劉保榮， 袁　博， 慕喜喜， 慕為民， 王重民

(西安市中心醫(yī)院普外二科，西安　710003； *通訊作者，E-mail:bobopaulcn@163.com)

大黃素通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的抑制作用

劉保榮*， 袁博， 慕喜喜， 慕為民， 王重民

(西安市中心醫(yī)院普外二科，西安710003；*通訊作者，E-mail:bobopaulcn@163.com)

摘要：目的觀察大黃素對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的抑制作用，并探討其可能機(jī)制。方法取人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞，分為對照組，大黃素低濃度(30 μmol/L,LD)組，中濃度(60 μmol/L,MD)組，高濃度(90 μmol/L,HD)組和大黃素+內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特異性應(yīng)激抑制劑4-PBA(大黃素90 μmol/L、PBA8 μmol/L,HD+PBA)組。各實驗組細(xì)胞在培養(yǎng)基中對應(yīng)加入相應(yīng)濃度的大黃素溶液或大黃素+4-PBA溶液后培養(yǎng)48 h，MTT比色法觀察細(xì)胞增殖，Hoechst染色法觀察細(xì)胞凋亡，Western blot法檢測ERS標(biāo)志蛋白GRP-78、CHOP以及活化Caspase-12的表達(dá)變化。結(jié)果與正常對照組相比，LD、MD及HD組大黃素對結(jié)腸癌SW620細(xì)胞增殖的抑制率、細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞內(nèi)GRP-78、CHOP和活化Caspase-12的表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)，且呈現(xiàn)濃度依賴性(P<0.05)；與HD組相比，HD+PBA組對結(jié)腸癌SW620細(xì)胞增殖的抑制作用、細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞內(nèi)GRP-78、CHOP以及活化caspase-12的表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)。結(jié)論大黃素能夠通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖。

關(guān)鍵詞：結(jié)腸癌；大黃素；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡

結(jié)腸癌為世界范圍內(nèi)最常見的實體惡性腫瘤之一，近年來其發(fā)病率以每年2%的速度遞增。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，惡性腫瘤的根治成功率及患者生存率均有提高，但結(jié)腸癌的預(yù)后仍然不佳[1]。目前能夠根治結(jié)腸癌的治療方式仍然是手術(shù)治療，但大部分患者出現(xiàn)明顯臨床癥狀時已失去根治性手術(shù)治療機(jī)會而只能選擇放療、化療等姑息療法。然而，相當(dāng)一部分結(jié)腸癌患者因嚴(yán)重副反應(yīng)而無法耐受放療、化療。因此，具有抗腫瘤活性而毒副作用小的藥物成為近年來研究的熱點。

近年來，源自中草藥的單體成分，如姜黃素、苦參素以及大黃素等均具有抗腫瘤的藥理學(xué)活性。大黃素提取自傳統(tǒng)中藥大黃的根莖中，研究表明其具有多種藥理學(xué)活性，如抗炎、抗感染、抗纖維化以及抗腫瘤等[2]。既往研究顯示大黃素具有抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖以及誘導(dǎo)其凋亡的作用[3，4]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，是多種外界因素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要通路之一。本研究以大黃素處理人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞，觀察大黃素誘導(dǎo)的ERS和細(xì)胞凋亡，以及二者之間的相互關(guān)系，探討ERS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是否為大黃素抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的可能分子機(jī)制。

1材料與方法

1.1細(xì)胞系及主要試劑

SW620細(xì)胞系購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。GRP78、CHOP及GAPDH購自美國Abcam公司；Caspase-12購自Cell Signaling Technology公司。RIPA裂解液購自Santa Cruz公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)與分組處理

將SW620細(xì)胞系接種于含10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640培養(yǎng)基中，于37 ℃，5%CO2傳代培養(yǎng)。根據(jù)實驗設(shè)計，分為對照組，大黃素低濃度組(LD)，大黃素中濃度組(MD)，大黃素高濃度組(HD)和大黃素高濃度+4-PBA組(HD+PBA)。對照組細(xì)胞于培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h；LD組細(xì)胞在培養(yǎng)基中加入大黃素溶液(30 μmol/L)后培養(yǎng)48 h；MD細(xì)胞在培養(yǎng)基中加入大黃素溶液(60 μmol/L)后培養(yǎng)48 h；HD組細(xì)胞在培養(yǎng)基中加入大黃素溶液(90 μmol/L)后培養(yǎng)48 h；HD+PBA組細(xì)胞在培養(yǎng)基中加入大黃素溶液(90 μmol/L)的同時加入4-BPA(DMSO溶解，8 μmol/L，pH=7.2)培養(yǎng)48 h。

