吳甜甜，柴立民，楊穎溪，高偉華，朱紫亨，徐　昉，余佳駿，韋　翊，李　雪，晏　軍

(北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700)

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論著

補腎益肺消癥方干預(yù)肺纖維化大鼠JNK凋亡信號通路關(guān)鍵分子的表達調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的作用機制

吳甜甜，柴立民，楊穎溪，高偉華，朱紫亨，徐昉，余佳駿，韋翊，李雪，晏軍

(北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700)

[摘要]目的探討補腎益肺消癥方干預(yù)肺纖維化大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和JNK細胞凋亡信號通路的作用機制。方法將SD大鼠隨機分為空白組、模型組、陽性藥物組、中藥預(yù)防組、中藥治療組、中藥防治組，除空白組外，其他組均以博萊霉素致大鼠肺纖維化模型。中藥預(yù)防組及中藥防治組造模1 d后開始給予補腎益肺消癥方12.68 g/(kg·d)灌胃，空白組和模型組予等量生理鹽水灌胃。造模28 d后確定造模是否成功，并處死中藥預(yù)防組大鼠，觀察預(yù)防性給藥對IPF的影響；造模成功后，陽性藥物組給予吡非尼酮53.57 mg/(kg·d)灌胃，中藥治療組及中藥防治組給予補腎益肺消癥方12.68 g/(kg·d)灌胃，空白組和模型組仍給予等量生理鹽水灌胃，持續(xù)28 d。HE染色觀察各組大鼠肺組織病理變化，real-time PCR及Western-blot檢測肺組織中JNK信號通路相關(guān)因子GRP78、IRE1α、p-JNK、TRAF2基因表達及蛋白含量的差異。結(jié)果肺組織切片HE染色顯示，陽性藥物組、中藥預(yù)防組及中藥治療組肺泡輕度破壞，成纖維細胞有一定程度增生；中藥防治組肺泡結(jié)構(gòu)完整，有少量成纖維細胞增生，較模型組纖維化程度明顯改善；模型組肺組織中GRP78、IRE1α、p-JNK、TRAF2基因表達拷貝數(shù)比值及蛋白含量均明顯高于空白組(P均<0.05)；中藥治療組和中藥防治組GRP78基因表達拷貝數(shù)比值及蛋白含量和TRAF2基因表達拷貝數(shù)比值均明顯低于模型組(P均<0.05)，陽性藥物組和中藥防治組IRE1α基因表達拷貝數(shù)比值均明顯低于模型組(P均<0.05)，陽性藥物組、中藥預(yù)防組、中藥治療組和中藥防治組IRE1α蛋白含量均明顯低于模型組(P均<0.05)，中藥防治組p-JNK蛋白含量明顯低于模型組(P<0.05)。結(jié)論通過下調(diào)GRP78、IRE1α、p-JNK、TRAF2的水平，調(diào)控JNK信號通路，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，減少細胞凋亡是補腎益肺消癥方延緩肺纖維化的作用機制之一。

[關(guān)鍵詞]補腎益肺消癥方；肺纖維化；大鼠；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；JNK細胞凋亡信號通路

特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是一種原因不明的、進行性的、局限于肺部的以纖維化伴蜂窩狀改變?yōu)樘卣鞯募膊?，病理上呈現(xiàn)特發(fā)性間質(zhì)性肺炎(usual interstitial pneumonia,UIP)的組織學(xué)征象，肺功能顯示限制性通氣功能障礙和/或換氣障礙，HRCT掃描可見周圍性分布及兩肺底顯著的粗大網(wǎng)織樣改變伴蜂窩肺形成。IPF發(fā)病率呈逐漸上升的趨勢，其生存期中位數(shù)2.9年，5年生存率<50%，幾乎與惡性腫瘤無異[1]。目前，該病病因不明，缺乏有效的治療手段。補腎益肺消癥方是基于中醫(yī)學(xué)“金水相生”理論，以補肺益腎、消癥通絡(luò)為治療法則而創(chuàng)制，在臨床上用于治療IPF療效較好。本實驗以博萊霉素致大鼠IPF為動物模型,觀察了補腎益肺消癥方對IPF大鼠肺組織病理改變以及JNK細胞凋亡信號通路相關(guān)因子基因表達和蛋白含量的影響，旨在探討補腎益肺消癥方的作用機制。

