付文君， 魏江平， 任香怡， 陳 歡， 付 昆， 羅曉紅， 徐世軍*（1.四川省中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，四川成都611137；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川成都611137）

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［科研報(bào)道］

益胃湯對EM s模型大鼠異位子宮內(nèi)膜Notch1、Delta1和Jagged1表達(dá)的影響

付文君1，2， 魏江平1，2， 任香怡1，2， 陳 歡1，2， 付 昆1，2， 羅曉紅2*， 徐世軍1，2*
（1.四川省中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，四川成都611137；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川成都611137）

目的 考察益胃湯對自體移植子宮內(nèi)膜異位癥（EMs）大鼠異位內(nèi)膜Notch1、De1ta1及Jagged1表達(dá)的影響，為其干預(yù)EMs提供依據(jù)。方法 建立SD大鼠自體移植EMs模型，將造模成功的大鼠隨機(jī)分成模型對照組，丹那唑組（0.20 g/kg），益胃湯高 （27.00 g/kg）、中 （13.50 g/kg）、低劑量 （6.75 g/kg）組，藥物連續(xù)干預(yù)4周后，測量異位子宮內(nèi)膜體積，并采用Western b1ot法檢測各組動物子宮內(nèi)膜中NOTCH1蛋白表達(dá)；采用免疫組化法檢測各組大鼠內(nèi)膜DELTA1及JAGGED1蛋白表達(dá)。結(jié)果 與模型對照組比較，益胃湯給藥后，EMs模型大鼠異位子宮內(nèi)膜體積顯著縮?。≒＜0.01），益胃湯高劑量大鼠異位內(nèi)膜中NOTCH1相對表達(dá)量和DELTAL1平均光密度顯著減少 （P＜0.01）；益胃湯高、中劑量組中JAGGED1平均光密度明顯降低 （P＜0.05）。結(jié)論 益胃湯改善EMs與降低異位子宮內(nèi)膜Notch1、De1ta1和Jagged1的表達(dá)有關(guān)。

益胃湯；子宮內(nèi)膜異位癥；Notch1；De1ta1；Jagged1

子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis，EMs）是一種異位子宮內(nèi)膜含腺體和間質(zhì)的雌激素依賴型慢性婦科疾病，其病變主要因涉及免疫細(xì)胞免疫學(xué)異常等［1-2］，而被認(rèn)為是自身免疫類疾病。大量研究也表明EMs患者腹腔液及EMs模型動物外周血中輔助性T細(xì)胞 （Th細(xì)胞）及其分泌的細(xì)胞因子異常［3-4］。而Th細(xì)胞的分化與Notch信號密切相關(guān)，其中Notch1受體及Notch配體De1ta1和Jagged1在免疫細(xì)胞和上皮細(xì)胞［5-8］的分化過程中具有重要作用，因此這三者可能在EMs病變過程中扮演重要角色。課題組前期已證明益胃湯具有改善EMs模型大鼠病變作用，且其干預(yù)作用可能與調(diào)節(jié)免疫有關(guān)［9-11］，但它是否通過調(diào)節(jié)Notch1、De1ta11和Jagged1的表達(dá)而干預(yù)EMs還不清楚且也尚無相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，因此本實(shí)驗(yàn)擬通過檢測益胃湯干預(yù)后的EMs模型大鼠異位子宮內(nèi)膜Notch1、De1ta1和Jagged1的表達(dá)，探索其改善EMs的潛在作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)藥物 益胃湯［8］組成及用量均采用上海中醫(yī)藥大學(xué)1982年版 《中醫(yī)方劑與臨床》，成人日用量為81 g，則成人 （以60 kg體質(zhì)量計(jì)算）用量的10倍劑量為大鼠給藥的中劑量。沙參、麥冬、生地、玉竹均購于成都福利大藥房，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室馬云桐博士鑒定為藥典品種。上述4味藥均加入8倍量水，武火煎煮至沸騰后改文火煎30 min，取汁，加入冰糖，濃縮至2.7 g/mL的水煎液，4℃保存?zhèn)溆?。丹那唑膠囊，批號：20140402（江蘇聯(lián)環(huán)藥業(yè)股份有限公司）；乙烯雌酚 （標(biāo)準(zhǔn)品）（大連美侖生物技術(shù)有限公司）。

