馮　俊，陳華文

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院，湖北 武漢 430030)

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丹參酮ⅡA通過(guò)調(diào)節(jié)miR-133水平對(duì)慢性心力衰竭心肌重構(gòu)的影響

馮俊，陳華文

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院，湖北 武漢 430030)

[摘要]目的探討丹參酮ⅡA是否能通過(guò)調(diào)控miR-133水平影響慢性心力衰竭大鼠心肌重構(gòu)。方法將SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、手術(shù)組、丹參酮ⅡA組、 miR-133抑制劑組，每組10只。除假手術(shù)組外，其余組大鼠均行腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)建立心力衰竭模型。各組均正常喂養(yǎng)4周后，丹參酮ⅡA組和miR-133抑制劑組均給予丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液灌胃，miR-133抑制劑組同時(shí)皮下植入滲透泵持續(xù)泵入miR-133拮抗劑antagomirs，假手術(shù)組、手術(shù)組給予等容積生理鹽水灌胃，均連續(xù)12周。末次灌胃后24 h檢測(cè)各組大鼠心功能，取心臟計(jì)算心臟指數(shù)及左心室質(zhì)量指數(shù)，HE染色觀察大鼠心肌形態(tài)學(xué)變化，Masson染色觀察大鼠心室肌膠原變化。結(jié)果與假手術(shù)組比較，手術(shù)組心功能惡化(P<0.05)，心臟指數(shù)及左心室質(zhì)量指數(shù)、心肌細(xì)胞直徑和膠原含量增加(P均<0.05)；丹參酮ⅡA組和miR-133 抑制劑處理組上述各指標(biāo)均較手術(shù)組明顯改善(P均<0.05)，但丹參酮ⅡA組上述各指標(biāo)改善情況均明顯優(yōu)于miR-133抑制劑處理組(P均<0.05)。結(jié)論miR-133在丹參酮ⅡA抗心力衰竭大鼠左心室重構(gòu)中發(fā)揮著重要作用，丹參酮ⅡA可能通過(guò)上調(diào)miR-133水平發(fā)揮抗心力衰竭心肌重構(gòu)的作用。

[關(guān)鍵詞]丹參酮ⅡA；miR-133；心力衰竭；心肌重構(gòu)

心力衰竭是各種心臟疾病的嚴(yán)重階段，而心室肌重構(gòu)是心力衰竭的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，隨著心室肌組織重構(gòu)的發(fā)生及發(fā)展，可導(dǎo)致心肌組織缺氧缺血狀態(tài)的逐漸加重，從而引起心室順應(yīng)性的下降，最終導(dǎo)致心肌缺血、心律失常和猝死[1]。因此防治和逆轉(zhuǎn)心肌重構(gòu)是治療心力衰竭的重點(diǎn)。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，我國(guó)傳統(tǒng)中藥丹參的主要成分丹參酮ⅡA具有抗缺氧缺血、改善微循環(huán)、抑制血小板黏附聚集等保護(hù)心血管作用，因此廣泛應(yīng)用于臨床[2-4]；筆者的前期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA可以升高心力衰竭大鼠下降的miR-133 mRNA水平[5]。本實(shí)驗(yàn)研究在前期研究的基礎(chǔ)上觀察了丹參酮ⅡA能否通過(guò)調(diào)控miR-133水平影響心力衰竭大鼠整體心肌結(jié)構(gòu)重構(gòu)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1實(shí)驗(yàn)資料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康成年雄性SD大鼠40只，月齡2個(gè)月，體質(zhì)量250～300 g，同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK鄂2009-0003。

1.2藥物及試劑丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液(上海第一生化藥業(yè)有限公司產(chǎn)品),miR-133拮抗劑antagomirs[寶生物(大連)有限公司]，其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純，武漢康盛醫(yī)藥科技有限公司產(chǎn)品。

