張旭東， 楊若松， 陳 偉， 蔣雯雯， 韋登明， 林 榮*（1.寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)與病原生物學(xué)系，浙江 寧波315211；2.寧波市行為神經(jīng)科學(xué)重點實驗室，浙江寧波315211）

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雷公藤內(nèi)酯醇對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠脊髓背根神經(jīng)節(jié)中MCP-1及CCR2表達(dá)的影響

張旭東1，2， 楊若松1，2， 陳 偉1，2， 蔣雯雯1，2， 韋登明1，2， 林 榮1，2*
（1.寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)與病原生物學(xué)系，浙江 寧波315211；2.寧波市行為神經(jīng)科學(xué)重點實驗室，浙江寧波315211）

目的 通過檢測不同劑量雷公藤內(nèi)酯醇（tripto1ide，TP）對佐劑性關(guān)節(jié)炎（adjuvant arthritis，AA）大鼠的鎮(zhèn)痛效果及其對腰5（L5）脊髓背根神經(jīng)節(jié)中單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）及趨化因子受體-2（chemokine receptor2，CCR2）表達(dá)的影響，旨在探討雷公藤內(nèi)酯醇對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎可能的鎮(zhèn)痛機制。方法 50只SD大鼠隨機分成5組即正常組，模型組，雷公藤內(nèi)酯醇低、中、高劑量治療組。模型組及治療組右后足跖皮下注射0.1 mL弗氏完全佐劑造模，正常組注射0.1 mL生理鹽水對照。造模后2周，治療組大鼠采取不同劑量雷公藤內(nèi)酯醇腹腔注射給藥治療（低劑量治療組0.1 mg/kg，中劑量治療組0.2 mg/kg，高劑量治療組0.4 mg/kg），每天1次，共9 d。于造模前，造模后14 d，給藥后9 d進(jìn)行熱痛閾的測定，用免疫組化檢測腰5脊髓背根神經(jīng)節(jié) （dorsa1 root gang1ia，DRG）中MCP-1、CCR2的表達(dá)變化情況。結(jié)果 模型組大鼠熱痛閾顯著低于正常組（P＜0.01），經(jīng)過雷公藤內(nèi)酯醇治療后，各治療組熱痛閾均顯著高于模型組 （P＜0.05，P＜0.01）；免疫組化結(jié)果表明模型組DRG中MCP-1及CCR2陽性表達(dá)水平較正常組顯著升高（P＜0.01），其中雷公藤內(nèi)酯醇低劑量治療組大鼠L5DRG中只有MCP-1陽性表達(dá)水平顯著低于模型組（P＜0.01），而雷公藤內(nèi)酯醇中高劑量治療組大鼠L5DRG中MCP-1、CCR2陽性表達(dá)水平均顯著低于模型組 （P＜0.01）。結(jié)論 雷公藤內(nèi)酯醇對佐劑性關(guān)節(jié)炎具有良好鎮(zhèn)痛作用；雷公藤內(nèi)酯醇可抑制AA大鼠DRG中MCP-1及CCR2的表達(dá)，這可能是雷公藤內(nèi)酯醇產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用機制之一。

佐劑性關(guān)節(jié)炎；雷公藤內(nèi)酯醇；鎮(zhèn)痛；背根神經(jīng)節(jié)；趨化因子

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性自體免疫性疾病，常伴有劇烈疼痛，嚴(yán)重降低患者的生存質(zhì)量，止痛是治療RA的重要環(huán)節(jié)，也是判定該病療效的標(biāo)準(zhǔn)之一［1］。而近年來發(fā)現(xiàn)MCP-1及CCR2在神經(jīng)病理性疼痛和炎性痛發(fā)生發(fā)展中有重要的作用［2-4］。脊髓是疼痛相關(guān)信息傳遞及整合的初級中樞，其背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的MCP-1對外周痛感受器的功能強弱有影響，MCP-1與慢性疼痛的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［5-7］。雷公藤在臨床上有確切的鎮(zhèn)痛療效，而雷公藤內(nèi)酯醇對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠鎮(zhèn)痛機制與大鼠脊髓背根神經(jīng)節(jié)中趨化因子MCP-1及其受體CCR2表達(dá)的關(guān)系尚未見報道。