1實驗資料

1.1動物及分組清潔級雄性SD大鼠120只,體質(zhì)量180～200 g,動物合格證號：11400700045968。隨機分為空白組、模型組、陽性藥物組、中藥預(yù)防組、中藥治療組、中藥防治組，每組20只。

1.2藥物及試劑鹽酸博來霉素(15 mg/片)購自日本化藥株式會社；吡非尼酮膠囊(100 mg/粒)購自北京康蒂尼藥業(yè)有限公司；補腎益肺消癥方由當(dāng)歸、熟地、陳皮、法半夏、浙貝母、水蛭、連翹、炙甘草組成，各味中藥均為免煎顆粒，由東直門醫(yī)院藥劑科提供；SYBR green PCR master mix購自美國ABI生物公司，Rat-β-actin-antibody、Rat-GRP78-antibody、Rat-IRE1α-antibody、Rat-PERK-antibody、Rat-p-JNK-antibody、Rat-TRAF2-antibody購自Santa CRUZ生物公司，HRP標(biāo)記兔抗羊IgG二抗購自武漢博士德生物科技公司。

1.3模型制作及藥物干預(yù)3.25%水合氯醛麻醉大鼠，經(jīng)氣管插管，除空白組以外，其他各組大鼠按5 mg/kg緩慢注入博萊霉素，藥物注入后，立即將動物直立并不斷旋轉(zhuǎn)，使藥物均勻分布于肺內(nèi)，空白組經(jīng)氣管注入等量0.9%氯化鈉溶液。中藥預(yù)防組及中藥防治組造模1 d后開始給予補腎益肺消癥方12.68 g/(kg·d)灌胃，空白組和模型組予等量生理鹽水灌胃。待造模28 d后，處死1～2只模型組大鼠，組織病理切片，HE染色，觀察肺組織纖維化程度，確定造模是否成功，并處死中藥預(yù)防組大鼠，觀察預(yù)防性給藥對IPF的影響；造模成功后，陽性藥物組給予吡非尼酮53.57 mg/(kg·d)灌胃，中藥治療組及中藥防治組給予補腎益肺消癥方12.68 g/(kg·d)灌胃，空白組和模型組仍給予等量生理鹽水灌胃，持續(xù)28 d。

1.4觀察指標(biāo)

1.4.1肺組織病理表現(xiàn)取部分病變肺組織，4%多聚甲醛常溫固定過夜，常規(guī)乙醇梯度脫水，石蠟包埋，將包埋好的蠟塊切成5 μm厚薄片，用二甲苯脫去切片中的石蠟，乙醇梯度脫水，然后加入蒸餾水，將切片放入蘇木精水溶液中染色數(shù)分鐘，流水沖洗1 h后入蒸餾水片刻，加入乙醇伊紅染色液染色2～3 min，染色后的切片經(jīng)純乙醇脫水，再經(jīng)二甲苯使切片透明，將已透明的切片滴上樹膠，蓋上蓋玻片封固，光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織病理變化，并拍照分析。