1.3細(xì)胞增殖檢測

采用MTT比色法檢測細(xì)胞增殖。將對數(shù)生長期的SW620細(xì)胞接種于96孔板中，每孔接種1×105個。細(xì)胞貼壁生長后，按預(yù)定對照組、LD、MD、HD和HD+PBA分組對應(yīng)加入濃度為0,30,60,90 μmol/L的大黃素，或90 μmol/L的大黃素同時加入4-PBA(DMSO溶解，8 μmol/L，pH=7.2)，每組均設(shè)4個復(fù)孔。培養(yǎng)48 h，隨后加入MTT溶液(5 g/L)20 μl，孵育4 h，棄去上清后加入DMSO 150 μl，震蕩后在酶標(biāo)儀上測量490 nm波長處吸光值(A)，按照以下公式計算抑制率：抑制率=(A對照組-A試驗組)/A對照組×100%。

1.4細(xì)胞凋亡檢測

采用Hoechst33342染色法檢測細(xì)胞凋亡。將各組細(xì)胞制成細(xì)胞涂片，以0.1%多聚甲醛固定30 min，PBS洗滌，避光條件下以Hoechst33342染色10 min，倒置熒光顯微鏡觀察，激發(fā)波長為340 nm。凋亡細(xì)胞內(nèi)可見濃染致密的顆粒塊狀熒光。

1.5Western blot 檢驗相關(guān)蛋白表達(dá)

胰酶消化后收集各組細(xì)胞，以RIPA裂解液處理，對細(xì)胞進(jìn)行勻漿及離心后獲得總蛋白。BCA法檢測蛋白濃度，各組蛋白樣品分別取100 μg 總蛋白，加6×上樣緩沖液，100 ℃變性5 min，經(jīng)10%SDS-PAGE 凝膠電泳后，電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜。5%脫脂奶粉37 ℃封閉2 h，加入GRP-78、Caspase-12、GAPDH和CHOP抗體，4 ℃孵育12 h。PBST洗滌后室溫下采用相應(yīng)二抗孵育30 min，ECL顯色法顯色。

1.6統(tǒng)計學(xué)分析

2結(jié)果

2.1大黃素抑制SW620細(xì)胞增殖且具有濃度依賴性

本研究MTT檢測顯示，經(jīng)過大黃素孵育后，低、中、高濃度組SW620細(xì)胞增殖抑制率分別為(13.2±2.3)%，(34.3±6.3)%，(50.4±8.5)%。與對照組[(6.1±1.4)%]相比較，低、中、高濃度組SW620細(xì)胞增殖抑制率均顯著升高(P<0.05)；隨著大黃素濃度的升高，細(xì)胞增殖抑制率亦呈現(xiàn)顯著升高(見圖1)。

2.2大黃素能夠誘導(dǎo)SW620細(xì)胞凋亡且具有濃度依賴性

通過Hoechst33342熒光染色發(fā)現(xiàn)，大黃素孵育后，低、中、高濃度組SW620細(xì)胞凋亡逐漸增多(見圖2)，細(xì)胞凋亡率分別為(16.9±4.3)%，(29.4±5.2)%，(38.6±6.8)%。與對照組[(3.3±1.3)%]相比較，各濃度組均呈現(xiàn)濃度依賴性升高(P<0.05, 見圖3)。

與對照組比較*P<0.05；與LD組比較 #P<0.05；與MD組比較，△P<0.05圖1　不同濃度大黃素作用后SW620細(xì)胞增殖抑制率的變化Figure 1　The proliferation inhibition rate of SW620 cells after cultured with different concentrations of emodin

圖2　不同濃度大黃素誘導(dǎo)的SW620細(xì)胞凋亡變化 (Hoechst染色)Figure 2　Changes of apoptosis of SW620 cells induced by different concentrations of emodin (Hoechst Staining)

與對照組比較，*P<0.05；與LD組比較，#P<0.05；與MD組比較，△P<0.05圖3　大黃素對SW620細(xì)胞凋亡影響Figure 3　Effect of emodin on the apoptosis of SW620 cells

2.3內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-PBA抑制大黃素抗腫瘤作用

在大黃素處理SW620細(xì)胞的同時采用4-PBA進(jìn)行干預(yù)，4-PBA能夠同時抑制大黃素對SW620細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用及大黃素對SW620細(xì)胞增殖的抑制活性(見圖4，5)。

