類的學者van Hall[9]認為，可可分為中美洲的Theobroma cacao ssp. cacao和南美洲的Theobroma cacao ssp. sphaeorocarpum亞種，分別包含Criollo和Forastero兩大遺傳類群。其中Forastero遺傳類群根據(jù)果實色澤分為Cundeamor verugosa amarillo（amarillo，西班牙語為“綠色”）、Cundeamor verugosa colorado（colorado，西班牙語為“紅色”）、Liso amarillo、Liso colorado、Amelonado amarillo、Amelonado colorado、Calabacillo amarillo和Calabacillo colorado等8個類別。之后，研究者觀察到不同可可種質果實色澤的變異度較為豐富，基本存在由淺綠色至深綠色、由紅色至深紫色的變異規(guī)律，而中間狀態(tài)的色澤特征被描述為“在綠色的底層上渲染了紅色”[10-12]。Bartley[13]認為花青素的累積差異是形成可可果實色澤變異的主要原因。此外，可可果實色澤屬于寡基因性狀（oligogenic trait），但由于顯性效應的存在而不能簡單地依據(jù)雙親果實色澤性狀來預測雜交后代的色澤發(fā)生情況[14]。而且可可為常異花授粉作物，種質間花粉的蟲媒、風媒傳播更容易獲得色澤性狀變異豐富的雜交后代，這為形成豐富的可可果實色澤提供了遺傳基礎。

近年來，果實色澤的遺傳分類與形成機理逐漸成為農作物種質資源學研究的熱點話題之一[15-17]。然而，關于可可果實色澤的研究基礎相對較為薄弱，自Engels[18]首次制定出可可種質資源描述規(guī)范以來，可可果實色澤的描述基本以目測并通過衡量花青素含量的強弱等級（0=沒有，3=少許，5=中等，7=較多）進行鑒定?？紤]到果實發(fā)育過程中色澤變化帶來的對果實色澤描述的差異，國際熱帶農業(yè)研究與高等教育中心（CATIE）規(guī)定了可可色澤描述時應盡量選擇2個月大小的未成熟可可果實[19]。近年來，數(shù)字化技術在準確獲取色彩信息及其在色澤豐富的遺傳多樣性分析中的成功應用[20-21]，為可可果實的色澤描述提供了一條科學便捷規(guī)范的技術路線。為了能夠進一步了解可可果實的色澤變化特點，本研究利用數(shù)碼圖像和計算機信息技術對可可種質資源果實色澤信息進行采集，通過提取典型色域的CMYK模式參數(shù)，應用聚類和主成分分析，從果實色澤變化的角度去揭示可可種質資源的多樣性，為今后可可種質資源分類、新品種選育及資源保護與利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料采集

于2013年10～11月，以中國熱帶農業(yè)科學院香料飲料研究所熱帶香料飲料作物種質資源圃保存的86份可可核心種質資源為采集對象。土壤為黃色磚紅壤，有良好的水肥一體化灌溉條件，管理水平中等，蔭蔽度60%～80%，每份種質種植5株，栽培措施中未使用植物生長調節(jié)劑。

為保證所測顏色具有代表性，參考Phillips等[19]對可可果實色澤描述的要求，取可可樹干高100～150 cm處的2個月未成熟果實。采摘時選擇顏色較為均勻、無可可盲蝽叮咬且具有代表性的可可果實。每份資源隨機選取3株，每株采摘果實數(shù)量為3個，避免表皮磨損，采后立即帶回實驗室，2～3 h完成拍照。選擇天氣連續(xù)晴朗時期，在3個工作日內完成對86份可可種質資源果實色澤的圖像信息采集。

1.2 圖像拍攝

在相同光源下用同一相機拍攝。相機機身為Canon EOS5D，鏡頭為Canon 100 mm F2.8微距鏡頭。機身設置：光圈優(yōu)先，鏡頭光圈F8，白平衡設置為日光模式，人工光源為71 cm專業(yè)翻拍臺套裝，包括71 cm翻拍臺，燈罩4只（帶方向燈頭，可上下左右調節(jié)方向），45 W 5 500 K三基色專業(yè)攝影燈泡4只，20～60 cm可調節(jié)燈架4只。背景選用黑色臺布，將果實置于背景臺布中央拍照。