1.4.2肺組織中JNK信號通路相關(guān)因子GRP78、IRE1α、p-JNK、TRAF2基因表達情況取100 mg病變肺組織，Trizol一步法提取Total RNA，RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄成cRNA，設(shè)計特異性引物，以GAPDH為內(nèi)對照設(shè)定相對標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)Ct值差異，real-time PCR檢測GAPDH和GRP78、IRE1α、p-JNK、TRAF2基因的相對拷貝數(shù)，根據(jù)GAPDH拷貝數(shù)與GRP78、IRE1α、p-JNK、TRAF2拷貝數(shù)的比值，檢測GRP78、IRE1α、p-JNK、TRAF2基因表達量的差異。PCR引物序列：CAPDH Forward為5’-CCATGGAGAAGGCTGGG-3’,Reverse為5’-CAAAGTTGTCATGGATGACC-3’；GRP78 Forward為5’-CCACCAGGATGCAGACATTG-3’,Reverse為5’-AGGGCCTCCACTTCCATAGA-3’；IRE1 Forward為5’-AAGTTTTGGAAGAGCCAGCA-3’,Reverse為5’-TGTTCTTGCCTCCAAGTGTG-3’；TRAF2 Forward為5’-GCCAGATTTTGGAGCAGAAG-3’,Reverse為5’-TGCTGCACCTTGTTGCTTAG-3’；JNK Forward為5’-CGGAACACCTTGTCCTGAAT-3’,Reverse為5’-TCGCCTGACTGGCTTTAAGT-3’。

1.4.3肺組織中JNK信號通路相關(guān)因子GRP78、IRE1α、p-JNK、TRAF2蛋白表達情況采用Western-blot法檢測。變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離總蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)膜后，脫脂奶粉封閉，Rat-β-actin-antibody、Rat-GRP78-antibody 、Rat-IRE1α-antibody 、Rat-p-JNK-antibody 、Rat-TRAF2-antibody 4℃孵育過夜，二抗室溫孵育2 h，加入化學(xué)發(fā)光底物，暗室顯影。以β-actin為參照，根據(jù)條帶灰度比，分析GRP78、IRE1α、p-JNK、TRAF2蛋白含量的差異。每組選取4個不同的樣本重復(fù)上述實驗。

2結(jié)果

2.1各組肺組織病理表現(xiàn)空白組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常；模型組大鼠肺組織肺泡結(jié)構(gòu)破壞，纖維化伴蜂窩肺形成、瘢痕性成纖維化病灶、斑片狀分布、侵犯邊緣性腺泡或小葉為主；陽性藥物組、中藥預(yù)防組及中藥治療組肺泡輕度破壞，成纖維細胞有一定程度增生；中藥防治組肺泡結(jié)構(gòu)完整，有少量成纖維細胞增生，較模型組纖維化程度明顯改善。見圖1～6。

圖1　空白組大鼠肺組織HE染色表現(xiàn)(×100)

圖2　模型組大鼠肺組織HE染色表現(xiàn)(×100)

圖3　陽性藥物組大鼠肺組織HE染色表現(xiàn)(×100)

圖4　中藥預(yù)防組大鼠肺組織HE染色表現(xiàn)(×100)

圖5　中藥治療組大鼠肺組織HE染色表現(xiàn)(×100)

圖6　中藥防治組大鼠肺組織HE染色表現(xiàn)(×100)

2.2各組肺組織中GRP78、IRE1α、p-JNK、TRAF2基因表達情況模型組肺組織中GRP78、IRE1α、p-JNK、TRAF2基因表達拷貝數(shù)比值均明顯高于空白組(P均<0.05)；中藥治療組和中藥防治組GRP78、TRAF2基因表達拷貝數(shù)比值均明顯低于模型組(P均<0.05)，陽性藥物組和中藥防治組IRE1α基因表達拷貝數(shù)比值均明顯低于模型組(P均<0.05)。見表1。

表1　各組肺組織中GRP78、IRE1α、p-JNK、

注：①與空白組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

2.3各組肺組織中GRP78、IRE1α、p-JNK、TRAF2蛋白含量比較模型組肺組織中GRP78、IRE1α、p-JNK、TRAF2蛋白含量均明顯高于空白組(P均<0.05)；中藥治療組和中藥防治組GRP78蛋白含量均明顯低于模型組(P均<0.05)，陽性藥物組、中藥預(yù)防組、中藥治療組和中藥防治組IRE1α蛋白含量均明顯低于模型組(P均<0.05)；中藥防治組p-JNK蛋白含量明顯低于模型組(P<0.05)。見表2。

