張鴻偉,　許　輝,　張曉梅,　鮑　蕾,　王鳳美,陳亮珍,　梁成珠,　王妍婷,　秦良勇

(1. 山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心, 山東 青島 266002;2. 雀巢食品安全研究院, 北京 100102; 3. 青島蔚藍(lán)生物集團(tuán)有限公司, 山東 青島 266061)

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液相色譜-四極桿/飛行時間高分辨質(zhì)譜組合化學(xué)計量學(xué)方法快速篩查嬰幼兒配方乳粉中化學(xué)危害物

張鴻偉1*,許輝1,張曉梅1,鮑蕾2,王鳳美1,陳亮珍3,梁成珠1,王妍婷1,秦良勇1

(1. 山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心, 山東 青島 266002;2. 雀巢食品安全研究院, 北京 100102; 3. 青島蔚藍(lán)生物集團(tuán)有限公司, 山東 青島 266061)

摘要:采用液相色譜-四極桿/飛行時間(LC-Triple TOF?)高分辨質(zhì)譜組合化學(xué)計量學(xué)方法建立了嬰幼兒配方乳粉中化學(xué)危害物的快速篩查模型。實驗采用人工添加外源化學(xué)物質(zhì)(沙丁胺醇、林可霉素、磺胺嘧啶、螺旋霉素、雙氯西林和醋酸甲地孕酮)模擬嬰幼兒配方乳粉中未知化學(xué)危害物污染,15種不同的乳粉等量混合后用水復(fù)溶,配制代表性乳粉溶液樣品。依據(jù)添加與否將樣品分為參照組(不含添加的化合物)和添加組。乳粉溶液試樣加入乙腈進(jìn)行提取,經(jīng)Captiva NDLipids固相萃取柱凈化,CORTECSTMUPLC C18+柱液相色譜分離,以0.3%(v/v)甲酸-5%(v/v)水-乙腈溶液和0.3%(v/v)甲酸-5%(v/v)乙腈-水溶液為流動相梯度洗脫;飛行時間質(zhì)譜全掃描(TOF MS)-信息依賴性采集(IDA)-子離子掃描(product ion scan)正離子模式采集樣品數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)經(jīng)MarkerViewTM軟件預(yù)處理后導(dǎo)入SIMCA-P軟件,對比分析參照組和添加組樣品數(shù)據(jù),擬合構(gòu)建正交偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA)模型,并利用此模型進(jìn)行樣品組別區(qū)分和添加化合物識別。結(jié)果表明,實驗構(gòu)建的篩查模型擬合度和預(yù)測能力良好(R2X(cum)=0.742, R2Y(cum)=0.997, Q2Y(cum)=0.905),參照組和添加組樣品被顯著區(qū)分,6種添加的化合物(最低添加水平為50 μg/kg,以乳粉計)全部被可靠地識別。該研究建立的方法為嬰幼兒配方乳粉質(zhì)量安全主動分析監(jiān)控體系提供了有益技術(shù)參考。

