王秀　杜冀暉　黃虞　龔慧　王磊　李一凡

?

miR-92a在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其對(duì)腫瘤血管生成的作用*

王秀杜冀暉黃虞龔慧王磊李一凡

摘要目的：探討miR-92a在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其對(duì)腫瘤血管新生功能的影響和作用機(jī)制。方法：采用qRT-PCR方法檢測(cè)廣東醫(yī)學(xué)院附屬深圳南山醫(yī)院2014年6月至2015年12月經(jīng)手術(shù)切除的25例結(jié)直腸癌組織和對(duì)應(yīng)癌旁組織及4種結(jié)直腸癌細(xì)胞（HCT116、SW620、SW480、HT29）中miR-92a的表達(dá)；免疫組織化學(xué)法檢測(cè)結(jié)直腸癌和癌旁組織中CD31陽(yáng)性表達(dá)的微血管密度（microvessel density，MVD），Pearson相關(guān)性分析探討miR-92a表達(dá)與腫瘤血管新生MVD的相關(guān)性。通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-92a-mimic、inhibitor上調(diào)或抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116、SW620中miR-92a的表達(dá)水平，采用小管形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-92a不同表達(dá)對(duì)HUVEC小管形成的影響，免疫印跡法檢測(cè)對(duì)其下游潛在靶點(diǎn)PTEN的蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果：結(jié)直腸癌組織miR-92a的表達(dá)水平顯著高于對(duì)應(yīng)癌旁組織（P＜0.01）；4種人結(jié)腸癌細(xì)胞系miR-92a的表達(dá)水平均顯著高于正常腸上皮組織（P＜0.05）；結(jié)直腸癌組織CD31陽(yáng)性微血管密度顯著高于癌旁組織（P＜0.01），miR-92a表達(dá)水平與結(jié)直腸癌血管新生MVD呈顯著正相關(guān)（r=0.580，P=0.01）；上調(diào)miR-92a表達(dá)的HCT116細(xì)胞培養(yǎng)上清液可以顯著促進(jìn)HUVEC小管形成（P＜0.05）；上調(diào)miR-92a表達(dá)可以顯著抑制HCT116細(xì)胞中PTEN蛋白表達(dá)水平（P＜0.01）。結(jié)論：miR-92a在結(jié)直腸癌細(xì)胞和組織中高表達(dá)，與腫瘤血管新生增加密切相關(guān)；miR-92a可能通過(guò)抑制PTEN的表達(dá)發(fā)揮促進(jìn)結(jié)直腸癌血管新生的生物學(xué)功能。

關(guān)鍵詞miR-92a結(jié)直腸癌血管新生PTEN

作者單位：廣東醫(yī)學(xué)院附屬深圳南山醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室（廣東省深圳市518052）

*本文課題受深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：JCYJ20140411092959841）和深圳市南山區(qū)技術(shù)研發(fā)和創(chuàng)意設(shè)計(jì)項(xiàng)目分項(xiàng)資金教育（衛(wèi)生）科技項(xiàng)目（編號(hào)：南科研衛(wèi)2013002）資助

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是人類(lèi)常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病率居惡性腫瘤的第3位，起病隱匿，預(yù)后較差［1］。近年研究發(fā)現(xiàn)，microRNAs （miRNAs）是一類(lèi)獨(dú)特的非編碼小RNA，在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)或低表達(dá)起到癌基因或抑癌基因的作用，使細(xì)胞增殖和分化失去控制，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展［2］。研究證實(shí)，miR-92a在結(jié)直腸癌等多種腫瘤組織中異常高表達(dá)［3］，并與結(jié)腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后相關(guān)［4］，因此，miR-92a被認(rèn)為是一種癌基因，可能在CRC發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵調(diào)控作用［5］。具有非可控的血管新生能力是惡性腫瘤的基本生物學(xué)特征之一，腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移均與血管新生密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，miR-92a與血管內(nèi)皮細(xì)胞形成、腫瘤血管新生有關(guān)［6-7］。然而，目前有關(guān)miR-92a對(duì)結(jié)直腸癌血管新生功能的影響及其調(diào)控機(jī)制尚不清楚。本研究檢測(cè)miR-92a在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平，分析其與腫瘤血管新生的相關(guān)性；通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-92amimic、inhibitor上調(diào)或抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116、SW620中miR-92a的表達(dá)水平，觀察miR-92a對(duì)HUVEC血管內(nèi)皮細(xì)胞新生功能的影響及對(duì)其下游潛在靶點(diǎn)PTEN表達(dá)的調(diào)控作用，探討miR-92a影響結(jié)直腸癌血管新生的作用及機(jī)制，為結(jié)直腸癌的分子靶向治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1組織標(biāo)本收集廣東醫(yī)學(xué)院附屬深圳南山醫(yī)院2014年6月至2015年12月經(jīng)手術(shù)切除的結(jié)直腸癌及對(duì)應(yīng)癌旁組織（距腫瘤邊緣＞4 cm）標(biāo)本25例。其中男性12例，女性13例；年齡32～84歲，平均年齡（59.2±13.1）歲。入選患者均知情同意并且經(jīng)過(guò)本院倫理審查委員會(huì)審查批準(zhǔn)，術(shù)前未經(jīng)放化療治療，切除標(biāo)本分別于液氮或中性甲醛中保存。