1.3 色彩模式選擇及數(shù)據(jù)采集方法

依據(jù)不同的使用范圍，彩色圖像的色彩模式主要有RGB、Lab和CMYK模式。其中，RGB是由光源產生顏色，由R（紅色）、G（綠色）和B（藍色）3種基色光混合疊加而成，主要用于電視機、顯示屏、幻燈片、網(wǎng)絡、多媒體等利用色光顯色顏色的彩色模式，但R、G和B值大小變化復雜，難以根據(jù)其辨別出具體顏色[20]。Lab色彩模式是由亮度L、紅綠色彩要素a和黃藍色彩要素b組成，能定義的色彩最多，但a、b是指顏色比值，人們無法感官認識，不能準確地用數(shù)字表現(xiàn)出來一種顏色的含量[21]。此外，Lab模式的測定方法須有特定儀器。與上述兩種模式不同，CMYK模式根據(jù)紙上油墨的吸收特性來定義顏色，是一種減色色彩模式，即當陽光照射到一個物體上時，這個物體將吸收一部分光線，并將剩下的光線進行反射，反射的光線就是人們所看見的物體顏色。C（青色）、M（洋紅色）、Y（黃色）和K（黑色）可以準確地用數(shù)字來描述一種顏色的多少，每一個像素的每一種印刷油墨會被分配一個百分比值，更有利于材料色彩的再現(xiàn)。因此，根據(jù)RGB、Lab和CMYK模式的使用范圍，本研究選用CMYK色彩模式進行可可果實顏色的測定。

在Adobe Photoshop CS軟件中打開CMYK色彩模式，將照片添加到選區(qū)，選擇“視圖”-“顯示”-“網(wǎng)格”添加網(wǎng)格線。將果實長軸方向水平放置，如有偏離，選擇“圖像”-“旋轉畫布”調整任意角度使其與水平方向平行。選用矩形選取工具沿果實頂端至基部水平方向的中部，用裁剪工具進行切割，切割面積占總面積的1/3。利用黃金分割0.618原理（從果實頂端算起），通過標尺計算切割果實的水平長度乘以0.618，得出待測色區(qū)域。利用吸取工具于待測色區(qū)域的每一網(wǎng)格中心測C、M、Y、K的百分比值，所求數(shù)值的平均值即表示果實的顏色。

1.4 聚類與主成分分析

根據(jù)采集的C、M、Y、K指標參數(shù)，構建原始數(shù)據(jù)矩陣，采用SPSS 17.0軟件對可可果實色澤參數(shù)分別進行系統(tǒng)聚類分析和主成分分析，依據(jù)聚類樹狀圖和主成分散點圖，對不同種質進行歸類分級，評價果實色澤遺傳特性。

2 結果與分析

2.1 不同可可種質果實色澤差異

由表1可知，86份可可種質果實色澤的C、K、M、Y值均表現(xiàn)出極顯著的差異，其中C值值域為16.75～72.80（F85，1634=180.37，Pr<0.000 1），K值值域為0.00～66.20（F85，1634=70.08，Pr<0.000 1），M值值域為2.05～98.70（F85，1634=340.80，Pr<0.000 1），Y值值域為56.00～98.75（F85，1634=22.75，Pr<0.000 1），說明可可果實色澤的多樣性極為豐富。由圖1可見，C、K、M、Y值頻率分布變化規(guī)律明顯不同。C、M值呈雙峰型變化趨勢（圖1-A，1-C），Y值呈單峰型變化趨勢（圖1-D），而K值呈遞減變化趨勢（圖1-B）。

2.2 不同可可種質果實色澤聚類分析

以C、M、Y、K為果實色澤參數(shù)變量，計算各個種質間的Euclidean遺傳距離，采用UPGMA聚類法對86份供試材料進行聚類分析（圖2），從樹狀圖可以看出，在遺傳距離67.25處86個供試材料可分2大類，第1類為包含YLDDZ8、STSZ11等53份種質的綠色類，第2類為包含STS9-2、ZYP7-9等33份種質的紅色類，區(qū)分結果符合可可果實色澤的自然分類屬性。在遺傳距離26.90處劃分為9大組，第1組為墨綠色，包含YLDDZ8、ZYP2-8、ZYP6-5等27份種質；第2組為青綠色，包含YLDDZ5、STSZ1、BGL14等8份種質；第3組為灰綠色，包含STSS4、STSS14、ZYP1-2等9份種質；第4組為淺綠色，包含BGL8、ZYP5-7、ZYP1-18等8份種質；第5組為青白色，只有STSZ11種質，極為少見，屬于特殊類；第6組為棗紅色，包含YLDDZ14、ZYP4-9、STS9-2等9份種質；第7組為紅綠色，該類紅色的果實色澤中夾雜著少許的綠色，屬于綠色和紅色類別間的過渡類型；第8組為紫紅色，包含ZYP4-7、ZYP8-9、STSZ10等15份種質；第9組為深紫色，包含ZYP2-4、ZYP6-6、ZYP7-9等3份種質。