關(guān)鍵詞:液相色譜-高分辨質(zhì)譜;化學(xué)計量學(xué);正交偏最小二乘法-判別分析;化學(xué)危害物;嬰幼兒配方乳粉

化學(xué)性危害作為食源性危害的重要組成部分之一,通常不具急性臨床癥狀而難以發(fā)現(xiàn),食品中化學(xué)性危害物主要包括農(nóng)業(yè)化學(xué)品、環(huán)境和加工過程污染物、藥物殘留、毒素、非法添加物等[1]。嬰幼兒肌體機(jī)能未發(fā)育完善而成為食源化學(xué)性危害的易感人群,長期大量攝入含有化學(xué)危害物的嬰幼兒配方乳粉會對嬰幼兒造成嚴(yán)重健康損害[2],針對嬰幼兒配方乳粉中的化學(xué)危害物分析[3-6]已成為食品質(zhì)量安全控制的一個重要關(guān)注點,相比其他檢測技術(shù),質(zhì)譜檢測器以其更好的選擇性和靈敏度而成為化學(xué)危害物分析的優(yōu)先選擇[7,8]。相比傳統(tǒng)的目標(biāo)物定向分析(分析目標(biāo)物被預(yù)設(shè)定)技術(shù),基于高分辨質(zhì)譜的全掃描技術(shù)理論上可以監(jiān)測所有采集到的離子,允許對數(shù)據(jù)進(jìn)行采集后分析,這種模式既可以進(jìn)行定向的目標(biāo)物分析,也可以進(jìn)行不設(shè)定目標(biāo)分析物的非定向分析[9-11]。非定向分析作為定向分析的補(bǔ)充,在食品安全分析領(lǐng)域主要用于檢測和鑒別食品中不期望出現(xiàn)的、會導(dǎo)致或可能會導(dǎo)致健康危害的物質(zhì),這種具有食品安全風(fēng)險識別能力的分析技術(shù)尤其契合當(dāng)前嬰幼兒配方乳粉因?qū)覍页霈F(xiàn)“非常規(guī)監(jiān)測物質(zhì)”而引發(fā)信心危機(jī)的狀況?；瘜W(xué)計量學(xué)概念是在1971年由瑞典科學(xué)家Svante Wold提出[12],是處理復(fù)雜分析數(shù)據(jù)和進(jìn)行信息挖掘的有效工具,近年來其在化學(xué)分析領(lǐng)域應(yīng)用更加深入與頻繁[13-18],與高分辨質(zhì)譜技術(shù)組合使用的報道多集中在食品真實性分析和溯源分析領(lǐng)域[19-21],隨著儀器性能的提升和化學(xué)計量學(xué)軟件的升級,高分辨質(zhì)譜有機(jī)組合化學(xué)計量學(xué)形成“高信息量采集+信息挖掘分析”模式,極大地推動了非定向分析技術(shù)的發(fā)展,篩查化學(xué)污染物和監(jiān)控相關(guān)物質(zhì)非法使用的研究也逐漸增多[22-24]。在目前情況下,嬰幼兒乳粉作為一類關(guān)注度較高的人工食品,使用高分辨質(zhì)譜組合化學(xué)計量學(xué)方法開展非定向食源化學(xué)性危害分析具有重要現(xiàn)實意義。

本文以嬰幼兒配方乳粉為目標(biāo)基質(zhì),選擇不同化合物種類、不同極性大小、法規(guī)不同要求(禁用和限用)及在日常嬰幼兒配方乳粉監(jiān)控檢測中有要求[25]的6種化學(xué)藥物:沙丁胺醇、林可霉素、磺胺嘧啶、螺旋霉素、雙氯西林和醋酸甲地孕酮,采用人工添加的方式模擬未知化學(xué)危害物污染,15種不同的嬰幼兒配方乳粉樣品等量混合,用水復(fù)溶混勻后制備乳粉基質(zhì)代表性乳粉溶液。乳粉溶液樣品經(jīng)乙腈提取,過濾性固相萃取柱去除蛋白和脂類基質(zhì)組分,液相色譜-高分辨質(zhì)譜分別采集“空白”(不含6種化合物)基質(zhì)乳粉溶液樣品(參照組)和添加乳粉溶液樣品(添加組)的相關(guān)數(shù)據(jù),使用化學(xué)計量學(xué)中的軟獨立建模分類方法(soft independent modelling of class analogy, SIMCA)擬合構(gòu)建正交偏最小二乘法-判別分析模型(orthogonal partial least squares-discriminant analysis, OPLS-DA),以此區(qū)分參照組和添加組樣品并識別添加的化學(xué)藥物。

1實驗部分

1.1儀器、試劑與材料

Shimadzu 30A快速液相色譜儀(日本島津公司); 5600+ Triple TOF?四極桿/飛行時間質(zhì)譜儀(美國SCIEX公司),配復(fù)合(DuoSpray)離子源,應(yīng)用軟件為Analyst TF (版本1.7); CR 22GⅡ高速冷凍離心機(jī)(日本HITACHI公司); KQ-100E臺式超聲波儀(昆山市超聲儀器有限公司)。

乙腈為質(zhì)譜級(美國Merck公司),水為Milli-Q Gradient系統(tǒng)制備的超純水(電阻率18.2 MΩ·cm),甲酸為分析級(美國Sigma-Aldrich公司)。

沙丁胺醇(salbutamol,純度98.5%)、林可霉素(lincomycin,純度99.5%)、磺胺嘧啶(sulfadiazine,純度99.5%)、螺旋霉素(spiramycin,純度96.0%)、雙氯西林(dicloxacillin,純度99.0%)和醋酸甲地孕酮(megestrol-17-acetate,純度99.0%)均購自德國Dr. Ehrenstorfer公司;Captiva NDLipids固相萃取柱(3 mL)購自Agilent公司。