1.2實(shí)驗(yàn)動物 SPF級SD大鼠，雌性，體質(zhì)量180～220 g，成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動物有限公司，動物合格證號：SCXK（川）2013-24。實(shí)驗(yàn)場地為國家中醫(yī)藥管理局成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥藥理三級實(shí)驗(yàn)室，編號：TCM2032043。大鼠均在室溫22～24℃，明暗周期12 h/12 h條件下，自由飲水?dāng)z食。

1.3試劑 NOTCH1抗體，兔多克隆抗體（一抗），批號ab33932（英國Abcam—艾博抗 ［上海］貿(mào)易有限公司）；DELTA1抗體和JAGGED1抗體（一抗），批號分別為bs-7345R和bs-1448R（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；生物素化山羊抗兔IgG（H+L）（二抗），批號13152A11（北京中衫金橋生物有限公司）等。

1.4儀器 PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀（常州市中威醫(yī)療儀器有限公司）；BA200Digita數(shù)碼三目攝像顯微攝像系統(tǒng)（麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司）；Image-Pro P1us 6.0（美國Media Cybernetics）圖像分析系統(tǒng)；UV Transi11uminator化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀、ChemiDoc XRS+Systems凝膠掃描成像儀、Image Lab凝膠分析系統(tǒng)均為美國BIO-RAD公司產(chǎn)品。

1.5方法

1.5.1造模、分組及給藥 參照文獻(xiàn) ［9］方法稍加改善進(jìn)行 EMs動物造模，即每只大鼠以乙烯雌酚溶液（0.02mg/kg）連續(xù)灌胃3 d后，采用水合氯醛溶液（3.2mg/kg）麻醉，固定，備皮后常規(guī)消毒，開腹，游離右側(cè)子宮，距子宮卵巢1～2 cm處一次性結(jié)扎一段子宮，游離子宮段并立即置于盛有生理鹽水的培養(yǎng)皿中，沿系膜部剪開切成5mm×5 mm的子宮片段。將其平整放置于腹肌與皮下筋膜層之間開鑿的隧道中，內(nèi)膜面緊貼腹肌，用細(xì)線連同筋膜層和內(nèi)膜固定兩角于腹肌上，避免內(nèi)膜卷曲。逐層縫合關(guān)腹，縫合處1 mL注射器滴加4～5滴慶大霉素注射液并肌注 （1mL/kg）防止感染。術(shù)后第2天開始灌服上述乙烯雌酚溶液促進(jìn)移植內(nèi)膜生長并繼續(xù)肌注慶大霉素注射液，兩者均1次/d，連續(xù)3 d。假手術(shù)組大鼠開腹后再相同位置結(jié)扎，剪去同等長度子宮不用，其他處理過程同上。常規(guī)飼養(yǎng)，每周觸摸觀察內(nèi)膜包塊生長情況。造模第4周后，開腹觀察，用游標(biāo)卡尺測量內(nèi)膜包塊的體積 （長×寬×高mm3），當(dāng)包塊體積增大≥8 mm3，肉眼觀察包塊內(nèi)出現(xiàn)液體積聚，呈隆起透亮的小囊狀，結(jié)締組織覆蓋并有血管形成，即為造模成功［10］。造模成功動物隨機(jī)分成模型對照組、丹那唑組（0.20 g/kg）、益胃湯高 （27.00 g/kg）、中（13.50 g/kg）、低 （6.75 g/kg）3個(gè)劑量組，每組9只。每天灌胃一次，給藥體積10 mL/kg，模型對照組給予等體積生理鹽水，連續(xù)灌胃30 d。

