劉曉，羅慶峰，王振賀，蔡劍平，王化虹

(1.北京大學第一醫(yī)院消化科，北京 100034；2.北京醫(yī)院)

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幽門螺桿菌感染胃黏膜組織的DNA及RNA氧化損傷水平比較及致癌機制探討

劉曉1，羅慶峰2，王振賀2，蔡劍平2，王化虹1

(1.北京大學第一醫(yī)院消化科，北京 100034；2.北京醫(yī)院)

[摘要]目的通過檢測幽門螺桿菌(Hp)感染患者及正常對照人群胃黏膜組織DNA及RNA氧化損傷水平，探討氧化應激因素在HP感染致癌中的作用。方法60例Hp感染及無Hp感染胃黏膜組織石蠟包埋，切片免疫組織化學法染色，研究級顯微鏡下觀察采集圖像，IPP軟件定量分析，檢測DNA及RNA氧化產(chǎn)物水平，并行統(tǒng)計學分析。結果Hp感染患者與正常人胃黏膜局部RNA氧化水平標記物8-oxoGsn的免疫組化陽性染色OD值分別為0.117±0.015和0.073±0.012，差異有統(tǒng)計學意義；Hp感染患者與正常人胃黏膜局部DNA氧化水平標記物8-oxodGsn的免疫組化陽性染色OD值分別為0.220±0.036和0.210±0.055，差異無統(tǒng)計學意義。結論Hp感染致人胃黏膜局部RNA氧化水平增高，可能與Hp致癌發(fā)病機制相關。

[關鍵詞]胃腫瘤；幽門螺桿菌；免疫組織化學；氧化性應激

1994年，WHO國際癌癥研究中心將幽門螺桿菌(Hp)列為一級致癌物。目前，關于Hp與胃癌相關性研究的熱點很多，氧化應激因素是其中之一。氧化應激反應可能導致上皮細胞DNA損傷，上皮細胞增殖與凋亡失衡，這些都會增加胃癌發(fā)病的風險。

一般認為DNA氧化損傷可能引起遺傳信息的改變，而RNA氧化后可以快速降解。但是，相較于DNA，RNA面對氧化損傷時顯得更為脆弱，因為大部分RNA都處于單鏈狀態(tài)，缺少氫鍵和組蛋白保護，而且RNA在細胞中的分布更接近活性氧和自由基產(chǎn)生的位置。一旦mRNA受到氧化損傷，則有可能通過堿基錯配產(chǎn)生變異蛋白而影響細胞正常生理功能。當8-羥基鳥嘌呤核苷酸摻入進RNA時，就可能導致變異蛋白的產(chǎn)生，進而影響機體正常生理功能[1-2]。

本研究中，我們就Hp感染慢性胃炎患者胃黏膜組織局部DNA及RNA氧化水平與無Hp感染的人群做對照，研究Hp感染導致組織局部DNA及RNA氧化水平變化并進一步分析其臨床意義。

1材料和方法

1.1實驗材料

1.1.1標本來源北京醫(yī)院消化內(nèi)鏡室因上腹不適、消化不良等慢性胃炎癥狀行胃鏡檢查，確診慢性胃炎的60例患者，除外胃潰瘍、十二指腸潰瘍、胃癌、心腎功能不全、冠心病、糖尿病等。內(nèi)鏡下取胃竇部胃黏膜組織，制作蠟塊。以胃鏡下快速尿素酶法檢測Hp感染情況并切片后免疫組織化學法再次證實Hp感染情況，分為Hp陽性組30例，Hp陰性組30例。所有患者均知情同意。其中，Hp陽性組平均年齡(43.3±5.6)歲，Hp陰性組平均年齡(45.7±3.8)歲。

1.1.2實驗試劑鼠抗8-oxoGua 單克隆抗體(15A3)與鼠抗8-oxodG(N45.1)購自美國Abcam公司,DNase-free RNaseA、RNase-free DNase I購自日本TAKARA公司,SP9002系列二抗試劑盒(山羊來源)、抗體稀釋液、DAB顯色劑購自北京中衫金橋,無水乙醇、二甲苯、檸檬酸、檸檬酸三鈉、NaCl、KCl、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀均購自北京化學試劑有限公司。

1.1.3實驗儀器石蠟切片機(德國Leica RM 2235)、烤片機(中國天津天力機電有限公司)、研究級顯微鏡(日本Nikon公司)