1.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

除雙氯西林外,分別取標(biāo)準(zhǔn)品各10.0 mg于10 mL棕色容量瓶中,用甲醇溶解并定容,配制成1.0 g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液;稱取雙氯西林10.0 mg于10 mL棕色容量瓶中,用純水溶解定容,配制成1.0 g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液并分裝(每次使用一份)。標(biāo)準(zhǔn)儲備液均于-20 ℃保存。用甲醇稀釋上述標(biāo)準(zhǔn)儲備液,配制成不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3嬰幼兒配方乳粉基質(zhì)代表性乳粉溶液的制備

選取來自國內(nèi)、國外不同品牌不同配方的嬰幼兒配方乳粉,采用相應(yīng)的殘留分析國家標(biāo)準(zhǔn)方法[26-31]對6種添加化學(xué)藥物進(jìn)行檢測,以確認(rèn)乳粉中是否含有相關(guān)物質(zhì)。確認(rèn)不含添加物質(zhì)的嬰幼兒配方乳粉,依據(jù)產(chǎn)地、配方組分表和品牌選取5類(每類乳粉產(chǎn)品均有3段不同配方設(shè)計,對應(yīng)不同年齡段嬰幼兒,共計15種樣品),作為制備嬰幼兒配方乳粉基質(zhì)代表性乳粉溶液的原料。分別稱取每種供試乳粉4.0 g(總重60.0 g)于500 mL玻璃燒杯中,加入240 mL純水,玻璃棒攪拌混勻,以此作為嬰幼兒配方乳粉基質(zhì)代表性乳粉溶液,并以每份5.0 g分裝到15 mL離心管中作為供試樣本。

1.4樣品分組及前處理

從制備好的樣品中隨機(jī)取17份為參照組。另取9份樣品分別添加適量6種化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液作為添加組,添加水平為50、100和200 μg/kg(以乳粉質(zhì)量計),每個水平3個樣品。同時單獨取1份添加水平為200 μg/kg的樣品作為質(zhì)控(quality control, QC)樣品,用于平衡分析系統(tǒng)和進(jìn)行重現(xiàn)性評估。

每份試樣加入6 mL乙腈,渦旋混勻1 min,于4 ℃ 10 000 r/min下離心10 min,取3 mL上清液過Captiva NDLipids固相萃取柱,收集濾出液。吸取2 mL濾出液于40 ℃以下氮吹至近干,加入0.5 mL乙腈-水(1∶9, v/v)超聲復(fù)溶,過0.22 μm濾膜后進(jìn)樣分析。

1.5色譜-質(zhì)譜條件

CORTECSTMC18+色譜柱(100 mm×2.0 mm, 1.6 μm);柱溫40 ℃;流速0.3 mL/min;進(jìn)樣量30 μL;流動相A為0.3%(v/v)甲酸-5%(v/v)乙腈-水溶液,B為0.3%(v/v)甲酸-5%(v/v)水-乙腈溶液。梯度洗脫程序為：0～2.0 min, 95%A; 2.0～6.5 min, 95%A～80%A; 6.5～14.0 min, 80%A～5%A; 14.0～16.0 min, 5%A; 16.0～20.0 min, 95%A。

電離方式:ESI+;采集模式:TOF MS-information dependent acquisition(IDA)-Product Ion; TOF MS掃描質(zhì)荷比范圍:m/z100～1 000; TOF MS采集累積時間:0.2 s; IDA采集閾值:500 cps(勾選動態(tài)背景扣除); Product Ion采集累積時間:0.05 s;解聚電壓:100 V;碰撞能量:35 V,擴(kuò)展碰撞能量:15 V;離子釋放延遲:67 V;離子釋放帶寬:25 V;離子源溫度:550 ℃;霧化氣壓力:0.402 MPa;氣簾氣壓力:0.134 MPa;輔助氣壓力:0.335 MPa;電噴霧電壓:5 500 V。

1.6數(shù)據(jù)采集與處理

樣品數(shù)據(jù)采集之前先采用QC樣品連續(xù)進(jìn)樣8次,平衡分析系統(tǒng)和觀察儀器狀況。本研究共有26個測試樣品(17個參照組樣品、9個添加組樣品),每個樣品隨機(jī)采集2次數(shù)據(jù),共計52個數(shù)據(jù);添加組樣品每針采集后要用試劑空白進(jìn)行柱測試,防止交叉污染,9個添加組樣品共需采集18次試劑空白數(shù)據(jù),由此全部數(shù)據(jù)采集量為70個數(shù)據(jù)。將此70次數(shù)據(jù)采集分為7個批次提交,每個批次包括2針QC樣品、10針測試樣品、2針質(zhì)譜質(zhì)量軸校正(SCIEX APCI正離子校正液,PN.4460131)。QC樣品和測試樣按“QC-測試樣-QC-測試樣-QC”順序排列,7個批次共計采集8個QC數(shù)據(jù)。