1.5.2Western b1ot法檢測NOTCH1蛋白表達(dá) 末次給藥24 h后，脫臼處死大鼠，開腹暴露移植內(nèi)膜，測量體積后剪取部分內(nèi)膜并置于10%中性甲醛溶液中固定用于免疫組化的檢測，剩余部分于液氮凍存后用于Western b1ot的檢測。樣本蛋白經(jīng)8%～10%的SDS-PAGE分離膠分離后轉(zhuǎn)入硝酸纖維素膜，一抗 （稀釋濃度，NOTCH1為1∶200；β-Actin為1∶5 000）4℃孵育過夜，二抗 （稀釋濃度：1∶5 000）室溫孵育3 h。洗膜、顯影定影后，Image Lab凝膠分析系統(tǒng)掃描分析，結(jié)果以目的蛋白相對表達(dá)量 （目的蛋白相對表達(dá)量=目的蛋白積分光密度值（IOD）/內(nèi)參積分光密度值（IOD）表示。

1.5.3免疫組化法檢測DELTA1及JAGGED1蛋白表達(dá)

常規(guī)免疫組化法操作［11］，采用BA200Digita1數(shù)碼三目攝像顯微攝像系統(tǒng)顯微攝像系統(tǒng)從每張制好的片子中選取1～3個(gè)區(qū)域，400倍采集圖像，再用Image-Pro P1us 6.0圖像分析系統(tǒng)測定所采集全部圖像的平均光密度，若每張切片采集多張圖像，則取平均值。所有平均光密度 （AOD）值測定均在相同的光學(xué)條件下完成。陽性為棕黃色-黃色表達(dá)于細(xì)胞漿、細(xì)胞膜或間質(zhì)，陰性細(xì)胞核為藍(lán)色。

2　結(jié)果

2.1益胃湯對各組大鼠異位子宮內(nèi)膜體積的影響 給藥后，給藥組與模型對照組比較，各給藥組實(shí)驗(yàn)大鼠異位子宮內(nèi)膜體積顯著縮小 （P＜0.01），益胃湯對EMs模型大鼠異位子宮內(nèi)膜體積抑制率為46.35%～77.05%，結(jié)果見表1。

表1　各組大鼠給藥前后異位子宮內(nèi)膜體積變化 （n=9，±s）

表1　各組大鼠給藥前后異位子宮內(nèi)膜體積變化 （n=9，±s）

注：與模型對照組比較，**P＜0.01

組 別　　劑量/（g·kg-1）異位子宮內(nèi)膜體積/mm3抑制率/給藥前　　給藥后%模型對照組-　90.74±54.63 101.3±53.54　-丹那唑組　0.20　92.60±75.98 17.92±7.589**　80.65益胃湯高劑量組　27.0　103.6±70.56　23.78±14.46**　77.05益胃湯中劑量組　13.5　74.73±53.85 38.26±33.16**　48.80益胃湯低劑量組　6.75　84.68±51.21　45.43±28.24**46.35

2.2益胃湯對各組異位子宮內(nèi)膜NOTCH1蛋白表達(dá)的影響

Western b1ot檢測結(jié)果顯示，上條帶為NOTCH1，下條帶為β-Actin，見圖1；與模型對照組比較，益胃湯給藥組NOTCH1蛋白相對表達(dá)量降低，其中益胃湯高劑量組顯著抑制NOTCH1蛋白表達(dá)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.01），見圖2。

圖1　各組異位子宮內(nèi)膜NOTCH1蛋白水平的W estern blot原始記錄圖（n=9，±s）

2.3益胃湯對模型大鼠異位子宮內(nèi)膜DELTA1和JAGGED1蛋白表達(dá)的影響 DELTA1和JAGGED1表達(dá)于子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞的胞膜和胞漿中，陽性表達(dá)為淺黃色或棕黃色，陰性表達(dá)為藍(lán)色。由圖3～4可知，模型對照組異位子宮內(nèi)膜DELTA1和JAGGED1免疫染色呈黃色，陽性表達(dá)較高；給藥組異位子宮內(nèi)膜DELTA1和JAGGED1免疫染色較模型對照組，陽性表達(dá)降低，呈藍(lán)色陰性表達(dá)，益胃湯各劑量組陽性表達(dá)均降低；由圖5～6可知，高劑量組DELTA1平均光密度明顯低于模型對照組 （P＜0.01），其余兩個(gè)劑量組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）；高劑量組和中劑量組JAGGED1平均光密度明顯低于模型對照組（P＜0.01，P＜0.05）。