1.2方法

1.2.1組織切片用石蠟切片機切取5 μm切片，撈片后置于烤片機中，70 ℃烤3 h，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2免疫組織化學

1.2.2.115A3染色處理步驟取上述切片于依次置于二甲苯、100%乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇脫蠟，每個梯度2 min，然后水化10 min。加入1 U/μL DNase I 37 ℃下處理1 h，PBS洗3次，H2O2酶阻斷劑(3% H2O2)避光處理15 min，PBS洗3次，山羊血清封閉液封閉30 min，吸棄封閉液，加入15A3抗體(1∶200)，4 ℃過夜孵育，PBS洗3次，二抗處理30 min，PBS洗3次，DAB鏡下顯色40 s，純凈水終止反應后，75%乙醇，85%乙醇，95%乙醇，100%乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性快干膠封片?？瞻讓φ战M用抗體稀釋液孵育過夜。

1.2.2.2N45.1 染色處理步驟脫蠟水化的步驟與15A3相同，水化10 min后，加檸檬酸抗原修復液(pH6.0)微波修復15 min，冷卻至室溫后，PBS洗3次。5 mg/mL DNase-free RNaseA 37 ℃下處理1 h，PBS洗3次，山羊血清封閉后加一抗(1∶100)4℃下過夜孵育，加二抗、顯色與封片的步驟與15A3染色相同。空白對照組用抗體稀釋液孵育過夜。

1.2.2.3結果圖像采集與相對定量在研究級顯微鏡下觀察采集圖像，用Image-Pro Plus(IPP)軟件進行定量分析，背景校正后，計算平均吸光度(OD)，該值與染色深度成正比。為保證結果的客觀性，各個樣品經(jīng)不同的三個人獨立定量計算后獲得后，取其三者平均值作為其最終的平均吸光度。所有用于定量的圖像均在相同的亮度及曝光條件下采集獲取。

1.3統(tǒng)計學處理采用SPSS 19.0軟件統(tǒng)計分析，采用t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1RNA氧化水平變化15A3抗體染色結果顯示，Hp陽性患者胃黏膜出現(xiàn)較深染色，Hp陰性正常人染色較淡，經(jīng)IPP軟件定量分析統(tǒng)計，差異有統(tǒng)計學意義，見圖1及表1。

2.2DNA氧化水平變化N45.1抗體染色結果顯示，Hp陽性患者與Hp陰性正常人的染色深淺程度相當，經(jīng)IPP定量分析統(tǒng)計，Hp陽性患者DNA的氧化水平略高于RNA，但差異無統(tǒng)計學意義，見圖2及表1。

表1　DNA與RNA氧化水平定量結果

3討論

Hp與胃癌相關性的研究熱點很多，如環(huán)境毒素，宿主因素(熱休克蛋白70的表達，環(huán)氧化酶的表達，IL-8的基因多態(tài)性等)，細菌因素(細胞毒素相關蛋白CagA，空泡毒素相關蛋白A VacA等)，以及增加基因突變的氧化應激因素等。其中，Hp感染引起氧化應激反應的可能來源及機制包括中性粒細胞等炎性細胞、血管內(nèi)皮細胞、胃黏膜細胞及Hp自身。Hp感染后激活吞噬細胞，通過進一步激活還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶，生成一系列活性氧自由基(ROS)。吞噬體通過產(chǎn)生這些高活性的ROS殺滅入侵的細菌。但若Hp感染的胃黏膜產(chǎn)生的ROS不足以殺滅Hp，吞噬體會生成更多的ROS，過量的ROS反而造成胃黏膜的損傷。

ROS中羥基自由基(·OH)破壞力較強，可對一些堿基進行修飾，而在所有DNA堿基中，鳥嘌呤具有最低氧化勢，最易被·OH和單態(tài)氧氧化[3]。鳥嘌呤氧化態(tài)為8羥基鳥嘌呤(8-oxoG)，8羥基脫氧鳥苷(8-oxodGsn)是鳥苷酸經(jīng)氧化修飾后的產(chǎn)物，可在DNA子鏈上引起點突變，因此常作為DNA損傷的標志物。8-羥基鳥嘌呤核苷酸摻入進RNA時，產(chǎn)生的8羥基鳥苷(8-oxoGsn)可引起蛋白變異，產(chǎn)生損傷。

Hp感染引發(fā)胃癌的可能機制主要為：(1)上皮細胞DNA損傷；(2)上皮細胞增殖與凋亡失衡。Hp感染引起的氧化應激在兩種致癌機制中都有重要作用。此外，氧化應激在促進腫瘤侵襲和轉移方面也有重要作用。