樣品采集獲得的數(shù)據(jù)采用SCIEX公司的MarkerViewTM(版本1.2.1.1)軟件進(jìn)行預(yù)處理。軟件相關(guān)參數(shù)設(shè)置如下:最小的保留時間設(shè)定為0.5 min(過濾死體積);質(zhì)量偏差容許設(shè)定為10×10-6(10 ppm);峰背景差減閾值為10次掃描;差減倍數(shù)因子為1.3;最小質(zhì)譜峰寬25×10-6(25 ppm);最小的保留時間峰寬為8次掃描;噪聲閾值為300 cps;最多峰發(fā)現(xiàn)數(shù)量為5 000。這些參數(shù)設(shè)定目的是保證軟件能發(fā)現(xiàn)合理的色譜質(zhì)譜峰并且在峰排列時進(jìn)行合理的合并。

將預(yù)處理后的數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P(版本14.0, UMETRICS AB,瑞典)軟件,使用軟件的Omics組件擬合構(gòu)建正交偏最小二乘法-差別分析模型,模型擬合構(gòu)建中參照組和添加組的數(shù)據(jù)默認(rèn)采用Pareto進(jìn)行數(shù)據(jù)縮放和居中處理,擬合構(gòu)建的模型質(zhì)量采用3個參數(shù)(R2X(cum),R2Y(cum),Q2Y(cum))評估其擬合度和預(yù)測能力。

2結(jié)果與討論

2.1實驗方案的設(shè)計

本研究采用人工添加化學(xué)藥物的方法模擬嬰幼兒配方乳粉受到未知化學(xué)危害物的污染,通過對比分析未污染對照組樣品和已污染的添加組樣品,探討通過液相色譜-高分辨質(zhì)譜組合化學(xué)計量學(xué)方法快速篩查嬰幼兒配方乳粉中可能存在化學(xué)危害物的技術(shù)可行性,即未知目標(biāo)物的非定向分析。

在實驗方案的設(shè)計方面,首先,鑒于乳粉種類的多樣性,嬰幼兒乳粉基質(zhì)代表性乳粉溶液的制備采用混合不同產(chǎn)地、配方和品牌的嬰幼兒配方乳粉以獲得具有相對基質(zhì)代表性的乳粉溶液,并以此混合乳粉溶液來考察前處理方法和后續(xù)數(shù)據(jù)分析的有效性。實驗共考察了10余類不同的嬰幼兒配方乳粉,最終依據(jù)產(chǎn)地、配方組分和品牌選取了5類,每類含3種配方設(shè)計共計15種乳粉作為基質(zhì)代表性乳粉溶液的制備原料?；|(zhì)代表性乳粉溶液的制備中,乳粉與水的質(zhì)量比設(shè)定為1∶4。一是保證乳粉的充分溶解形成均一溶液,二是考慮與乙腈混合提取的有效性(如提取效率、沉淀蛋白和濃縮難易度)。參照相關(guān)文獻(xiàn)[32,33]和預(yù)實驗效果,最終設(shè)定水和乙腈的體積比為4∶6。其次,添加化合物的選擇方面,6種物質(zhì)共涉及β-受體激動劑類、林可酰胺類、磺胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、β-內(nèi)酰胺類和孕激素類,這幾類物質(zhì)屬乳粉基質(zhì)的常見監(jiān)控物質(zhì)種類,且在極性差別和法規(guī)要求方面均有一定的代表性,因此選作模擬化學(xué)危害物的代表,用于考察前處理方法能否有效提取相關(guān)物質(zhì)并考察色譜寬極性分離的有效性,以此更好地評估對于未知化學(xué)危害物的分析能力。6種用于添加的化學(xué)物質(zhì)相關(guān)信息見表1。不同的添加水平主要為了考察模型識別的靈敏度;相對較高的添加水平設(shè)計側(cè)重于較高風(fēng)險識別,殘留限量規(guī)定不是主要的考量因素。