圖2　NOTCH 1在各組大鼠異位子宮內(nèi)膜中的相對表達(dá)量（n=9，±s）

圖3　益胃湯對異位子宮內(nèi)膜DELTA1蛋白表達(dá)的影響（×400）

圖4　益胃湯對異位子宮內(nèi)膜JAGGED1蛋白表達(dá)的影響（×400）

3　討論

子宮內(nèi)膜異位癥是一種多發(fā)于育齡階段的常見婦科疾病，大量研究認(rèn)為它的發(fā)病機(jī)制與患體免疫異常有關(guān)，而免疫淋巴T、B細(xì)胞的分化與Notch信號密不可分［7］，Notch信號是一種多細(xì)胞生物體進(jìn)化上保守的信號通路，哺乳動物體內(nèi)存在4種Notch受體（Notch1～4）和Jagged1～2、De1ta1，3，4等11種配體，Notch信號經(jīng)各細(xì)胞之間細(xì)胞膜上的受體和配體接觸傳導(dǎo)，Notch受體在相關(guān)酶的作用下釋放出Notch細(xì)胞內(nèi)源性結(jié)構(gòu)域（notch intrace11u1ar domain， NICD），它再轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)將信號傳給其他下游蛋白［12］，其時(shí)空表達(dá)效應(yīng)（tempora1-spatia1expression effects）對細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等生物過程具有重要作用。其中Notch1信號可促進(jìn)CD4+、CD8+雙陽性T細(xì)胞在骨髓中呈胸腺非依賴性發(fā)育［13］，De1ta1和Jagged1，對人類淋巴細(xì)胞以及子宮內(nèi)膜柱狀上皮細(xì)胞等上皮細(xì)胞的分化都具有直接影響［8］，并且它們還可分別誘導(dǎo)Th1和Th2的形成［14-15］，間接影響機(jī)體Th細(xì)胞分泌的炎性細(xì)胞因子水平的變化。結(jié)果顯示：益胃湯干預(yù)后可顯著降低EMs模型大鼠異位子宮內(nèi)膜體積，說明益胃湯可有效抑制異位內(nèi)膜生長；模型對照組異位內(nèi)膜NOTCH1、DELTA1和JAGGED1的表達(dá)均明顯升高，進(jìn)而引起EMs患體外周血Th細(xì)胞比率增加［16-17］和Th細(xì)胞分泌的炎癥因子血清或腹腔液水平［3］上升和下降，說明EMs的形成與Notch信號有關(guān)。益胃湯能明顯降低EMs模型大鼠異位子宮內(nèi)膜NOTCH1、DELTA1和JAGGED1的表達(dá)，表明益胃湯改善EMs可能與其下調(diào)NOTCH1、DELTA1和JAGGED1的表達(dá)有關(guān)，而它對Notch信號的其他受體及配體有無調(diào)節(jié)作用還有待于進(jìn)一步研究。

圖5　DELTA1在各組大鼠異位內(nèi)膜中的平均光密度（n=9，±s）

圖6　JAGGED1在各組大鼠異位內(nèi)膜中的平均光密度（n=9，±s）

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R285.5

B

1001-1528（2016）06-1372-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2016.06.035

2015-08-06

成都市科技局一般項(xiàng)目 （12DXYB270）

付文君 （1992—），女，碩士生，從事中藥神經(jīng)與精神藥理學(xué)研究。Te1：（028）61800231，E-mai1：fwj10330@163.com

羅曉紅 （1966—），女，教授，從事婦科疾病的教學(xué)、科研及臨床工作。Te1：（028）85080790，E-mai1：y1uoxiaohong88@ 126.com徐世軍 （1975—），男，教授，從事中藥神經(jīng)與精神藥理學(xué)研究。Te1：（028）61800231，E-mai1：docxu@126.com