祝偉霞,　張　莉,　李　睢,　張　麗,　劉亞風(fēng),　楊冀州*

(1. 河南出入境檢驗檢疫局, 河南 鄭州 450003; 2. 河南中醫(yī)藥大學(xué), 河南 鄭州 450000)

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超高效液相色譜-多反應(yīng)選擇離子監(jiān)測同步在線全掃描質(zhì)譜技術(shù)測定保健品中的類安非他命和匹卡米隆

祝偉霞1,張莉1,李睢2,張麗1,劉亞風(fēng)1,楊冀州1*

(1. 河南出入境檢驗檢疫局, 河南 鄭州 450003; 2. 河南中醫(yī)藥大學(xué), 河南 鄭州 450000)

摘要:建立了超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)線性離子阱質(zhì)譜測定保健品中類安非他命(BMPEA)和匹卡米隆的分析方法。樣品采用甲醇超聲提取,新型反相固相萃取柱(PRiME HLB)凈化,采用甲醇-0.1%(v/v)甲酸水溶液作為流動相,SHISEIDO CAPCELL MG Ⅱ C18色譜柱分離BMPEA和匹卡米隆。在電噴霧離子源正離子電離模式下,聯(lián)合采用多反應(yīng)選擇離子監(jiān)測(MRM)、增強(qiáng)型子離子全掃描(EPI)和譜庫檢索技術(shù),實現(xiàn)了兩種分析物的定性分析和定量計算。在該實驗條件下,BMPEA和匹卡米隆在口服液、片劑和膠囊樣品中的檢出限(LOD)和定量限(LOQ)分別為0.2～0.5 μg/kg和0.5～2.0 μg/kg,加標(biāo)回收率為79.5%～103.8%, RSD為3.6%～15.4%,在0.2～200.0 μg/kg范圍內(nèi)基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的含量和峰面積呈良好線性關(guān)系(r≥0.9969)。該方法成功應(yīng)用于進(jìn)口和市售保健品的測定,分析結(jié)果表明該方法操作簡單、結(jié)果準(zhǔn)確,可用于保健品中BMPEA和匹卡米隆的確證分析。

關(guān)鍵詞:超高效液相色譜-三重四極桿線性離子阱質(zhì)譜;增強(qiáng)型子離子全掃描;固相萃取;類安非他命;匹卡米隆;保健品

2015年美國第一保健品牌健安喜(GNC)因涉嫌添加違禁成分匹卡米隆和類安非他命(β-methylphenethylamine, BMPEA)遭到司法部門的起訴。匹卡米隆(picamilon)是一種可迅速穿過血腦屏障、加速腦血流量,臨床上常用于治療焦慮、頭痛等心腦血管疾病的藥物[1]。中國、俄羅斯、日本等國家將匹卡米隆定義為處方藥,美國則將其列入違禁藥品目錄[2]。類安非他命為安非他命的甲基異構(gòu)體,屬苯丙胺類中樞興奮藥和抗抑郁類藥物,由于與安非他命具有相同的功效,許多國家將苯丙胺類藥物列為毒品[3],世界反興奮劑組織已將BMPEA列入禁用藥物的名單中[4]。目前有關(guān)BMPEA對人體安全健康的風(fēng)險評估數(shù)據(jù)十分有限,而我國新發(fā)布的保健品標(biāo)準(zhǔn)[5]未將任何西藥列為可添加藥物。保健食品中添加違禁化學(xué)物質(zhì),不僅危害消費者的身體健康[6],也違反了《中華人民共和國食品安全法》。因此,需要建立一種簡單、快速、準(zhǔn)確的對保健品中的類安非他命和匹卡米隆進(jìn)行分析的方法,為保健品的質(zhì)量安全提供可靠的技術(shù)保障。

目前主要采用液相色譜-紫外檢測器測定藥物中匹卡米隆的含量[1,2,7],液相色譜-質(zhì)譜法分析血液中的匹卡米隆[8,9]。苯丙胺類精神藥物的研究主要采用氣相色譜-質(zhì)譜[10,11]和液相色譜-質(zhì)譜[3,12]技術(shù)進(jìn)行測定。BMPEA作為一種新型化學(xué)合成藥物[13], 2014年Cholbiński等[4]報道了液相色譜-質(zhì)譜法測定尿液中BMPEA殘留的分析方法。目前有許多測定保健品中非法添加藥物的報道[14,15],但未見有關(guān)保健品中BMPEA和匹卡米隆的研究報道。本文采用多反應(yīng)選擇離子監(jiān)測(MRM)同步增強(qiáng)型子離子全掃描(EPI)確證技術(shù),建立了同時測定保健品中類安非他命和匹卡米隆的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的方法。