在實驗方法的設(shè)計方面,非定向分析方法的前處理一般而言應(yīng)滿足幾個要求[11]: ①方法應(yīng)具有廣譜性(即方法的選擇性要低以覆蓋更廣范圍的化合物種類); ②方法的重現(xiàn)性要好,尤其是涉及使用化學(xué)計量學(xué)技術(shù)來處理數(shù)據(jù)的情況;③方法應(yīng)具有較高的處理通量。實現(xiàn)前處理方法的廣譜性通常采用能在寬極性范圍具有提取能力的溶劑,如甲醇、乙腈等,同時采用盡可能少的提取凈化步驟以減少目標(biāo)物分析數(shù)量和種類的損失。針對本研究,前處理采用混合極性的溶劑來擴(kuò)充分析物提取范圍,乳粉先用水溶解,讓極性較大的物質(zhì)進(jìn)入水相,再采用乙腈提取中等極性和相對弱極性的組分,同時沉淀蛋白,采用Captiva NDLipids固相萃取柱過濾凈化可有效去除可產(chǎn)生離子抑制的磷脂、蛋白以及表面活性劑等。前處理設(shè)計充分考慮了嬰幼兒配方乳粉蛋白和脂類含量較高的特點[34],同時過濾凈化的方式也兼顧了樣品處理通量。色譜分離采用核-殼型C18色譜柱主要考慮寬極性范圍分析物的分離,核-殼技術(shù)的填料可以獲得較好的峰形和較低的背壓;流動相選擇較高的酸度主要考慮了酸性、堿性和中性物質(zhì)的合理保留和整體的靈敏度;較緩的洗脫梯度是為了多組分更為充分的分離;設(shè)定質(zhì)譜TOF MS掃描的范圍為m/z100～1 000,是控制化合物分析范圍為有機(jī)小分子;IDA和Product Ion采集模式的使用則是備用于確認(rèn)模型篩選出的化學(xué)危害物。

表1　6種添加化合物的相關(guān)信息

* Predicted by ACD/Labs Percepta Platform-PhysChem Module on website of ChemSpider; ** calculated by [M+2H]2+.

在上述設(shè)計和實驗條件下,圖1為添加50 μg/kg的6種化合物時的TOF MS精確質(zhì)量數(shù)提取離子流色譜圖,6種物質(zhì)可有效提取和監(jiān)測,在色譜體系中的保留也顯示其洗脫幾乎覆蓋了整個梯度變化過程,該結(jié)果說明了實驗設(shè)計的有效性。

圖 1　嬰幼兒配方乳粉中添加50 μg/kg(以乳粉質(zhì)量計) 　　　6種化合物時的TOF MS提取離子流圖Fig. 1　Extracted ion chromatograms of TOF MS scan of　　　the six chemicals spiked at 50 μg/kg (based on weight of infant formula) in blank infant formula

2.2樣品數(shù)據(jù)的采集

7個進(jìn)樣批次QC樣品8次數(shù)據(jù)采集的情況見圖2。QC樣品中同時含有基質(zhì)組分和添加組分,其數(shù)據(jù)的情況可以完整地反映整個分析流程的信息。每個進(jìn)樣批次中，在批次始末均有QC樣品數(shù)據(jù),故通過QC樣品8次數(shù)據(jù)的比較可有效地評估數(shù)據(jù)采集質(zhì)量。由圖2可見,8次數(shù)據(jù)采集的譜圖一致性良好,說明儀器分析系統(tǒng)在整個分析流程中穩(wěn)定性良好。圖3給出了典型的參照組樣品和添加組(50 μg/kg)樣品的TOF MS總離子流圖,參照組譜圖與添加組譜圖從目測角度而言無明顯差別。在未知添加化合物的情況下,對樣品是否含有化學(xué)危害物進(jìn)行判斷比較困難,因此引入化學(xué)計量學(xué)方法對數(shù)據(jù)進(jìn)行信息挖掘是整個實驗設(shè)計的關(guān)鍵。需要說明的是,在添加樣本的數(shù)據(jù)采集中,分別有添加水平為50 μg/kg和200 μg/kg的2個樣品共計4個采集數(shù)據(jù)無效(進(jìn)樣小瓶測試液液面過低,進(jìn)樣不足致總離子流響應(yīng)很低),所以這4個數(shù)據(jù)被剔除不參與任何數(shù)據(jù)分析過程。由此,原有數(shù)據(jù)采集量為52個,實際參與分析的數(shù)據(jù)量為48個。

圖 2　質(zhì)控(QC)樣品8次數(shù)據(jù)采集的一致性Fig. 2　Consistency of data from quality control (QC) 　　　sample acquired for eight times

圖 3　典型的(a)參照組樣品和(b)添加組樣品的總離子流圖Fig. 3　Typical total ion chromatograms from (a) 　　　reference sample and (b) spiked sample　Spiked: 50 μg/kg, based on the weight of infant formula.