1.1.2細(xì)胞株人結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116、SW620、HT29、SW480由香港中文大學(xué)贈(zèng)與，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC由中山大學(xué)贈(zèng)與。

1.1.3主要試劑TRIzol Reagent、Lipofectamine?2000、RNA逆轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Life Technologies公司；逆轉(zhuǎn)錄引物、miR-92a上游引物和下游引物、miR-92a-3p mimic和miR-92a-3p inhibitor及相應(yīng)陰性對(duì)照均由廣州市銳博生物科技有限公司合成；高糖DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)HyClone公司，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞Human Endothelial SFM培養(yǎng)基及添加因子購(gòu)自美國(guó)Life Technologies公司，Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)BD公司；兔抗人PTEN單克隆抗體（ab154814，克隆號(hào)：EPR7495）購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；羊抗兔二抗（111-035-003）購(gòu)自美國(guó)Jackson公司；兔抗人GAPDH單抗（10494-1-AP）購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司；鼠抗人CD31單抗（ZM-0044，克隆號(hào)：1A10）購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；ABC免疫組織化學(xué)試劑盒（PK-6102）購(gòu)自美國(guó)Vector公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116、SW620、HT29和SW480培養(yǎng)于高糖DMEM完全培養(yǎng)基，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC采用Endothelial SFM基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加生長(zhǎng)因子構(gòu)成的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，37℃、5% CO2培養(yǎng)、穩(wěn)定傳代2～3代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2qRT-PCR方法檢測(cè)miR-92a表達(dá)按TRIzol試劑說(shuō)明書(shū)提取結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞中總RNA，按照RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)設(shè)置反轉(zhuǎn)錄條件。每個(gè)樣本取1 μg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)條件為42℃60 min，70℃10 min。取1 μL cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為50℃2 min，95℃10 min，95℃變性15 s，60℃退火延伸1 min，40個(gè)循環(huán)。組織中miR-92a表達(dá)采用絕對(duì)定量方法，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程，計(jì)算miR-92a的濃度。miRNAs定量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，結(jié)果以總RNA/μg中的miRNAs含量表示（fmol/μg總RNA）。細(xì)胞中提取的RNA以U6作為內(nèi)參，采用2-△△Ct的方法計(jì)算各組miR-92a的相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算平均值。

1.2.3免疫組織化學(xué)法檢測(cè)結(jié)直腸癌組織血管新生情況組織標(biāo)本常規(guī)脫水、石蠟包埋，制作4 μm切片。采用檸檬酸鹽緩沖液進(jìn)行高壓熱修復(fù)，一抗為鼠抗人CD31單抗（1:100），以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，以已知陽(yáng)性片作為陽(yáng)性對(duì)照，按照ABC法檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞CD31表達(dá)。血管新生情況以微血管密度（microvessel density，MVD）表示，以CD31陽(yáng)性表達(dá)的棕黃色血管內(nèi)皮細(xì)胞或細(xì)胞簇代表1條單獨(dú)的微血管，先在低倍鏡（×100）下選擇血管高密度區(qū)，再于高倍鏡（×400）下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)算其微血管數(shù)目平均值。