2.4大黃素通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)SW620細(xì)胞凋亡

如圖6所示，大黃素處理SW620細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)GRP-78、CHOP及Caspase-12表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)，且呈現(xiàn)相應(yīng)的濃度依賴性(P<0.05)；然而，在大黃素及4-PBA共處理的SW620細(xì)胞中，與同濃度大黃素處理的SW620細(xì)胞相比，GRP-78、CHOP以及活性Caspase-12表達(dá)水平均顯著下降(P<0.05)。

3討論

大黃素為蒽醌類衍生物，是中藥大黃的主要有效單體，其結(jié)構(gòu)為1,3,8-三羥基-6甲基蒽醌。既往研究表明其具有多種藥理學(xué)活性，如抗炎、抗感染、抗纖維化以及抗腫瘤等[2]。大黃素對多種人類腫瘤如乳腺癌、肝細(xì)胞癌、膀胱癌以及宮頸癌等均有顯著的抑制作用[5,6]。既往研究同時顯示大黃素具有抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖以及誘導(dǎo)其凋亡的作用[3，4]，研究顯示，大黃素是通過抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，抑制腫瘤血管生成和侵襲、轉(zhuǎn)移，增加腫瘤的化療敏感性和逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥，減輕化療藥物毒副反應(yīng)等多種機(jī)制表現(xiàn)出抗腫瘤效應(yīng)[7]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，是多種外界因素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要通路之一。因此將二者之間相互聯(lián)系，探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是否為抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的可能相關(guān)分子機(jī)制是本研究的目的。

圖4　4-PBA干預(yù)后大黃素孵育的SW620細(xì)胞凋亡變化Figure 4　Changes of apoptosis of SW620 cells incubated by emodin or emodin+4-PBA

與對照組比較，*P<0.05；與HD組比較，#P<0.05圖5　4-PBA對大黃素孵育SW620細(xì)胞凋亡及細(xì)胞增殖的影響Figure 5　Effect of 4-PBA on the apoptosis and proliferation of SW620 cells

與對照組比較，*P<0.05；與LD組比較，#P<0.05；與MD組比較，&P<0.05；與HD組比較，△P<0.05圖6　各組細(xì)胞內(nèi)GRP-78,CHOP以及活化Caspase-12蛋白的相對表達(dá)情況Figure 6　Relative expression of GRP-78,CHOP and Caspase-12 proteins in different groups by Western blot

本研究中用不同濃度大黃素處理人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞，觀察大黃素誘導(dǎo)的ERS和細(xì)胞凋亡，實驗結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度大黃素孵育后，人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞的細(xì)胞凋亡增加，對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖產(chǎn)生抑制，且呈現(xiàn)濃度依賴性，提示大黃素表現(xiàn)出對結(jié)腸癌的抗腫瘤活性。此結(jié)果與文獻(xiàn)報道結(jié)果[8]基本一致。

GRP78是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的分子伴侶，位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活后從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上解離，其表達(dá)水平與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的程度呈正相關(guān)，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的分子標(biāo)志[9]。CHOP是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生的效應(yīng)蛋白，起轉(zhuǎn)錄因子的活性，可誘導(dǎo)下游凋亡效應(yīng)蛋白的合成及凋亡通路激活。在哺乳動物體內(nèi)，Caspase-12被認(rèn)為是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)凋亡通路的特異性caspase蛋白，通過裂解激活，其活性片段(42 kD)能夠進(jìn)一步誘導(dǎo)下游Caspase-3及Caspase-9的激活，進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡[10]。本研究顯示，在大黃素處理后，SW620細(xì)胞內(nèi)GRP-78、CHOP以及Caspase-12水平均明顯升高，進(jìn)而且凋亡水平升高，細(xì)胞增殖被抑制。證實SW620細(xì)胞經(jīng)大黃色孵育后，ERS參與了SW620細(xì)胞的凋亡，導(dǎo)致SW620增殖抑制。另一方面，在使用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激特異性抑制劑4-PBA處理后，大黃素處理的SW620細(xì)胞內(nèi)GRP-78、CHOP以及Caspase-12表達(dá)水平均顯著下降，大黃素對細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用被抑制，最終表現(xiàn)為大黃素對SW620細(xì)胞增殖抑制活性的下降。反向證明ERS是大黃色誘導(dǎo)SW620細(xì)胞增殖抑制的重要機(jī)制。

總之，作用一種具有抗腫瘤活性的中藥單體，大黃素對人類結(jié)腸癌細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡可能是大黃素抗腫瘤活性的重要機(jī)制之一。

參考文獻(xiàn)：

[1]Gill AA,Enewold L,Zahm SH,etal,Colon cancer treatment:are there racial disparities in an equal-access healthcare system?[J].Dis Colon Rectum,2014,57(9):1059-1065.