2.3多變量統(tǒng)計分析

多變量統(tǒng)計分析是化學(xué)計量學(xué)方法處理數(shù)據(jù)的主要手段,其中SIMCA是基于主成分分析的一種監(jiān)督分類方法,它將新的樣本投射到一個特定的組別中成為其中的一員,并在該組別的特定主成分空間計算其歐氏距離(Euclidian distance),以此進(jìn)行分類判別[18,35]。在SIMCA中,正交偏最小二乘法-判別分析是在偏最小二乘法分析-判別分析(PLS-DA)的基礎(chǔ)上發(fā)展而來的,其核心概念是將X變量方向的系統(tǒng)變異分為2個部分,一個部分與Y變量線性相關(guān),一部分與Y變量正交即完全不相關(guān)。相比PLS-DA,該方法除顯示組間變異外,還可顯示組內(nèi)的變異,因而更有利于模型的解釋[35]。

除去4個被剔除的數(shù)據(jù)外,共48個數(shù)據(jù)經(jīng)MarkerViewTM軟件處理后,產(chǎn)生了由3 591個變量組成的數(shù)據(jù)集,這些變量均以“質(zhì)荷比_保留時間”的格式表示。在48個數(shù)據(jù)中,參照組數(shù)據(jù)共計34個,添加組數(shù)據(jù)14個。將此48個數(shù)據(jù)分為模型擬合數(shù)據(jù)集(又稱訓(xùn)練數(shù)據(jù)集)和模型驗證數(shù)據(jù)集(又稱預(yù)測數(shù)據(jù)集),其中33個隨機(jī)數(shù)據(jù)(約占總數(shù)據(jù)量的2/3,其中參照組24個、添加組9個)用作模型的擬合((訓(xùn)練數(shù)據(jù)集),剩余15個數(shù)據(jù)用作模型的驗證數(shù)據(jù)集(約占數(shù)據(jù)總量的1/3,其中參照組10個、添加組5個)。軟件使用訓(xùn)練數(shù)據(jù)集獲得OPLS-DA模型,然后再使用預(yù)測數(shù)據(jù)集對該模型進(jìn)行驗證,結(jié)果見圖4。

圖 4　OPLS-DA模型得分散點圖Fig. 4　Score scatter plot of OPLS-DA modelling　a. training set observations in reference group; b. predicting set observations in reference group; c. training set observations in spiked group; d. predicting set observations in spiked group.　OPLS-DA: orthogonal partial least squares-discriminant analysis.

該OPLS-DA模型相關(guān)參數(shù)如下:R2X(cum)=0.742,R2Y(cum)=0.997,Q2Y(cum)=0.905。R2X(cum)和R2Y(cum)表示使用模型所能解釋的與X與Y變量的變異比例,其值越接近1說明模型擬合得越好;Q2Y(cum)與R2Y(cum)相似,區(qū)別是其值是通過交叉驗證獲取的,其值越接近1代表模型預(yù)測能力越好。圖4中橢圓區(qū)域標(biāo)識了霍特林T2控制圖95%置信區(qū)間的范圍,所有數(shù)據(jù)均在此區(qū)域說明沒有異常值出現(xiàn)。OPLS-DA模型完成了良好的分組,參照組數(shù)據(jù)與添加組數(shù)據(jù)區(qū)分明顯,而且添加水平低至50 μg/kg的數(shù)據(jù)也能被有效區(qū)分;此外,所有驗證數(shù)據(jù)集中的數(shù)據(jù)使用該模型均得到了正確預(yù)測(驗證數(shù)據(jù)通過預(yù)測計算均聚集于各自相對應(yīng)的組別區(qū)域),預(yù)測正確率為100%,提示使用該模型可對含有化學(xué)危害物的乳粉樣品進(jìn)行有效預(yù)測,進(jìn)而實現(xiàn)樣品的篩查分析。另外,模型中橫軸方向表示導(dǎo)致分組的最大變異(組間變異),縱軸方向表示與分組無關(guān)的最大變異(組內(nèi)變異),由于參照組數(shù)據(jù)相對較多,其組內(nèi)變異高于數(shù)據(jù)量較少的添加組組內(nèi)變異(見圖4)。