在本研究中，我們檢測的Hp感染患者胃黏膜局部DNA及RNA氧化產(chǎn)物8-oxodGsn及8-oxoGsn的水平均比無Hp感染者增高，而RNA氧化產(chǎn)物8-oxoGsn水平增高與無Hp感染者相比，差異有統(tǒng)計學意義，DNA氧化產(chǎn)物8-oxodGsn略微增高，與無Hp感染者相比，差異無統(tǒng)計學意義，可見Hp感染后胃黏膜局部氧化應激水平是明顯增高的，其中RNA氧化水平增高更顯著。

8-oxodGsn是DNA氧化損傷的標記物，在Hp感染的胃黏膜組織、血漿中均會增高，且目前的研究證實，以8-oxodGsn為標志物，測得DNA損傷水平與Hp感染程度及部位相關[4-5]。也有研究證實嚴重胃炎及胃癌患者組織8-oxodGsn水平增高，并與CagA陽性相關[6]。但目前關于RNA損傷的研究較少。有學者用免疫組織化學及液相-串聯(lián)質譜法分析研究了人胃癌及癌旁組織RNA氧化損傷水平，8-oxoGsn在癌旁組織中含量低，而在胃癌組織中含量明顯增高，提示RNA氧化損傷可能在胃癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用[7]。也有學者對222例腫瘤患者及134例健康志愿者行血及尿的8-oxoGsn及8-oxodGsn檢測，發(fā)現(xiàn)腫瘤患者水平明顯高于健康志愿者，提示臨床上可以此項標記物作為腫瘤篩查的指標[8]。目前，RNA氧化與疾病的關系在國內(nèi)外已有一些研究，但主要研究對象是神經(jīng)退行性病變方面疾病[9]。我們的研究發(fā)現(xiàn)人Hp感染胃黏膜組織局部RNA氧化損傷水平亦是明顯增高，考慮RNA氧化在Hp感染致癌的過程中可能會發(fā)揮作用。且就本研究而言，RNA氧化損傷水平較DNA氧化損傷水平更高，提示RNA氧化損傷在Hp感染致癌的過程中可能發(fā)揮著更大的作用。

當然，本研究也存在一些不足，樣本量偏小，可能對試驗結果的判定產(chǎn)生一些影響。此外，未對根除Hp后局部黏膜氧化應激水平變化進行動態(tài)觀察，也缺乏治療后的判定。但對目前Hp感染與胃癌發(fā)病機制研究來說，RNA氧化水平增高無疑開辟了一條新的道路。

(本文圖1，2見插圖2-1)

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Clinical significance of DNA and RNA oxidative damage in human gastric mucosa infected with helicobacter pylori

LiuXiao*,LuoQingfeng,WangZhenhe,CaiJianping,WangHuahong

(*DepartmentofDigestion,theFirstHospitalofPekingUniversity,Beijing100034,China)Correspondingauthor:WangHuahong,Email:wwwanghuahong@163.com

[Abstract]ObjectiveBy comparing the amount of DNA and RNA oxidative damage detected in human gastric mucosa of helicobacter pylori infected individuals with that of a matched population control.To explore the effects of oxidation in Hp related gastric cancer.MethodsThe gastric mucosa of 60 patients, 30 of patients with and 30 of patients without Helicobacter pylori, were collected and examined via immunohistochemistry. DNA and RNA oxidative damage were detected and analyzed.ResultsThe level of RNA oxidation was significantly higher in patients with Hp(OD=0.117±0.015) than the controls(OD=0.073±0.012)(P<0.05). DNA oxidation was higher in the Hp group as well, but without statistical significance(P>0.05).ConclusionThe increased level of RNA oxidation in Hp infected individuals may be involved in the underlying mechanism of Hp related gastric cancer.

[Key words]Stomach neoplasms；Helicobacter pylori；Immunohistochemistry；Oxidative stress

基金項目：國家人力資源和社會保障部資助課題(人社廳函[2015]192號)

作者簡介：劉曉，主治醫(yī)師，Email:392528423@qq.com通信作者：王化虹，主任醫(yī)師，教授，Email:wwwanghuahong@163.com

中圖分類號:R735.2

文獻標識碼:A

DOI:10.3969/J.issn.1672-6790.2016.02.008

(收稿日期：2016-01-04)

·腫瘤：基礎與臨床·