曾三妹,　徐敦明,　魏一婷,　鐘莉萍

(廈門出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心, 福建 廈門 361026)

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全自動固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定食糖中的雌二醇

曾三妹,徐敦明*,魏一婷,鐘莉萍

(廈門出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心, 福建 廈門 361026)

摘要:建立了全自動固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質譜檢測食糖中雌二醇含量的方法。食糖樣品經水溶解后,用堿化乙腈提取,經HLB固相萃取柱凈化,采用高效液相色譜-串聯(lián)質譜分析,內標法定量。質譜分析采用電噴霧電離(ESI)負離子掃描,多反應監(jiān)測(MRM)模式。雌二醇定量離子對為271.1/144.8和271.1/183.2,內標D2-雌二醇定量離子對為273.2/147.0。實驗表明,經SPE柱凈化后基質效應明顯降低,樣品中添加0.5～10 μg/kg的雌二醇,其回收率為83.9%～95.1%,相對標準偏差(n=6)小于10%。雌二醇的檢出限為0.1 μg/kg,定量限為0.5 μg/kg。該方法提取效果好,具有良好的靈敏度、回收率和重復性。

關鍵詞:全自動固相萃取;高效液相色譜-串聯(lián)質譜;雌二醇;食糖

近幾年,我國食糖的品種越來越多樣化。目前市場上的紅糖產品主要有益母紅糖、產婦紅糖、生姜紅糖、大棗紅糖等營養(yǎng)糖,因其風味獨特且具有保健作用,深受特殊人群特別是女性和老年人的青睞。近日網絡、微信等流傳紅糖中非法添加雌二醇,且含量是正常人體內含量水平的幾百倍甚至上千倍[1]。雌二醇作為類固醇激素中活性較高的一種,具有促進性器官發(fā)育、排卵,以及促進第二性征發(fā)育等功能,大量使用會有皮膚狀態(tài)改善、新陳代謝加快的作用,讓人容光煥發(fā)[1]。但由于合成類固醇酷似人體內的激素,因此它可破壞正常的激素平衡,并由此產生一些副作用,例如導致男性女性化、喪失生育能力、腎臟損害、高血壓、動脈硬化、肝臟和心臟疾病以及癌癥[2]。

近年來,國內外食品分析工作者都十分關注激素的檢測技術,發(fā)展了一些檢出限更低、分辨率和靈敏度更高的測定方法。目前測定食品中激素殘留的方法主要有氣相色譜-質譜(GC-MS)法[3]、高效液相色譜(HPLC)法[4]和液相色譜-串聯(lián)質譜(LC-MS/MS)法[5-24]。GC-MS或HPLC分離可以提供待測物的特異性信息。然而,其衍生過程繁瑣、費時,增加了數據的不確定性,而且激素是高沸點、低揮發(fā)性的物質,一般不適宜采用氣相色譜法直接進行測定[6,23]。LC-MS/MS法可提供待測物的結構信息,具有較高的靈敏度和選擇性,因而是檢測激素殘留的理想方法。HPLC-MS/MS無需衍生步驟,可縮短分析時間,減少試劑成本。目前國內外文獻報道用液相色譜-質譜聯(lián)用方法檢測激素主要針對尿液[25]、血漿[7]、動物源性食品[8-15]、飼料[16]、污泥[17]、化妝品[18-20]及水[21-23],而以食糖樣品為分析對象的相關研究鮮有報道。

本文通過優(yōu)化樣品前處理及儀器分析條件,建立了食糖中雌二醇的HPLC-MS/MS測定方法。

1實驗部分

1.1儀器與試劑

API5500質譜儀(美國AB公司)配Agilent 1290液相色譜儀(美國安捷倫公司); Phenomenex Kinetex C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 2.6 μm)(美國菲羅門公司); HLB固相萃取柱(60 mg, 3 mL,美國Waters公司); Reeko Fotector-06自動固相萃取系統(tǒng)(銳科科技有限公司); IKA渦旋振蕩器(德國IKA公司);離心機(上海安亭科學儀器廠)。

雌二醇標準品(純度>95%,德國Dr. Ehrenstorfer公司),內標D2-雌二醇標準品(純度>92%,加拿大CDN公司)。甲醇、乙腈、乙酸乙酯(色譜純,Merck公司),其他試劑為分析純。實驗用水為去離子水。