1.2.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116和SW620細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)細(xì)胞至融合度達(dá)60%左右。實(shí)驗(yàn)組分別加入50 nM miR-92a mimic和100 nM的miR-92a inhibitor及5 μL轉(zhuǎn)染試劑；對(duì)照組分別加入相應(yīng)陰性對(duì)照（negative control，NC）。1×Opti-MEM培養(yǎng)基調(diào)整終體積至2 mL培養(yǎng)6 h，更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后收集各組細(xì)胞用于提取RNA，轉(zhuǎn)染72 h后收集細(xì)胞蛋白和無(wú)血清培養(yǎng)上清液（條件培養(yǎng)基）用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.5小管形成實(shí)驗(yàn)96孔板每孔鋪50 μL Matrigel基質(zhì)膠、接種1×104個(gè)HUVEC，培養(yǎng)24 h，實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組分別加入對(duì)應(yīng)已收集的轉(zhuǎn)染miR-92a mimic、inhibitor的HCT116和SW620細(xì)胞條件培養(yǎng)基100 μL，37℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)，6 h后于顯微鏡下觀察，HUVEC生長(zhǎng)形成閉合環(huán)狀小管樣結(jié)構(gòu)的作為1個(gè)新生小管進(jìn)行計(jì)數(shù)。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每孔取3個(gè)視野計(jì)算平均值。

1.2.6免疫印跡法檢測(cè)PTEN表達(dá)制備10%SDSPAGE凝膠，每孔加入30 μg蛋白樣品，經(jīng)SDS電泳1 h分離蛋白，濕法電轉(zhuǎn)PVDF膜3 h，5%脫脂牛奶封閉1 h，加入兔抗人PTEN一抗（1:2 000），于4℃孵育過(guò)夜，TBST漂洗3次，10 min/次。加入羊抗兔二抗（1:4 000），常溫孵育1 h，TBST漂洗6次，5 min/次。滴加ECL顯影液，采用化學(xué)發(fā)光成像儀成像，測(cè)定目的條帶灰度值、分析蛋白表達(dá)，以GAPDH為內(nèi)參計(jì)算PTEN蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料結(jié)果用x±s表示，采用Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)法進(jìn)行數(shù)據(jù)正態(tài)性檢驗(yàn)，對(duì)于符合正態(tài)分布數(shù)據(jù)，兩組間均值差異比較采用t檢驗(yàn)，結(jié)直腸癌組織miR-92a表達(dá)與血管新生MVD的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1miR-92a在結(jié)直腸癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)

結(jié)直腸癌患者的癌組織（T）及與其相對(duì)應(yīng)的癌旁組織（TAT）miR-92a的表達(dá)水平（圖1A）所示。25例CRC組織的miR-92a表達(dá)水平為（1.102±0.735）（fmol/μg總RNA），顯著高于癌旁組織的（0.037±0.031）（fmol/μg總RNA），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.405，P＜0.01）。以正常結(jié)直腸上皮黏膜組織（normal tissue，NT）為對(duì)照，4種CRC細(xì)胞系中miR-92a的表達(dá)水平均顯著高于正常對(duì)照，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其中HCT116細(xì)胞miR-92a表達(dá)最低，SW620細(xì)胞miR-92a表達(dá)最高（圖1B）。

2.2miR-92a表達(dá)與結(jié)直腸癌血管新生MVD的相關(guān)性

免疫組織化學(xué)法染色檢測(cè)25例結(jié)直腸癌組織和對(duì)應(yīng)癌旁組織血管新生情況（圖2）。結(jié)果顯示，CRC癌組織CD31陽(yáng)性表達(dá)的MVD為（27.400±7.560），顯著高于對(duì)應(yīng)癌旁組織MVD數(shù)量（10.760±3.140），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.829，P＜0.01）。Pearson相關(guān)性分析顯示，結(jié)直腸癌組織中miR-92a的表達(dá)與CD31陽(yáng)性的微血管密度呈顯著正相關(guān)（r=0.580，P=0.01）。

圖1　miR-92a在結(jié)腸癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)水平Figure 1　Expression of miR-92a in CRC tissue and cell

圖2　結(jié)直腸癌組織miR-92a表達(dá)與腫瘤血管新生的相關(guān)性Figure 2 Correlation between miR-92a expression and tumor angiogenesis in CRC

2.3miR-92a高表達(dá)和抑制表達(dá)的細(xì)胞模型建立

分別選擇miR-92a表達(dá)相對(duì)最低、最高的HCT116、SW620細(xì)胞，通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-92a-mimic、inhibitor上調(diào)或抑制其miR-92a的表達(dá)水平，結(jié)果所示（圖3）與陰性對(duì)照組比較，HCT116細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-92a mimic 48 h后，其miR-92a的水平顯著升高（t=7.439，P＜0.05），SW620細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-92a inhibitor 48 h后，其miR-92a的水平顯著降低（t=-45.916，P＜0.01）。