2.3 不同可可種質果實色澤主成分分析

對原始矩陣進行主成分分析，前兩個主成分分別能夠解釋果實色澤遺傳差異的57.75%和28.64%，占總變異的86.39%。位置靠近者關系密切，遠離者表示關系疏遠，根據(jù)主成分二維散點圖（圖3），將位置靠近的種質劃歸在一起，可將供試材料劃分成2大類9個組。綠色類包含墨綠色、青綠色、灰綠色、淺綠色和青白色，而紅色類包含棗紅色、紅綠色、紫紅色和深紫色。與聚類分析結果基本一致。

3 討論與結論

果實色澤描述是可可植物學分類、新品種培育與種質資源創(chuàng)新利用的重要性狀，同時也是困擾農藝工作者的難題。為解決可可果實色澤性狀分類鑒定不清的問題，本研究利用數(shù)字化描述方法對86份可可核心種質的果實色澤進行分析，該方法可以通過獲取具體、準確的色澤數(shù)據(jù)信息來比較色澤差異。結果顯示，可可果實色澤具有豐富的遺傳多樣性，C（青色）、M（洋紅色）和Y（黃色）參數(shù)是決定可可果實色澤的主要因子。比較C、M、Y、K頻率分布規(guī)律可知，大部分可可果實色澤的Y較大，其次為C、M值，K值相對較小。當C值越大、M值越小的條件下，隨著Y值的減小可可果實色澤由深綠色變淺綠色；當C值越小、M值越大的條件下，隨著Y值的增加可可果實色澤由紫紅色變深紅色。由此可見，可可種質果實色澤可籠統(tǒng)地描述為綠色和紅色，這與Wood和Lass[10]及Hui[11]等研究的泛性描述結論是一致的。因此，可可果實色澤數(shù)字化信息的應用，不僅能夠全面反映不同可可種質果實色澤的差異，而且便于圖像信息的存儲與輸出，體現(xiàn)了這種色彩界定方法高度的一致性、可移植性和可還原性，為可可果實的色澤描述確定了一條科學便捷規(guī)范的技術路線。

關于可可果實色澤的描述及其豐富性尚無統(tǒng)一的認識。通常研究者多利用花青素含量的強弱等級進行劃分[18]，該方法并不能描述出可可果實的具體色澤，而且其判斷多以成熟可可果實的花青素為基礎。然而，Phillips等[19]認為可可果實成熟過程對色澤描述的干擾較大，主觀性太強，并建議選擇2個月大小的未成熟果實進行可可色澤描述。此外，可可新品種DUS測試指南中，將可可果實色澤粗略地描述為：黃綠色、黃色、橘黃色、中紅色、深紅色和紫色[22]。其中，黃綠色、黃色和橘黃色是果實成熟后的色澤，為可可泛性屬性，極易受葉綠素降解程度的干擾，而對于可可果實基本色澤的描述不具有代表性。本研究結果表明，可可果實基本色澤可分綠色和紅色2大類9組，區(qū)分結果符合可可果實色澤的自然分類屬性[11-12]。其中綠色是果實的基礎色，紅色是漸變的渲染色，形成了豐富的9組色澤，即墨綠色、青綠色、灰綠色、淺綠色、青白色、棗紅色、紅綠色、紫紅色和深紫色。其中，墨綠色和灰綠色為可可果實色澤的典型類別，但在可可新品種DUS測試指南、可可種質資源描述規(guī)范中均未有記錄。此外，研究還鑒定出STSZ11種質為青白色，具有較低的C值、M值和K值，分別僅為26%、2%和0，果實色澤特異。

果實色澤的準確采集和評價，可為可可品種鑒別和創(chuàng)新利用提供新的參考指標。厄瓜多爾主栽的Nacional品種具有特殊的花香味等優(yōu)點，約占國際優(yōu)質可可供應總量的75%，價格比普通可可豆高40%左右，但是Nacioanl品種產量低，約897 kg/hm2，市場供需矛盾極為突出。CCN51品種具有產量高、抗病性強等優(yōu)點，產量高達1 641 kg/hm2，但是其酸味、澀味過高且不具有特殊的香氣風味，品質不佳[23]。一直以來，育種家致力于以Nacional和CCN51為親本選育優(yōu)質、高產的雜交后代，但雜交后代的早期鑒別是面臨的難題，大大降低了育種效率。Nacional品種果實顏色為綠色，而CCN51品種果實顏色為紅色，近年來，有研究者正在利用兩者的色澤差異，通過篩選與綠色和紅色性狀相關的候選基因，開發(fā)對色澤性狀具有顯著效應的功能基因或SNP分子標記，實現(xiàn)雜交后代的早期快速鑒定[14]。此外，可可為典型的“熱帶莖生植物”，豐富的可可果實色澤為園林景觀設計提供了素材來源，具有潛在的旅游開發(fā)利用價值。因此，對可可果實色澤的分類鑒定不僅為育種家和園林景觀設計者提供所需的材料資源，而且有利于可可資源的開發(fā)利用與保護。