標準溶液的配制:以甲醇為溶劑配制成1 mg/L的標準儲備液,保存于4 ℃下。實驗中根據需要進行稀釋配制。

樣品來自廈門市各大超市與廈門出入境檢驗檢疫局日常送檢樣品。

1.2樣品的前處理

稱取食糖樣品約2.0 g(精確至0.01 g)于50 mL具塞離心管中,添加100 μL 10 μg/L同位素內標,加入5 mL水溶解,溶解完全后再加入5 mL乙腈與0.5 mL 100 g/L Na2CO3,旋渦5 min,以4 000 r/min的轉速離心5 min,將乙腈層轉移至20 mL的試管中,用氮吹儀在40 ℃下濃縮近干。加入3 mL體積分數為20%的甲醇水溶液,渦旋溶解后,待凈化。凈化由Reeko Fotector-06自動固相萃取系統(tǒng)完成。全自動固相萃取操作參數及流程見表1。凈化后的殘渣用乙腈-水(1∶1, v/v)溶液定容至1.0 mL,旋渦溶解后,過0.2 μm微孔濾膜,供HPLC-MS/MS測定。

表1　全自動固相萃取儀操作參數

1.3色譜條件

流動相A: 5 mmol/L乙酸銨水溶液;流動相B:乙腈;柱溫:35 ℃;進樣量:10 μL;流速:0.3 mL/min。洗脫梯度:0～3.5 min,流動相A為70%;在3.6 min時流動相A變化至0,保持2.5 min;在6.1 min時,流動相A變化至70%,保持4 min。

1.4質譜條件

掃描方式:電噴霧電離(ESI)源負離子掃描;檢測方式:多反應監(jiān)測(MRM)模式;霧化氣壓力:4.137×105Pa;干燥氣壓力:4.137×105Pa;氣簾氣壓力:2.758×105Pa;離子源溫度:650 ℃;定量和定性離子、碰撞能量等參數見表2。

表2　雌二醇的質譜檢測參數

* Quantitative ion.

2結果與討論

2.1樣品前處理

在空白食糖中添加1 μg/kg的雌二醇后,用水溶解,采用不同的試劑(體積分數為80%的乙腈水溶液、體積分數為50%的乙腈水溶液和乙酸乙酯)對雌二醇進行提取試驗。通過比較發(fā)現,用體積分數為50%的乙腈水溶液提取食糖中雌二醇的回收率可以達到68%以上。

還比較了體積分數為50%的乙腈水溶液作提取劑時,中性條件(不加Na2CO3溶液)和不同的堿性條件(分別加入0.5 mL 100 g/L Na2CO3溶液、1 mL 100 g/L Na2CO3溶液)對回收率的影響。結果顯示,加入0.5 mL 100 g/L Na2CO3溶液堿性條件下的回收率較好,可達到87%以上。

以甲醇水溶液作為淋洗溶劑,能有效去除不保留和保留弱的雜質。對HLB固相萃取柱淋洗溶劑進行了優(yōu)化,分別以體積分數為40%、50%、60%、70%和80%的甲醇水溶液作為淋洗溶液,結果表明,當以體積分數為70%的甲醇水溶液淋洗時,雌二醇被洗出約2%左右,而以體積分數為60%的甲醇水溶液淋洗時,待分析物質均未被洗出,此時可以很好地去除雜質,因此最終選擇體積分數為60%的甲醇水溶液作為淋洗試劑。

2.2固相萃取凈化

2.2.1固相萃取技術

提取凈化技術如SPE、固相微萃取(SPME)、基質固相分散萃取(MSPDE)、微波輔助萃取(MAE)、超臨界流體萃取(SFE)等不斷應用于食品殘留的分析。當前,SPE技術在殘留分析中應用較為廣泛。HLB固相萃取柱填料是由親脂性的二乙烯基苯和親水性的N-乙烯基吡咯烷酮兩種單體按照特定比例聚合成的大孔共聚物,為反相色譜填料,通過二乙烯基苯和N-乙烯基吡咯烷酮來增加對極性物質的保留并提供很好的水浸潤性。HLB固相萃取柱與普通C18反相萃取柱相比,具有更好的穩(wěn)定性和廣泛的pH適用性,操作性能更加穩(wěn)定。因此,本文選用HLB固相萃取柱進行凈化。

圖 1　雌二醇及D2-雌二醇的母離子Q1掃描圖Fig. 1　Mass spectra of estradiol and D2-　　　estradiol with Q1 scan

2.2.2全自動固相萃取技術的應用

全自動固相萃取技術可以真正在無人值守的情況下完成固相萃取方法的應用,節(jié)約人工時間,同時能將實驗中的人為誤差降至最低,相對傳統(tǒng)的固相萃取技術具有操作方便、穩(wěn)定性強、環(huán)保等優(yōu)點。本實驗中全自動固相萃取的參數及流程見表1。

圖 2　雌二醇及D2-雌二醇碎片離子的二級質譜圖Fig. 2　MS/MS spectra of the product ions 　　　of estradiol and D2-estradiol