2.4結(jié)直腸癌細(xì)胞miR-92a高表達(dá)或抑制表達(dá)對(duì)HUVEC小管形成能力的影響

小管形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，應(yīng)用轉(zhuǎn)染miR-92a mimic上調(diào)HCT116細(xì)胞miR-92a表達(dá)的條件培養(yǎng)基作用6 h，HUVEC形成完整閉合小管的數(shù)量明顯高于對(duì)照組（t=5.563，P＜0.05）；相反，應(yīng)用轉(zhuǎn)染miR-92a inhibitor抑制SW620細(xì)胞miR-92a表達(dá)的條件培養(yǎng)基作用6 h，HUVEC形成閉合小管的數(shù)量明顯低于對(duì)照組（t=-6.107，P＜0.05，圖4）。

2.5miR-92a高表達(dá)或抑制表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞PTEN蛋白表達(dá)的影響

經(jīng)Targetscan軟件對(duì)miR-92a的靶向基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示miR-92a的種子序列與PTEN基因3'UTR之間存在靶向結(jié)合位點(diǎn)（圖5A），提示PTEN可能是miR-92a的調(diào)控靶基因。轉(zhuǎn)染miR-92a mimic使HCT116細(xì)胞miR-92a顯著升高，其PTEN蛋白條帶灰度值下降26.40% （t=-15.176，P＜0.01）；轉(zhuǎn)染miR-92a inhibitor使SW620細(xì)胞中miR-92a表達(dá)水平顯著降低，其PTEN蛋白條帶灰度值升高21.98%（t=10.911，P＜0.01，圖5B，5C，5D）。結(jié)果提示miR-92a的表達(dá)水平與PTEN蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。

圖3　轉(zhuǎn)染miR-92a mimic、inhibitor上調(diào)或抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞miR-92a表達(dá)水平Figure 3 Expression of miRNA-92a in HCT116 and SW620 cells transfected with miR-92a mimic or inhibitor

圖4　結(jié)直腸癌細(xì)胞miR-92a高表達(dá)或抑制表達(dá)對(duì)HUVEC小管形成能力的影響Figure 4　Effect of miR-92a overexpression or suppression in CRC cells on the formation of HUVEC tubules

圖5　miR-92a高表達(dá)或抑制表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞PTEN蛋白表達(dá)的影響Figure 5　Effect of miR-92a overexpression or suppression on the PTEN protein expression in CRC cells

3　討論

近年研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌中存在多種miRNA的異常表達(dá)，其靶基因參與調(diào)控結(jié)直腸細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化、增殖、轉(zhuǎn)移等進(jìn)程［8］。miR-92a是miR-17-92基因簇家族的一員，Ng等［9］研究發(fā)現(xiàn)miR-17-3p、miR-92在結(jié)直腸癌組織和患者血漿中升高。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)miR-92a在結(jié)直腸癌患者血清中異常高表達(dá)，有望作為新型的CRC診斷標(biāo)志物［10］。本研究進(jìn)一步證實(shí)結(jié)直腸癌組織中miR-92a的表達(dá)水平顯著高于對(duì)應(yīng)癌旁組織；4種人結(jié)腸癌細(xì)胞中miR-92a的表達(dá)水平均顯著高于正常腸上皮對(duì)照，與其他報(bào)道一致［3-4，9］，提示miR-92a在結(jié)直腸癌中可能發(fā)揮促癌基因的作用。