參考文獻

[1] Hendderson J S， Joyce R A， Hall G R， et al. Chemical and archaeological evidence for the earliest cacao beverages[J]. PNAS， 2007， 104： 18 937-18 940.

[2] FAO Statistics[EB/OL]. http：//faostat3.fao.org/search/cocoa/E， 2015-01-01.

[3] 朱自慧. 世界可可業(yè)概況與發(fā)展海南可可業(yè)的建議[J]. 熱帶農業(yè)科學， 2003（3）： 28-33.

[4] 鄒冬梅. 海南省可可生產的現(xiàn)狀、 問題與建議[J]. 廣西熱帶農業(yè)， 2003（1）： 38-42.

[5] 秦曉威， 郝朝運， 吳 剛， 等. 可可種質資源多樣性與創(chuàng)新利用研究進展[J]. 熱帶作物學報， 2014， 35（1）： 188-194.

[6] 王全永， 金健英. 我國與東盟可可制品標準的對比分析研究[J]. 東盟自由貿易區(qū)標準化建設專欄， 2010（10）： 30-33.

[7] Young A M. The chocolate tree： a natural history of cacao[M]. Smithsonian Institute Press， Washington and London， 1994： 1-5.

[8] Julliot C. Frugivory and seed dispersal by red howler monkeys： evolutionary aspect[J]. Research Ecology（Terre Vie）， 1994， 49： 331-341.

[9] van Hall D R C J J. Cocoa[M]. London： Macmillan and Co.， Limited St. Martins Street， 1914： 67.

[10] Wood G A R， Lass R A. Cocoa[M]. Iowa State University Press， a Blackwell Science Company， USA， 2001： 26-36.

[11] Hui Y H. Handbook of food science， technology， and engineering[M]. CRC Press， New York， 2006： 104.

[12] Amoah A A. Determination of postharvest losses in cocoa（Theobroma cacao）from harvest to the depot[D]. Kwame Nkrumah University of Science and Technology， Kumasi， 2013： 2.

[13] Bartley B G D. The genetic diversity of cacao and its utilization[M]. UK， Wallingford： CABI Publishing， 2005： 50-55.

[14] Motamayor J C， Mockaitis K， Schmutz J， et al. The genome sequence of the most widely cultivated cacao type and its use to identify candidate genes regulating pod color[J]. Genome Biology， 2013， 14： 53.

[15] 王偉杰， 徐建國， 徐昌杰. 宮內伊予柑果實發(fā)育期間色澤和色素的變化[J]. 園藝學報，2006， 33： 461-465.

[16] 劉 金. 早熟蘋果泰山早霞果實著色機理的初步研究[D]. 泰安： 山東農業(yè)大學， 2012.

[17] 馬春暉， 李鼎立， 王 然. 梨屬植物葉片色澤多樣性分析[J]. 植物遺傳資源學報， 2014， 15： 1 232-1 238.

[18] Engels J M M， Bartley B G D， Enríquez G A. Cacao descriptors， their states and modus operandi[J]. Turrialba， 1980， 30： 209-218.

[19] Phillips W， Arciniegas A， Mata A， et al. Catalogue of cacao clones selected by CATIE for commercial plantings[M]. Shirley Orozco Estrada PCC Communicator CATIE， Costa Rica， 2013： 23.

[20] 朱 敏， 高愛平， 羅石榮， 等. 芒果花瓣與花藥色彩的數(shù)字化描述[J]. 植物遺傳資源學報，2013， 14： 159-166.

[21] 李 欣， 沈 向， 張鮮鮮， 等. 觀賞海棠葉、果、花色彩的數(shù)字化描述[J]. 園藝學報，2010， 37： 1 811-1 817.

[22] UPOV. Guidelines for the conduct of tests for distinctness， uniformity and stability of cacao（Theobroma cacao L.）[EB/OL]. http：//www.upov.int/edocs/tgdocs/en/tg270.pdf， 2011-10-20.

[23] Blare T， Useche P. Competing objectives of smallholder producers in developing countries： examining cacao production in Northern Ecuador[J]. Environmental Economics， 2013（1）： 72-80.