1實驗部分

1.1儀器和試劑

API 5500Q液相色譜-質(zhì)譜儀(配美國Waters公司ACQUITY UPLC超高效液相色譜儀和美國Applied Biosystems公司Q Trap線性離子阱質(zhì)譜); SA-31振蕩器(日本大和公司); CF15RXII離心機(jī)(日本Hitachi公司); 24位固相萃取裝置(德國CNW公司); N-EVAP112氮吹儀(美國Organomation Associates公司); Oasis HLB和PRiME HLB柱(3 mL/60 mg,美國Waters公司); C18柱(3 mL/500 mg,美國Supelco公司);正己烷、甲醇和甲酸(色譜純,美國Fisher公司); BMEPA和匹卡米隆(對照品,純度≥99%,日本TCI公司); 0.2 μm有機(jī)相濾膜(天津津騰公司);水為Millipore純水系統(tǒng)制得的高純水(電阻率≥18 MΩ5cm)。

1.2溶液的配制

分別稱取標(biāo)準(zhǔn)品10 mg于100 mL容量瓶中,用甲醇定容,得到質(zhì)量濃度為100 mg/L的單標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液,于-18 ℃冷凍保存,有效期3個月;取上述單標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液用甲醇-水(1∶1, v/v)稀釋成質(zhì)量濃度為1 mg/L的混合工作溶液,于2～4 ℃下儲存,有效期1個月;使用前將混合工作溶液用甲醇-0.1%(v/v)甲酸水溶液(1∶4, v/v)稀釋制成試劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液;按照操作方法所述制得空白樣品提取液,使用前將用其稀釋的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液制成合適濃度的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3儀器條件

液相色譜柱:SHISEIDO CAPCELL MGⅡC18(150 mm×2.1 mm, 5 μm);柱溫:35 ℃;流動相:甲醇(A)與0.1%(v/v)甲酸水溶液(B);梯度洗脫程序:0～3.5 min, 5%A; 3.5～5.5 min, 5%A～90%A; 5.5～7.5 min, 90%A～95%A; 7.5～7.6 min, 95%A～5%A; 7.6～11.0 min, 5%A。六通閥位置:0～1.0 min至廢液,1.0～6.0 min進(jìn)質(zhì)譜儀、6.0 min后至廢液。流速:0.3 mL/min;進(jìn)樣量:10 μL。

電噴霧離子源正離子電離模式(ESI+);掃描方式:MRM;霧化氣壓力:413.7 kPa;氣簾氣壓力;241.3 kPa;去溶劑氣壓力:379.2 kPa;碰撞氣壓力:69 kPa;噴霧電壓:4 500 V;去溶劑溫度:550 ℃;每個離子對駐留時間:100 ms;去簇電壓(DP): 35 V;每種化合物的檢測離子對、碰撞室出口電壓(CXP)、射入電壓(EP)、碰撞能量(CE)等質(zhì)譜參數(shù)見表1。線性離子阱在線全掃描條件:每次選擇3個最強(qiáng)峰,動態(tài)背景扣除,每10 s排除一次前級掃描過的離子,掃描強(qiáng)度閥值為3 500 cps, EPI掃描范圍為m/z50～250,在CE為25 eV下掃描,其他質(zhì)譜參數(shù)同MRM模式,采用標(biāo)準(zhǔn)溶液在上述MRM-EPI方法下獲得子離子掃描質(zhì)譜圖,并建立質(zhì)譜標(biāo)準(zhǔn)圖庫,供BMPEA和匹卡米隆定性檢索。

表1　類安非他命和匹卡米隆的質(zhì)譜參數(shù)

* Quantification ion.

1.4樣品前處理

稱取2.5 g試樣于50 mL具塞離心管中,加入25 mL甲醇超聲提取30 min(每隔10 min渦旋2 min)后,以4 000 r/min離心10 min。取5 mL樣液直接上載至PRiME HLB固相萃取柱,收集全部流出液于45 ℃氮氣流下濃縮至近干,加入1 mL甲醇-0.1%(v/v)甲酸水溶液(1∶4, v/v)溶解殘渣,經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后測定。

2結(jié)果與討論

2.1凈化方法的優(yōu)化

保健品中的BMPEA和匹卡米隆均屬添加藥物,與樣品基質(zhì)間的結(jié)合力弱,甲醇可完全萃取BMPEA和匹卡米隆。但保健品中存在大量的甲醇共萃取物,可干擾電噴霧離子源質(zhì)譜的電離。為考察甲醇提取液的基質(zhì)效應(yīng),將含量為10 μg/kg的試劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液與基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的峰面積進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)在口服液和片劑中分析物的基質(zhì)抑制效應(yīng)≤20.7%,在膠囊提取液中的基質(zhì)抑制效應(yīng)達(dá)74.6%。因此必須采用有效的凈化方法去除干擾物質(zhì)。