1.3實(shí)驗(yàn)方法將SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、手術(shù)組、丹參酮ⅡA組、miR-133抑制劑組，每組10只，4組大鼠均于同一環(huán)境下飼養(yǎng)。除假手術(shù)組外，其余組大鼠均采用腹主動(dòng)脈縮窄法(AAC)構(gòu)建慢性心力衰竭大鼠模型:10%水合氯醛(0.3 mL/kg)腹腔麻醉，仰位固定，腹部常規(guī)備毛、消毒，于腹中線開(kāi)腹處理，暴露分離腹主動(dòng)脈，8號(hào)針頭平行置于腹主動(dòng)脈旁后采用手術(shù)縫線(4/0)將兩者結(jié)扎，隨后抽出針頭關(guān)閉腹腔。術(shù)后腹腔注射青霉素抗感染。假手術(shù)組只分離腹主動(dòng)脈，不結(jié)扎。各組均正常喂養(yǎng)4周。從第5周開(kāi)始，丹參酮ⅡA組和miR-133抑制劑處理組均給予丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液1 mL/(kg·d)灌胃，miR-133拮抗劑組同時(shí)皮下植入滲透泵持續(xù)泵入miR-133拮抗劑antagomirs(0.6 μmol/L)，假手術(shù)組、手術(shù)組給予等容積生理鹽水灌胃，均連續(xù)12周。

1.4觀察指標(biāo)

1.4.1心功能末次灌胃后24 h,10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠， 仰臥固定四肢，胸前區(qū)剃毛，使用GEViVid 7彩色超聲顯像儀檢測(cè)心功能指標(biāo)舒張末期左室后壁厚度(LVPWTd)、收縮末期左室后壁厚度(LVPWTs)、舒張末期室間隔厚度(IVSTd)、收縮末期室間隔厚度(IVSTs)、舒張末期左室內(nèi)徑(LVEDD)、收縮末期左室內(nèi)徑(LVESD)、左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、左室短軸縮短率(FS)。

1.4.2心臟指數(shù)(HWI)及左心室質(zhì)量指數(shù)(LVMI)各組大鼠靜脈注射過(guò)量的氯化鉀(可使心臟止于收縮期)后迅速取出心臟稱質(zhì)量，并分離大血管、心房及右心室，用預(yù)冷的PBS液充分沖洗，濾紙吸干，稱量左心室(包括室間隔)的濕質(zhì)量，以心臟(mg)與體質(zhì)量(g)之比作為HWI，左室質(zhì)量(mg)與體質(zhì)量(g)之比作為L(zhǎng)VMI。

1.4.3心肌形態(tài)學(xué)變化情況將大鼠心臟用4%甲醛固定，梯度乙醇脫水后，取心尖部組織進(jìn)行石蠟包埋和切片(5 μm)，行HE染色，觀察心肌組織結(jié)構(gòu)形態(tài)學(xué)變化。

1.4.4心室肌膠原變化情況將左心室中部冠狀切面的心肌組織用4%多聚甲醛固定后制備成石蠟包埋切片(5 μm)，脫蠟至水，按照Masson試劑盒指示方法進(jìn)行染色，膠原纖維呈藍(lán)色，心肌纖維呈紅色，胞核呈黑藍(lán)色。觀察心肌膠原纖維含量變化。

2結(jié)果

2.1各組超聲心動(dòng)圖指標(biāo)比較手術(shù)組LVPWTd、LVPWTs、IVSTs、IVSTd 、LVEDD、LVESD均顯著高于假手術(shù)組(P均<0.05)，LVEF、FS均顯著低于假手術(shù)組(P均<0.05)；丹參酮ⅡA組和miR-133抑制劑組LVPWTd、LVPWTs、IVSTs、IVSTd 、LVEDD、LVESD均顯著低于手術(shù)組(P均<0.05)，LVEF、FS均顯著高于手術(shù)組(P均<0.05)；但miR-133抑制劑組LVPWTd、LVPWTs、IVSTs、IVSTd、LVEDD、LVESD均顯著高于丹參酮ⅡA組(P均<0.05)，LVEF、FS均顯著低于丹參酮ⅡA組(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

表1　各組大鼠超聲心動(dòng)圖檢測(cè)結(jié)果比較±s)

注：①與假手術(shù)組比較，P<0.05；②與手術(shù)組比較，P<0.05；③與丹參酮ⅡA組比較，P<0.05。

2.2各組HWI和LVWI比較手術(shù)組HWI和LVMI均顯著高于假手術(shù)組(P均<0.05)。丹參酮ⅡA組和miR-133抑制劑處理組HWI和LVMI均明顯低于手術(shù)組(P均<0.05)，而miR-133抑制劑處理組HWI和LVMI均明顯高于丹參酮ⅡA組(P均<0.05)。見(jiàn)表2。