2.4化學(xué)危害物的識別

在使用OPLS-DA模型對樣本組別進(jìn)行有效區(qū)分后,尋找區(qū)分參照組與添加組的變量就是識別潛在的化學(xué)危害物的過程。該過程主要使用OPLS-DA模型的S-Plot發(fā)現(xiàn)可靠的對組別區(qū)分有較大影響的變量。本研究OPLS-DA模型的S-Plot見圖5。

S-Plot的p[1]方向即橫坐標(biāo)軸方向表示每一個變量對組別區(qū)分的影響,值越靠近兩端對分組的貢獻(xiàn)越大;p(corr)[1]方向即縱坐標(biāo)軸方向表示組別區(qū)分變量的可靠性,其值介于-1～1之間,越靠近1或-1的變量其可靠性越好。因此,在S-Plot中,兩翼的頂部是需要重點關(guān)注的變量,也是代謝組學(xué)中生物標(biāo)示物(biomarker)的識別區(qū)域,在本研究中則是化學(xué)危害物的識別區(qū)域。圖5的右上區(qū)域是添加組區(qū)別于參照組的變量識別區(qū),在較高的p(corr)[1]值(0.7～1)區(qū)間又稱高置信區(qū)域,變量數(shù)量總計為22個,對此22個變量依據(jù)其精確相對分子質(zhì)量和保留時間信息導(dǎo)入儀器分析軟件MasterviewTM(SCIEX公司,版本1.1)進(jìn)行回溯分析,在合并重復(fù)變量(如加合離子、碎片離子、同位素離子等)和淘汰無效區(qū)分變量(如非規(guī)則峰導(dǎo)致的響應(yīng)差異)后,6種添加的化學(xué)危害物在此區(qū)域全部被正確識別(見圖5中三角形標(biāo)識的變量), 6種物質(zhì)被10個變量信息一一對應(yīng),相應(yīng)的具體識別信息見表2。在此需要強(qiáng)調(diào)的是,化學(xué)計量學(xué)方法處理結(jié)果和儀器分析軟件數(shù)據(jù)結(jié)果組合應(yīng)用方能有效挖掘數(shù)據(jù)信息,單獨偏重某一方都會影響數(shù)據(jù)信息挖掘的有效性。至此,通過S-Plot將3 591個變量數(shù)據(jù)縮減為22個待分析變量數(shù)據(jù),大大提高了數(shù)據(jù)分析效率和目標(biāo)性,也充分證明了高信息量液相色譜-質(zhì)譜數(shù)據(jù)組合化學(xué)計量學(xué)方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析對于信息挖掘的有效性。

圖 5　OPLA-DA模型的S-Plot圖Fig. 5　S-Plot corresponding to OPLS-DA analysis for the model built on reference samples and spiked samples

由表2可見,10個變量分別對應(yīng)于6種化合物的不同離子形態(tài),包括分子離子、加合或碎片離子及同位素離子等,如沙丁胺醇和螺旋霉素的分子脫水離子、雙氯西林的含37Cl同位素的分子離子以及醋酸甲地孕酮脫去醋酸根后的離子等。這些變量全部位于S-Plot的高置信區(qū)域(p(corr)[1]值均大于0.7)充分顯示了所建立的OPLS-DA模型的特異性。另外,被識別的離子質(zhì)量準(zhǔn)確度如表2所示,除螺旋霉素的質(zhì)量偏差稍超過5×10-6(5 ppm)以外,其余所有離子質(zhì)量偏差均小于5×10-6(5 ppm),說明整個分析期間儀器的質(zhì)量校準(zhǔn)軸是穩(wěn)定的。

表2　在OPLS-DA分析S-Plot中被識別的6種添加化合物

3結(jié)論

嬰幼兒配方乳粉作為嬰幼兒這一特殊群體的重要營養(yǎng)來源,其質(zhì)量安全公眾關(guān)注度極高。針對嬰幼兒配方乳粉中可能的化學(xué)危害物,使用非定向分析技術(shù)進(jìn)行篩查具有很高的應(yīng)用價值,有利于技術(shù)支撐從被動應(yīng)對到主動監(jiān)控的轉(zhuǎn)變。本文采用液相色譜-四極桿/飛行時間高分辨質(zhì)譜組合化學(xué)計量學(xué)方法,對嬰幼兒配方乳粉中采用人工添加模擬未知化學(xué)危害物進(jìn)行了快速篩查分析研究,實驗建立的高通量普適性前處理方法可有效提取6種代表性化合物,同時通過SIMCA-P軟件對比分析參照組和添加組的液相色譜-高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù),擬合構(gòu)建了靈敏度和特異性均較好的OPLS-DA模型,使用該模型可以有效區(qū)分參照組樣品和添加組樣品,可靠地識別模擬未知化學(xué)危害物而添加的6種代表性化合物。這一技術(shù)的建立是對非定向分析技術(shù)體系的有益探討,可為嬰幼兒配方乳粉質(zhì)量安全的主動分析監(jiān)控體系提供技術(shù)參考。