本方法考察了用正己烷萃取提取液的凈化效果。天然提取物類保健品中的BMPEA和匹卡米隆的響應(yīng)強(qiáng)度提高了3.4%～15.4%,以油為載體的保健品提高了約27%。同時考察了正己烷聯(lián)合C18、HLB和PRiME HLB固相萃取填料的凈化效果。分別采用C18和HLB柱時的回收率均為34.8%～102.7%,采用PRiME HLB柱時的回收率為57.4%～114.6%。PRiME HLB固相萃取柱是一種新型反相固相萃取吸附劑,可去除基質(zhì)中的蛋白質(zhì)、鹽、磷脂等干擾物,樣液通過篩板和固相萃取填料時不易堵塞。將未經(jīng)正己烷除脂的樣液直接上載至PRiME HLB柱,獲得與正己烷除脂后相同的回收率。本方法最終將樣液直接用PRiME HLB固相萃取柱凈化。

2.2定量方法的優(yōu)化

由于類安非他命和匹卡米隆存在基質(zhì)抑制效應(yīng),采用試劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液外標(biāo)曲線定量的準(zhǔn)確度較差,而目前沒有穩(wěn)定的商品化BMPEA和匹卡米隆的同位素標(biāo)準(zhǔn)品。Cholbiński等[4]在測定尿液中的BMPEA時,將安非他命作為內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行定量分析。但安非他命同樣是禁止添加至保健食品的化學(xué)合成藥,不適合作為保健品分析的內(nèi)標(biāo)物。為彌補(bǔ)基質(zhì)抑制效應(yīng),常采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行定量分析。鑒于保健品組成成分的唯一性,不同商家的保健樣品的基質(zhì)效應(yīng)差異很大。為保證準(zhǔn)確定量,本方法采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線和標(biāo)準(zhǔn)加入兩種方法聯(lián)合進(jìn)行定量。對于不含BMPEA和匹卡米隆的保健品,采用陰性基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行分析;對于含有類安非他命和匹卡米隆的保健品,添加不同水平的目標(biāo)物于樣品中,根據(jù)線性方程計算分析物的本底值,實現(xiàn)分析物的準(zhǔn)確定量。

2.3質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化

由于匹卡米隆和BMPEA的分子結(jié)構(gòu)中含弱堿性氮原子,在電噴霧正離子監(jiān)測模式下均可獲得較好的[M+H]+峰。分別以待測物的分子離子峰為母離子進(jìn)行子離子全掃描,兩種化合物均具有較少的特征子離子碎片,特征子離子裂解方式見圖1。選取豐度較強(qiáng)、干擾較小的兩個子離子作為定性與定量離子,優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)時發(fā)現(xiàn),DP電壓為35 V時兩種化合物的響應(yīng)達(dá)到最高,其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

圖 1　類安非他命和匹卡米隆的質(zhì)譜裂解方式Fig. 1　Fragmentation patterns of BMPEA 　　　and picamilon

2.4分析物的定性分析

在Q Trap實現(xiàn)MRM & EPI同時分析的過程中,質(zhì)譜首先根據(jù)待測物MRM進(jìn)行掃描。當(dāng)MRM色譜峰強(qiáng)度超過設(shè)定的閥值時,自動切換至EPI二級全掃描模式,采集子離子碎片圖。分析測定時將樣品中的二級碎片與標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行譜圖檢索,提高單一MRM模式下的定性準(zhǔn)確度。方法優(yōu)化了非動態(tài)排除干擾進(jìn)行掃描時的結(jié)果,表明該模式下質(zhì)譜掃描選擇性差;采用動態(tài)排除干擾后對3個最強(qiáng)峰進(jìn)行掃描,以3 500 cps作為信號閥值,每10 s進(jìn)行前級離子掃描,子離子掃描目標(biāo)性強(qiáng),BMPEA和匹卡米隆的含量在LOQ水平時均可獲得子離子掃描質(zhì)譜圖。膠囊保健品中添加LOQ水平BMPEA和匹卡米隆的色譜-質(zhì)譜圖如圖2所示。