研究表明，miRNA能通過(guò)靶向作用于血管生成因子和蛋白激酶，調(diào)控血管生成的信號(hào)，從而促進(jìn)或抑制腫瘤的血管生成［11］。Dews等［7］研究發(fā)現(xiàn)在k-RAS轉(zhuǎn)化的腸道細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-17-92基因簇，能夠促進(jìn)腫瘤血管的生長(zhǎng)。本研究顯示，miR-92a高表達(dá)的癌組織CD31陽(yáng)性MVD顯著高于miR-92a低表達(dá)的癌旁組織，miR-92a表達(dá)水平與結(jié)直腸癌微血管密度呈顯著正相關(guān)。通過(guò)在結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116和SW620中分別轉(zhuǎn)染miR-92a mimic及inhibitor上調(diào)和下調(diào)miR-92a的表達(dá)，結(jié)果表明高表達(dá)miR-92a的細(xì)胞培養(yǎng)上清液能顯著促進(jìn)HUVEC的小管形成，而miR-92a低表達(dá)的細(xì)胞培養(yǎng)上清液作用于HUVEC的小管形成明顯減少，提示結(jié)直腸癌miR-92a高表達(dá)具有促進(jìn)血管新生的生物學(xué)功能。有研究報(bào)道，結(jié)直腸癌細(xì)胞能通過(guò)分泌包含miR-92a的微泡（microvesicles，MVs）作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，下調(diào)靶基因Dkk-3表達(dá)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移，建立適合腫瘤血管生成的微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)［12］。

本研究進(jìn)一步通過(guò)生物信息分析預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)PTEN可能是miR-92a的下游調(diào)控靶基因。已知PTEN是PI3K/ AKT信號(hào)通路上重要的抑制分子，可以通過(guò)介導(dǎo)VEGF的表達(dá)參與血管新生的調(diào)節(jié)過(guò)程［13］，PTEN的缺失或者表達(dá)下調(diào)能促進(jìn)腫瘤的血管生成［14］。Zhang等［15］研究顯示miR-92a通過(guò)抑制PTEN的表達(dá)，誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞EMT轉(zhuǎn)化，促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)直腸癌細(xì)胞miR-92a的表達(dá)水平與PTEN蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示miR-92a可能通過(guò)抑制PTEN的表達(dá)發(fā)揮調(diào)控作用，促進(jìn)結(jié)直腸癌的血管新生。

綜上所述，miR-92a在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)，與癌組織血管新生增加密切相關(guān)。miR-92a可能通過(guò)抑制PTEN的表達(dá)發(fā)揮促進(jìn)結(jié)直腸癌血管新生的生物學(xué)功能。因此，miR-92a可能成為結(jié)直腸癌新的分子標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)。由于一個(gè)miRNA可以調(diào)控多個(gè)基因的表達(dá)，有關(guān)miR-92a靶向調(diào)控腫瘤血管新生的分子機(jī)制及其在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用仍有待進(jìn)一步深入探究。

參考文獻(xiàn)

［1］Stiegelbauer V，Perakis S，Deutsch A，et al.MicroRNAs as novel predictive biomarkers and therapeutic targets in colorectal cancer［J］.World J Gastroenterol，2014，20（33）:11727-11735.

［2］Vishnubalaji R，Hamam R，Abdulla MH，et al.Genome-wide mRNA and miRNA expression profiling reveal multiple regulatory networks in colorectal cancer［J］.Cell Death Dis，2015，22（6）:e1614.

［3］Volinia S，Calin GA，Liu CG，et al.A microRNA expression signature of human solid tumors defines cancer gene targets［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2006，103（7）:2257-2261.

［4］Zhou T，Zhang G，Liu Z，et al.Overexpression of miR-92a correlates with tumor metastasis andpoor prognosis inpatients withcolorectal cancer ［J］.Int J Colorectal Dis，2013，28（1）:19-24.

［5］Tsuchida A，Ohno S，Wu W，et al.miR-92 is a key oncogenic component of the miR-17-92 cluster in colon cancer［J］.Cancer Sci，2011，102（12）: 2264-2271.

［6］Murata K，Ito H，Yoshitomi H，et al.Inhibition of miR-92a enhances fracture healing via promoting angiogenesis in a model of stabilized fracture in young mice［J］.J Bone Miner Res，2014，29（2）:316-326.

［7］Dews M，Homayouni A，Yu D，et al.Augmentation of tumor angiogenesis by a Myc-activated microRNA cluster［J］.Nat Genet，2006，38 （9）:1060-1065.

［8］Schetter AJ，Okayama H，Harris CC.The role of microRNAs in colorectal cancer［J］.Cancer J，2012，18（3）:244-252.

［9］Ng EK，Chong WW，Jin H，et al.Differential expression of microRNAs in plasma of colorectal cancer patients: a potential marker for colorectal cancer screening［J］.Gut，2009，58（10）:1375-1381.