[2]Wei WT,Lin SZ,Liu DL,etal,The distinct mechanisms of the antitumor activity of emodin in different types of cancer(Review)[J].Oncol Rep,2013,30(6):2555-2562.

[3]Liu JX,Zhang JH,Li HH,etal,Emodin induces Panc-1 cell apoptosis via declining the mitochondrial membrane potential[J].Oncol Rep,2012,28(6):1991-1996.

[4]Cha Tai-Lung,Qiu Lin,Chen Chun-Te,etal,Emodin down-regulates androgen receptor and inhibits prostate cancer cell growth[J].Cancer Res,2005,65(60):2287-2295.

[5]Ok S,Kim SM,Kim C,etal.Emodin inhibits invasion and migration of prostate and lung cancer cells by downregulating the expression of chemokine receptor CXCR4[J].Immunopharmacol Immunotoxicol,2012,34(5):768-778.

[6]Xu YY,You YW,Ren XH，etal.Endoplasmic reticulum stress-mediated signaling pathway of gastric cancer apoptosis[J].Hepatogastroenterology,2012,59(120):2377-2384.

[7]夏啟松，孫仁宇，修瑞娟．大黃素抗腫瘤分子機(jī)制的研究進(jìn)展[J]．中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2006，29(1):85-88．

[8]左文英，陳媛媛，蔡駿，等.大黃素抑制人結(jié)腸癌RKO、Caco-2細(xì)胞體外增殖作用的研究[J].遼寧中醫(yī)雜志，2013，40(3)：580-582.

[9]Xu YY,You YW,Ren XH，etal.Endoplasmic reticulum stress-mediated signaling pathway of gastric cancer apoptosis[J].Hepatogastroenterology,2012,59(120):2377-2384.

[10]Xu Xiucai,Liu Tingting,Zhang Aimei,etal.Retraction for Xu et al,Reactive oxygen species-triggered trophoblast apoptosis is initiated by endoplasmic reticulum stress via activation of caspase-12,CHOP,and the JNK pathway in Toxoplasma gondii infection in mice[J].Infect Immun,2015,83(4):1735.

Inhibitory effect of emodin on the proliferation of colon cancer cells through the pathway of apoptosis induced by endoplasmic reticulum stress

LIU Baorong*, YUAN Bo, MU Xixi, MU Weimin, WANG Chongmin

(SecondDepartmentofGeneralSurgery,Xi’anCentralHospital,Xi’an710003,China;*Correspondingauthor,E-mail:bobopaulcn@163.com)

Abstract：ObjectiveTo investigate the inhibitory effect of emodin on the proliferation of colon cancer cells and to explore its possible mechanism.MethodsThe human colon cancer cells of SW620 were divided into control group, low concentration of emodin(30 mol/L) group(LD), middle concentrations of emodin(60 mol/L) group(MD), high concentration of emodin(90 mol/L) group(HD) and emodin(90 mol/L) plus 4-PBA(ERS inhibitor,8 μmol/L) group(HD+PBA). The SW620 cells were cultured with the corresponding concentrations of emodin or emodin plus 4-PBA. After culture for 48 h, the proliferation rate of SW620 cells was observed by MTT colorimetric method, the apoptosis of SW620 cells was observed by Hoechst staining, and the expression of endoplasmic reticulum stress(ERS) marker proteins(GRP-78, CHOP and activated Caspase-12) in SW620 cells were detected by Western blot.Results Compared with control group, the inhibitive rate of proliferation, the apoptosis rate and the expression levels of GRP-78, CHOP and activated Caspase-12 were significantly increased in a concentration dependent manner in LD, MD and HD groups(P<0.05). Compared with HD group, the inhibitive rate of proliferation, the apoptosis rate and the expression levels of GRP-78, CHOP and activated Caspase-12 were significantly decreased in HD+PBA group(P<0.05).ConclusionThe proliferation of colon cancer cells can be inhibited by emodin through the pathway of apoptosis induced by ERS.

Key words:colon cancer;emodin;endoplasmic reticulum stress; cell proliferation; apoptosis

作者簡介：劉保榮，男，1974-09生，碩士，副主任醫(yī)師，E-mail:bobopaulcn@163.com

收稿日期：2016-03-09

中圖分類號：R735.35

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1007-6611(2016)06-0517-05

DOI：10.13753/j.issn.1007-6611.2016.06.007