圖 3　雌二醇及D2-雌二醇(0.5 μg/kg)的MRM色譜圖Fig. 3　Chromatograms of estradiol and D2-estradiol 　　　(0.5 μg/kg) in MRM mode

2.3色譜-質譜分析

在電噴霧電離源負離子模式下對雌二醇、D2-雌二醇進行一級質譜全掃描,得到雌二醇、D2-雌二醇分子離子,即母離子(見圖1);對分析化合物的母離子進行二級質譜分析(子離子掃描),得到碎片離子信息,即子離子(見圖2)。按照二級質譜圖提供的子離子信息,選擇雌二醇的定量離子對(m/z271.1/144.8和271.1/183.2)和D2-雌二醇的定量離子對(m/z273.2/147.0);然后優(yōu)化雌二醇和D2-雌二醇二級質譜的錐孔電壓(DP)、碰撞氣能量(CE)等參數,使得母離子與子離子產生的離子對強度達到最大,得到分析物的二級質譜圖。雌二醇、D2-雌二醇的多反應監(jiān)測譜圖見圖3。

2.4標準曲線與線性范圍

用雌二醇標準溶液配制成質量濃度為0.1、0.5、1、10和50 μg/L的系列標準溶液。在本文所確定的實驗條件下,進樣10 μL,以目標化合物與內標化合物的濃度比為橫坐標、目標化合物與內標化合物的峰面積比為縱坐標繪制標準曲線,得到線性方程Y=4.61X+0.77,相關系數為0.999 8,表明目標化合物在質量濃度0.1～50 μg/L內有較好的線性關系,且無背景干擾。如檢測樣品中雌二醇質量濃度超過50 μg/L,可做相應稀釋后檢測。

2.5檢出限與定量限

檢出限(LOD)和定量限(LOQ)采用逐級稀釋空白加標樣品的方法來確定。以3倍信噪比(S/N=3)對應的目標化合物濃度作為檢出限,以S/N=10對應的目標化合物濃度作為定量限。使用本方法檢測雌二醇的LOD為0.1 μg/kg, LOQ為0.5 μg/kg。

2.6回收率與精密度

取不同基質空白食糖樣品2.0 g(精確到0.01 g)進行回收率試驗,每種基質添加濃度分別為0.5、1和10 μg/kg,每個濃度平行測定6次,按照本方法進行檢測。由圖4可知,目標化合物與基質雜質分離很好,不受基質雜質干擾?；厥章屎途芏冉Y果見表3。6種基質中雌二醇的回收率為83.9%～95.1%,相對標準偏差均小于10%。該方法的回收率和相對標準偏差均符合殘留檢測標準要求。

表3　不同基質中雌二醇的加標回收率和精密度(n=6)

2.7實際樣品檢測

按照本方法對市場上購買的86個食糖樣品進行了檢測,未檢測出雌二醇。

3結論

本文建立了全自動固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質譜法測定食糖中的雌二醇,用HLB固相萃取柱凈化,液相色譜-串聯(lián)質譜測定。利用建立的方法對實際樣品進行了分析。方法的靈敏度高、回收率良好、操作簡便、定量準確,能滿足日常食糖樣品中雌二醇含量的測定要求。

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Determination of estradiol in table sugar by auto-solid-phase extraction-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

ZENG Sanmei, XU Dunming*, WEI Yiting, ZHONG Liping

(Technical Center of Xiamen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Xiamen 361026, China)

Abstract:A high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) method was established for the determination of estradiol in table sugar. Sugar samples were dissolved in water, and extracted by alkaline acetonitrile, then cleaned-up using an HLB column. The resulting samples were detected under negative multiple reactions monitoring (MRM) mode, and quantified by the internal standard method. As the results showed, the matrix effects were depressed obviously after the purification. The limit of determination and the limit of quantification of the method were 0.1 μg/kg and 0.5 μg/kg, respectively. For all the tested samples, the average spiked recoveries ranged from 83.9% to 95.1%, and the relative standard deviations (RSDs, n=6) were lower than 10%. The method is quick, easy, effective, sensitive and accurate, and can meet the requirements of the determination of estradiol in table sugar.

Key words:auto-solid-phase extraction (auto-SPE); high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS); estradiol; table sugar

DOI:10.3724/SP.J.1123.2016.03011

*收稿日期:2016-03-08

基金項目:福建省自然科學基金項目(2014j01057).

Foundation item:Natural Science Foundation of Fujian Province (No. 2014j01057).

中圖分類號:O658

文獻標識碼:A

文章編號:1000-8713(2016)07-0703-05

出入境檢驗檢疫系統(tǒng)專欄(2016)·技術與應用

*通訊聯(lián)系人.E-mail:xudm@xmciq.gov.cn.