2.3各組心肌形態(tài)學(xué)HE染色表現(xiàn)假手術(shù)組鏡下見(jiàn)心肌纖維排列正常，無(wú)血管擴(kuò)張及血管壁增厚等表現(xiàn)；手術(shù)組心肌細(xì)胞直徑增大，細(xì)胞排列不整齊，著色不勻，肌纖維束較寬大，肌纖維間疏松水腫，間隙增寬，部分肌束間纖維結(jié)締組織增生，血管周圍膠原纖維增生更為明顯，間質(zhì)中還可見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等改變；丹參酮ⅡA組心肌肥大、細(xì)胞核增大、心肌膠原纖維增生程度較手術(shù)組明顯改善，而miR-133抑制劑組上述病理改變較丹參酮ⅡA組明顯。見(jiàn)圖1～4。

2.4各組心肌膠原Masson染色表現(xiàn)正常心肌細(xì)胞呈紅色，膠原呈綠色。假手術(shù)組心肌間隙可見(jiàn)少量膠原纖維，排列整齊；手術(shù)組大鼠心肌間隙見(jiàn)大量膠原堆積，并有微瘢痕形成，心肌纖維排列紊亂，間質(zhì)膠原纖維增生，以血管周圍為明顯，非血管區(qū)膠原纖維增生程度比血管周圍輕；丹參酮ⅡA組可見(jiàn)不同程度膠原沉積于細(xì)胞間質(zhì)，膠原纖維排列紊亂，間質(zhì)纖維增生，以血管周圍為明顯，但總體膠原纖維增生程度較手術(shù)組明顯減輕；miR-133 抑制劑處理組膠原纖維增生程度較丹參酮ⅡA組明顯。見(jiàn)圖5～8。

表2　各組大鼠HWI和LVWI比較

注：①與假手術(shù)組比較，P<0.05；②與手術(shù)組比較，P<0.05；③與丹參酮ⅡA組比較，P<0.05。

圖1　假手術(shù)組大鼠心肌HE染色表現(xiàn)

圖2　手術(shù)組大鼠心肌HE染色表現(xiàn)

圖3　丹參酮ⅡA組大鼠心肌HE染色表現(xiàn)

圖4　miR-133抑制劑組大鼠心肌HE染色表現(xiàn)

3討論

圖5　假手術(shù)組大鼠心肌膠原Masson染色表現(xiàn)

圖6　手術(shù)組大鼠心肌心肌膠原Masson染色表現(xiàn)

圖7　參酮ⅡA組大鼠心肌心肌膠原Masson染色表現(xiàn)

圖8　miR-133抑制劑組大鼠心肌心肌膠原Masson染色表現(xiàn)

近年來(lái)，心血管疾病越來(lái)越成為危害人類健康的殺手之一，尤其是心肌梗死和心力衰竭。研究表明，左心室重構(gòu)是心力衰竭發(fā)生、發(fā)展的基本機(jī)制，是心功能由代償期向失代償期轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵[6]。預(yù)防和抑制心室重構(gòu)的發(fā)生和發(fā)展是目前治療心力衰竭的重點(diǎn)方向，找到一個(gè)有效物質(zhì)來(lái)阻止和減緩心力衰竭的發(fā)生就變得尤其重要，也是改善預(yù)后的主要措施。

丹參酮ⅡA是中藥丹參根的乙醚提取物中的脂溶性有效成分，其具有防止過(guò)氧化氫對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞造成損傷的作用[7]，而且具有改善心肌缺血、抗急性缺氧、抗心肌肥厚、逆轉(zhuǎn)左心室重構(gòu)的作用，可以降低惡性心律失常的發(fā)生率[8]。目前研究已證明丹參酮ⅡA能治療各種原因?qū)е碌穆孕牧λソ?，能明顯改善心功能[9-10]。