3討論

IPF發(fā)病機制不完全清楚，目前研究認為炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的Ⅱ型肺泡上皮細胞持續(xù)性損傷，誘發(fā)肺泡組織的修復(fù)和瘢痕形成，連續(xù)不減弱的瘢痕形成導(dǎo)致肺組織纖維化病理改變的發(fā)生。慢性損傷導(dǎo)致Ⅱ型肺泡上皮細胞的凋亡是IPF形成的關(guān)鍵因素，這一觀點已經(jīng)引起了廣泛認可和重視。最新研究表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress, ERS)是導(dǎo)致Ⅱ型肺泡上皮細胞損傷、誘導(dǎo)細胞凋亡的關(guān)鍵分子機制,而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是蛋白分泌、折疊、成熟，鈣儲存以及脂質(zhì)合成的重要場所[2]。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)折疊成原始的構(gòu)象，經(jīng)過修飾最終成為具有活性的功能性蛋白質(zhì)[3]。一旦聚集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的未折疊或錯折疊蛋白超過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的負荷能力，將會引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)平衡失調(diào)，從而導(dǎo)致ERS[4]。ERS需3種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白即蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase R like endoplasmic reticulum kinase，PERK)、肌醇需求酶1(inositol-requiring enzyme 1，IRE1)和活化轉(zhuǎn)錄因子6(activating transcription factor 6，ATF6)介導(dǎo)[5]。正常情況下這3種蛋白都與免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白GRP78結(jié)合而處于無活性狀態(tài)。ERS發(fā)生時，GRE78即與這3種蛋白解離，因此，GRE78的急速上調(diào)被認為是ERS最敏感的指標(biāo)[6]。IRE1是ERS的傳感器，它可以將內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激信號傳遞給細胞質(zhì)和細胞核[7]?；罨腎RE1與TRAF2結(jié)合，形成IRE1-TRAF2復(fù)合物，并結(jié)合凋亡信號調(diào)節(jié)激酶(TNF-dependent apoptosis-signaling kinase 1，ASK1)激活JNK通路。ASK1在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘發(fā)細胞凋亡中起重要作用，它可以向下游分子傳遞多種應(yīng)激信號[8]。JNK是一種絲裂原活化蛋白激酶，它可以調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因bcl-2，甚至直接激活bcl家族中bax基因促進凋亡[9-10]?；罨腎RE1-TRAF2-ASK1復(fù)合物會引起JNK磷酸化和激活炎性細胞因子，其隨后引起的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致細胞損傷和凋亡[7]。

表2　各組肺組織中GRP78、IRE1α、p-JNK、

注：①與空白組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

IPF在中醫(yī)學(xué)的病名尚缺乏統(tǒng)一認識，通常將本病歸“肺痿”或“肺痹”范疇，通過病證結(jié)合分析，IPF應(yīng)屬于“肺絡(luò)微型癥瘕”范疇[11]。“肺為嬌臟”，外邪入侵，首先犯肺，致使肺臟氣機不利，宣發(fā)肅降失常，病變?nèi)站?，邪毒入血入絡(luò)，氣血運行不暢，痰瘀互結(jié)，形成癥瘕，“久病多虛”，肺病日久，耗傷津血，日久導(dǎo)致腎臟虛損。“久病當(dāng)以緩攻，不致重損”，故治當(dāng)標(biāo)本兼治，消補兼施，寓消于補，調(diào)暢氣血，虛復(fù)痰消，瘀除毒解，而肺絡(luò)癥消瘕復(fù)。補腎益肺消癥以補益肺腎、祛瘀化痰解毒為法，以經(jīng)典名方金水六君煎為基本方化裁而成，方中當(dāng)歸、熟地滋陰養(yǎng)血，陳皮、半夏理氣化痰，浙貝母化痰散結(jié)，水蛭解毒、軟堅散結(jié)，連翹解毒散結(jié)，諸藥合用，全方共奏補虛祛瘀、消痰解毒之功。