同時需要指出的是,盡管本文采用了15種乳粉來制備具有相對代表性的乳液基質(zhì),但實際檢測中依然會存在由于基質(zhì)組分差別而非化學(xué)危害物污染而帶來的模型識別方面的挑戰(zhàn)。進(jìn)一步的工作，如建立嬰幼兒配方乳粉基質(zhì)組分?jǐn)?shù)據(jù)庫，將是一個可實踐而且有效的方向。基質(zhì)組分?jǐn)?shù)據(jù)的積累在化學(xué)計量學(xué)方法處理中將有利于減少變量數(shù)據(jù)，以及有利于提高數(shù)據(jù)模型對基質(zhì)組分不同的乳粉判別的有效性。

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Chemometric approach based on liquid chromatography-quadrupole/time of flight high resolution massspectrometry to screen chemical hazards in infant formula

ZHANG Hongwei1*, XU Hui1, ZHANG Xiaomei1, BAO Lei2, WANG Fengmei1,CHEN Liangzhen3, LIANG Chengzhu1, WANG Yanting1, QIN Liangyong1

(1. Technical Center of Inspection and Quarantine, Shandong Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Qingdao 266002, China; 2. Nestlé Food Safety Institute, Beijing 100102, China;3. Qingdao Vland Biotech Group, Qingdao 266061, China)

Abstract:A chemometric model for screening chemical hazards in infant formula has been built based on liquid chromatography coupled to quadrupole/time of flight (Triple TOF?) mass spectrometry. Six chemicals, naming as salbutamol, lincomycin, sulfadiazine, spiramycin and megestrol acetate, were deliberately selected as the representatives of unknown chemical hazards to be spiked into infant formula. Fifteen different infant formula samples, with equal amount, were dissolved into water and mixed homogeneously to prepare test samples representing typical infant formula matrices. All test samples were divided into reference group (free from spiked chemicals) and spiked group. The test samples were extracted with acetonitrile, and then cleaned-up with Captiva NDLipidsfiltering solid phase extraction column. The liquid chromatographic separation was made on a CORTECSTMC18+column using mobile phases of 0.3%(v/v) formic acid-5%(v/v) water in acetonitrile and 0.3%(v/v) formic acid-5%(v/v) acetonitrile in water with gradient elution. Mass spectrometric analysis was conducted by a mixed acquisition mode of TOF full mass scan-information dependent acquisition (IDA)-product ion scan. Acquired data were exported to MarkerViewTMsoftware (version 1.2.1.1, SCIEX, USA) for peak finding, alignment and filtering. Then the preprocessed data were subject to SIMCA-P software (version 14.0, Umetrics AB, Sweden) for discriminant analysis. An orthogonal partial least squares-discriminant analysis (OPLS-DA) model was built with good fitness and good prediction ability (R2X(cum)=0.742, R2Y(cum)=0.997, Q2Y(cum)=0.905). The reference and spiked samples were well grouped and the six chemicals (spiking level down to 50 μg/kg, based on weight of infant formula) were reliably identified by S-Plot of OPLS-DA model. The technological system for monitoring quality and safety of infant formula could be benefited from the proposed approach.

Key words:liquid chromatography-high resolution mass spectrometry; chemometrics; orthogonal partial least squares-discriminant analysis (OPLS-DA)； chemical hazards; infant formula

DOI:10.3724/SP.J.1123.2015.11031

*收稿日期:2015-11-17

基金項目:國家質(zhì)檢總局科技項目(2013IK176,2014IK088);質(zhì)檢公益行業(yè)科研專項(201510036-01).

Foundation item:Scientific and Technological Project of the General Administration of Quality Supervision, Inspection and Quarantine of the People’s Republic of China (Nos. 2013IK176, 2014IK088); Scientific Research Project of Quality Inspection Service Industry (No. 201510036-01).

中圖分類號:O658

文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A

文章編號:1000-8713(2016)07-0665-08

出入境檢驗檢疫系統(tǒng)專欄(2016)·研究論文

*通訊聯(lián)系人.E-mail:light04@126.com.