圖 2　膠囊保健品中添加LOQ水平的類安非他命和匹卡米隆的總離子流色譜圖、離子對豐度比圖、MRM色譜圖和EPI質(zhì)譜圖Fig. 2　Total ion current chromatogram, ion abundance ratio figure, MRM chromatograms and EPI　　　mass spectra of BMPEA and picamilon spiked in capsule health products at LOQ levels

2.5檢出限、定量限、線性范圍、回收率和精密度

本方法的LOD(S/N≥3)和LOQ(S/N≥10)分別為0.2～0.5 μg/kg和0.5～2.0 μg/kg,在0.2～200.0 μg/kg范圍內(nèi)基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的含量(x, μg/kg)和峰面積(y)呈良好線性關(guān)系(r≥0.9969)(見表2)。

表2　類安非他命和匹卡米隆的檢出限、定量限、線性方程、相關(guān)系數(shù)(r)和線性范圍

y: peak area of analyte;x: concent of analyte, μg/kg.

在陰性口服液、膠囊、片劑樣品中分別添加1、2、4倍LOQ 的3個水平的試劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,每個水平平行測定10次,基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液定量,平均回收率為79.5%～103.8%, RSD為3.6%～15.4%(見表3)。

表3　陰性口服液、膠囊、片劑樣品中的平均

2.6實際樣品測定

采用本研究建立的方法對148份進(jìn)口和25份市售保健品進(jìn)行檢測,結(jié)果經(jīng)MRM同步EPI質(zhì)譜法確證。結(jié)果表明所有保健品中均未檢出BMPEA和匹卡米隆。

3結(jié)論

本研究建立了超高效液相色譜-三重四極桿線性離子阱質(zhì)譜測定保健品中類安非他命和匹卡米隆的方法,并聯(lián)合MRM-EPI技術(shù)進(jìn)行定性。該方法簡單可靠,可用于分析復(fù)雜基質(zhì)中的BMPEA和匹卡米隆,為保健品中違禁藥物的監(jiān)督提供了可靠的技術(shù)支持。

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Determination of β-methylphenethylamine and picamilon in health products by ultra performance liquid chromatography-multiple reaction monitoring and online full scan mass spectrometry

ZHU Weixia1, ZHANG Li1, LI Sui2, ZHANG Li1, LIU Yafeng1, YANG Jizhou1*

(1. Henan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Zhengzhou 450003, China;2. Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450000, China)

Abstract:A confirmative method was developed for determining β-methylphenethylamine (BMPEA) and picamilon in health products by ultra performance liquid chromatography-triple quadrupole linear ion trap mass spectrometry (UPLC-Q Trap MS). The sample was ultrasonically extracted with methanol. The purification was carried out on a new reversed phase solid-phase extraction column (PRiME HLB). The detection of compounds was in the positive mode. Multiple technologies were applied to solve the identification and quantification for the two compounds, such as multiple reaction monitoring (MRM), online enhanced product ion full scan (EPI) and library search. Methanol and 0.1% (v/v) formic acid aqueous solution were used as the mobile phases with gradient elution. A SHISEIDO CAPCELL MG Ⅱ C18column was used to separate the analytes. The LODs and LOQs for BMPEA and picamilon in liquid, table and capsule samples were 0. 2-0.5 μg/kg and 0.5-2.0 μg/kg, respectively. The average spiked recoveries of the method varied from 79.5% to 103.8% and the RSDs were between 3.6% and 15.4%. In the range of 0.2-200.0 μg/kg, the peak areas and concentrations of matrix standard solution showed good linear relationship (r≥0.9969). The qualitative confirmation results were required based on the search-match MRM and EPI mass spectra simultaneously. The method is simple and accurate for the determination of BMPEA and picamilon in imported and commercial health products.

Key words:ultra performance liquid chromatography-triple quadrupole linear ion trap mass spectrometry (UPLC-Q Trap MS); enhanced product ion full scan (EPI); solid-phase extraction (SPE); β-methylphenethylamine (BMPEA); picamilon; health products

DOI:10.3724/SP.J.1123.2016.03029

*收稿日期:2016-03-22

基金項目:國家質(zhì)檢總局科技計劃項目(2015IK115);河南省科技攻關(guān)項目(122102110167,122102210393).

Foundation item:General Administration of Quality Supervision, Inspection and Quarantine of the People’s Scientific and Technological Projects (No. 2015IK115); Henan Province Key Scientific and Technological Projects (Nos. 122102110167, 122102210393).

中圖分類號:O658

文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A

文章編號:1000-8713(2016)07-0681-05

出入境檢驗檢疫系統(tǒng)專欄(2016)·研究論文

*通訊聯(lián)系人.Tel:(0371)55196533,E-mail:jizhouyang@163.com.