［10］Xu XY，Du JH，Gong H，et al.The expression of microRNAs in serum of patients with colorectal cancer and its clinical significance［J］.Chinese Journal of Laboratory Medicine，2014，37（9）:691-695.［許欣宜，杜冀暉，龔慧，等.microRNAs在結(jié)直腸癌患者血清中的表達(dá)及其診斷價(jià)值［J］.中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2014，37（9）:691-695.］

［11］Wang W，Zhang E，Lin C.MicroRNAs in tumor angiogenesis［J］.Life Sci，2015，136:28-35.

［12］Yamada N，Nakagawa Y，Tsujimura N，et al.Role of Intracellular and Extracellular MicroRNA-92a in Colorectal Cancer［J］.Transl Oncol，2013，6（4）:482-492.

［13］Okumura N，Yoshida H，Kitagishi Y，et al.PI3K/AKT/PTEN Signaling as a Molecular Target in Leukemia Angiogenesis［J］.Adv Hematol，2012，2012:843085.

［14］Tian T，Nan KJ，Wang SH，et al.PTEN regulates angiogenesis and VEGF expression through phosphatase-dependent and-independent mechanisms in HepG2 cells［J］.Carcinogenesis，2010，31（7）:1211-1219.

［15］Zhang G，Zhou H，Xiao H，et al.MicroRNA-92a functions as an oncogene in colorectal cancer by targeting PTEN［J］.Dig Dis Sci，2014，59 （1）:98-107.

（2016-01-11收稿）（2016-03-02修回）

（編輯：邢穎校對(duì)：張抿）

王秀專(zhuān)業(yè)方向?yàn)閙iR-92a與結(jié)直腸癌血管新生研究。

E-mail：xiuxiuwang66@163.com

·臨床研究與應(yīng)用·

Expression of miR-92a in colorectal cancer and its effect on tumor angiogenesis

Xiu WANG，Jihui DU，Yu HUANG，Hui GONG，Lei WANG，Yifan LI

Correspondence to: Jihui DU；E-mail: jihuidu@163.com

Central Laboratory，Affiliated Nan Shan Hospital，Guangdong Medical College，Shenzhen 518052，China

This work was supported by the Shenzhen Science and Technology Project（No.JCYJ20140411092959841）and the Fund for Education and Public Hygiene of the Technological Invention and Creative Design Project of the Shenzhen Nanshan District（No.2013002）

AbstractObjective: To investigate the expression of miR-92a in colorectal cancer（CRC）and its effect on the regulation mechanisms of tumor angiogenesis.Methods: The miRNA-92a expression in 25 CRC tissues and HT29，SW620，SW480，and HCT116 CRC cells was detected using quantitative real-time polymerase chain reaction.The CD31 positive expression of blood microvessels in CRC tissues was measured by immunohistochemistry.Pearson correlation analysis was used to analyze the relationship between miR-92a and tumor angiogenesis.The miR-92a mimic or inhibitor was transfected into HCT116 and SW620 cells in vitro to upregulate or downregulate the miR-92a expression.The effect of miR-92a overexpression or suppression on the formation of human umbilical vein endothelial cell（HUVEC）tubules was detected by tube formation assay.Changes in phosphatase and tensin homolog（PTEN）protein expression were measured by Western blot.Results: The expression level of miR-92a in CRC tissues was significantly higher than that in matched adjacent tissues（P＜0.01）.The expression levels of miR-92a in HT29，SW480，SW620，and HCT116 colon cancer cell lines were significantly higher than that of the normal colorectal epithelium control（P＜0.05）.The number of CD31 positive expression of microvessel density（MVD）in CRC tissues was significantly higher than that in adjacent tissues（P＜0.01），and the miR-92a expression level was positively correlated with the MVD in CRC tissues（r=0.580，P=0.01）.The cell culture supernatant of HCT116 with miR-92a overexpression could significantly promote the formation of HUVEC tubules（P＜0.05）.The upregulation of miR-92a expression could significantly inhibit the expression of PTEN protein in CRC cells（P＜0.01）.Conclusion: The miR-92a was highly expressed in CRC cells and tissues，which was closely related to the formation of tumor angiogenesis in CRC.The miR-92a could promote tumor angiogenesis in CRC by inhibiting PTEN expression.

Keywords:miR-92a，colorectal cancer，angiogenesis，PTEN

doi:10.3969/j.issn.1000-8179.2016.06.012

通信作者：杜冀暉jihuidu@163.com

作者簡(jiǎn)介