本實(shí)驗(yàn)用AAC法建立慢性心力衰竭大鼠模型，發(fā)現(xiàn)手術(shù)組術(shù)后心肌細(xì)胞肥大，細(xì)胞核增大深染，心肌纖維增生伴炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；Masson染色顯示大量心肌膠原沉積，間質(zhì)膠原纖維增生。給予丹參酮ⅡA處理后，大鼠心功能、心肌形態(tài)學(xué)以及心肌膠原含量明顯改善，提示丹參酮ⅡA可抑制和逆緩左心室重構(gòu)。此外，本研究為證明丹參酮ⅡA是否通過(guò)調(diào)控miR-133來(lái)抑制心力衰竭大鼠左心室重構(gòu)，設(shè)立了miR-133抑制劑組，即在給予AAC大鼠丹參酮ⅡA處理的同時(shí)皮下植入滲透泵連續(xù)泵入antagomirs。antagomirs是與膽固醇分子耦聯(lián)的寡聚核苷酸，可與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的成熟mircoRNA特異性結(jié)合，從而阻止mircoRNA與其特定mRNA結(jié)合[11]，而針對(duì)miR-133設(shè)計(jì)的antagomirs可有效的沉默miR-133。antagomirs在體內(nèi)非常穩(wěn)定，經(jīng)靜脈注射后，沉默體內(nèi)特異性miRNA的時(shí)間長(zhǎng)達(dá)1周[12]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)antagomirs處理后，心肌細(xì)胞肥大、膠原增生、心功能較丹參酮ⅡA組惡化，表明antagomirs可以下調(diào)miR-133的表達(dá)，從而部分消除丹參酮ⅡA抗心力衰竭大鼠左心室重構(gòu)的作用。

綜上所述，miR-133在丹參酮ⅡA抗心力衰竭大鼠左心室重構(gòu)中發(fā)揮著重要的作用，丹參酮ⅡA可能通過(guò)上調(diào)miR-133水平發(fā)揮抗心力衰竭心肌重構(gòu)的作用。此研究為慢性心力衰竭的治療提供了臨床思路，即可基因水平治療心血管疾病，而且miR-133可能成為新的診斷工具，并可能成為藥物的治療靶點(diǎn)。

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Effect of Tanshinone ⅡA on myocardial remodeling in rats with heart failure by regulating the level of miR-133

FENG Jun，CHEN Huawen

(Tongji Hospital Affiliated to Tongji Medical College,HuaZhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，Hubei, China)

Abstract:Objective It is to investigate the effect of miR-133 on myocardial remodeling in rats with chronic heart failure induced by Tanshinone ⅡA. Methods SD rats were randomly divided into sham operation group, operation group, Tanshinone ⅡA group, miR-133 inhibition group, each group had 10 rats. All the rats in every group except in sham operation group were given abdominal aortic constriction (AAC) to establish chronic heart failure. All the rats were normally fed for 4 weeks, then Tanshinone ⅡA group, miR-133 inhibition group were respectively treated with Tanshinone ⅡA by gavage and antagomirs by implantable “osmotic pumps”, sham operation group and operation group were given the same dose of normal saline by gavage. All the rats were treated for 12 weeks. Cardiac function, cardiac index, left ventricular mass index,morphology and pathological changes were analyzed in 24 h after the end gavage. Results Compared with sham group, cardiac function got worse, cardiac index,left ventricular mass index, cardiac muscle cell diameter and collagen content increased in operation group(P<0.05); the indexes above were obviously improved in Tanshinone ⅡA treatment group and miR-133 inhibition group(P<0.05), and the improvements in the former group were more significant. Conclusion miR-11 plays an important effect in anti-remodeling of left ventricular in the rats with heart failure, Tanshinone ⅡA maybe resist the cardiac remodeling of heart failure rats by up regulating miR-133 levels.

Key words:Tanshinone ⅡA; miR-133; heart failure; cardiac remodeling

[收稿日期]2015-11-02

[中圖分類號(hào)]R-332

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1008-8849(2016)08-0803-04

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.08.002

[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81202825)；湖北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2012FFB02410)

[作者簡(jiǎn)介]馮俊，男，博士，副主任醫(yī)師，研究方向?yàn)樾难芗膊　通信作者]陳華文， E-mail:andyterry555@163.com