本實驗結(jié)果顯示，補腎益肺消癥方可以減輕肺泡結(jié)構(gòu)破壞，減少成纖維細胞增生，延緩肺間質(zhì)纖維化；中藥治療組和中藥防治組GRP78基因表達拷貝數(shù)比值及蛋白含量和TRAF2基因表達拷貝數(shù)比值均明顯低于模型組，陽性藥物組和中藥防治組IRE1α基因表達拷貝數(shù)比值均明顯低于模型組，陽性藥物組、中藥預(yù)防組、中藥治療組和中藥防治組IRE1α蛋白含量均明顯低于模型組，中藥防治組p-JNK蛋白含量明顯低于模型組，尤以中藥防治組效果最明顯。由此筆者認為補腎益肺消癥方通過下調(diào)JNK信號傳導(dǎo)通路關(guān)鍵因子的基因表達及蛋白含量，減輕ERS，減少Ⅱ型肺泡上皮細胞損傷和凋亡，抑制纖維增生及瘢痕形成，延緩肺間質(zhì)纖維化進程，達到治療效果。

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Functional mechanism of prescription of Bushen Yifei Xiaozheng on the intervention of apoptosis JNK signaling pathway molecule expression to control mechanism of endoplasmic reticulum stress in pulmonary fibrosis rats

WU Tiantian，CHAI Limin，YANG Yingxi，GAO Weihua，ZHU Ziheng，XU Fang，YU Jiajun，WEI Yi，LI Xue，YAN Jun

(Dongzhimen Hospital，Beijing University of Traditional Chinese Medicine，Beijing 100700，China)

Abstract：Objective It is to explore functional mechanism of prescription of Bushen Yifei Xiaozheng decoction (BYXD)on the intervention of endoplasmic reticulum stress and signal pathway JNK in pulmonary fibrosis rats. Methods SD rats were randomly divided into control group, model group, positive drug group, traditional Chinese medicine prevention group,traditional Chinese medicine treatment group,traditional Chinese medicine prevention and treatment group，all the rats except in blank group were made into models by Bleomycin. The prevention group and prevention-treatment group were treated with BYXD 12.68 g/(kg·d) in 1 day after establishing, blank group and control group with normal saline. In 28 days after establishing, the rats in prevention group were killed to observe the effect on IPF, the positive group was treated with pirfenidone 53.57 mg/(kg·d), the treatment group and prevention-treatment group were treated with BYXD, blank group and model group were given normal saline. All the groups were treated for 28 days. Pathological changes in lung tissue was observed by HE staining, by real-time PCR and western-blot were used to detect lung tissue JNK signaling pathway related factors GRP78,IRE1α, p-JNK, TRAF2 gene expression changes and differences in protein content. Results HE staining of lung tissue sections: positive drug group, a group of Chinese medicine prevention and Chinese medicine treatment group with mild alveolar damage, there was a certain degree of fibroblast proliferation, a complete alveolar structure, a small amount of fibroblast proliferation was found in prevention-treatment group, compared with the model group;prescription of bushenyifeixiaozheng only significantly reduced GRP78, IRE1α,p-JNK, TRAF2 gene expression and protein content. Conclusion By down GRP78, IRE1α, p-JNK, TRAF2 level, the regulation of JNK signaling pathway, reducing the endoplasmic reticulum stress,it can reduce apoptosis and delay pulmonary fibrosis,which may be one of the mechanisms of prescription of bushenyifeixiaozheng.

Key words:prescription of bushenyifeixiaozheng；pulmonary fibrosis rats；endoplasmic reticulum stress；signal pathway JNK；the expression of gene and protein

[作者簡介]吳甜甜，女，在讀研究生，研究方向為中醫(yī)藥防治肺間質(zhì)纖維化。 [通信作者]晏軍，E-mail:dzmyyyj@126.com

[基金項目]國家自然科學(xué)基金資助項目(81373589)

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.19.001

[中圖分類號]R-332

[文獻標(biāo)識碼]A

[文章編號]1008-8849(2016)19-2053-04

[收稿日期]2016-03-08