本實驗通過建立AA大鼠模型，給予不同劑量雷公藤內(nèi)酯醇治療，以熱痛閾、腰5（L5）節(jié)段脊髓 DRG中MCP-1及其受體CCR2的表達(dá)為檢測指標(biāo)，旨在探討不同劑量雷公藤內(nèi)酯醇對AA大鼠脊髓DRG中MCP-1和CCR2的影響，為雷公藤制劑的臨床鎮(zhèn)痛提供一定的理論依據(jù)。

1　材料與儀器

1.1實驗動物與試劑 SD大鼠50只，雌雄各半，體質(zhì)量約180～220g，寧波大學(xué)實驗動物中心代購，合格證號0102013；雷公藤內(nèi)酯醇由上?？菩l(wèi)醫(yī)療技術(shù)研究所提供（純度為99.9%，批號20130111），用4%丙二醇溶液加熱溶解；完全弗氏佐劑 （美國Sigma公司）；戊巴比妥鈉 （德國Merck公司）；SABC免疫組化染色試劑盒，MCP-1、CCR2多克隆抗體原液，DAB顯色試劑盒均購于武漢博士德生物工程有限公司。

1.2主要儀器 ZH-LUO/B鼠尾測痛儀（正華生物儀器設(shè)備有限公司）；BM-Ⅶ包埋機 （宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司）；HM-325石蠟切片機（德國LEICA公司）；CX40生物顯微鏡 （日本O1ympus公司）；JD801形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)（江蘇捷達(dá)科技發(fā)展有限公司）。

2　方法

2.1動物分組及模型制備 大鼠喂養(yǎng)7 d后隨機分成5組：正常組，模型組，雷公藤內(nèi)酯醇低、中、高劑量治療組。大鼠麻醉消毒后，模型組和治療組大鼠在右后足跖皮內(nèi)注射0.1mL完全弗氏佐劑誘導(dǎo)AA大鼠模型，正常組則在相應(yīng)部位注射等量生理鹽水作為對照，繼發(fā)關(guān)節(jié)炎的出現(xiàn)標(biāo)志造模成功，約要2周。造模14 d后，治療組大鼠分別按低、中、高劑量 （0.1、0.2、0.4 mg/kg）腹腔注射雷公藤內(nèi)酯醇溶液進(jìn)行治療，每日1次，連續(xù)9 d，而正常組和模型組大鼠腹腔注射等體積4%丙二醇溶液作為對照。

2.2熱痛閾測定 使用光致熱鼠尾測痛儀，對造模前，造模14 d，治療9 d的大鼠進(jìn)行熱痛閾測定。將鼠尾測痛儀調(diào)到55℃，將鼠尾放入凹槽內(nèi)，于距鼠尾尖約0.5 cm處照射致痛，記錄大鼠由照射開始到鼠尾甩動的時間，連續(xù)測3次，間隔5m in以上，取平均值作為痛閾。

2.3組織病理學(xué)檢查 給藥后9 d，將實驗動物麻醉后左心灌注處死，取踝關(guān)節(jié)，腰5節(jié)段脊髓DRG放入中性固定液中固定。固定后的踝關(guān)節(jié)流水沖洗后，經(jīng)脫鈣液脫鈣，梯度酒精脫水，透明，浸蠟后，包埋，做HE染色；而DRG則按照說明書進(jìn)行免疫組化測定趨化因子MCP-1及其受體CCR2的表達(dá)，每張切片鏡下400倍下選擇4個視野由JD801形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)測量陽性產(chǎn)物的積分光密度（IOD），并進(jìn)行統(tǒng)計分析。2.4 統(tǒng)計學(xué)分析 結(jié)果用±s表示，采用SPSS18.0軟件進(jìn)行重復(fù)測量資料的單因素方差分析和獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有顯著性。

3　結(jié)果

3.1不同劑量雷公藤內(nèi)酯醇對AA大鼠熱痛閾的影響 結(jié)果見表1，造模前各組大鼠熱痛閾無顯著差異 （P＞0.05）。造模14 d時，正常組大鼠熱痛閾顯著高于模型組 （P＜0.01）；雷公藤內(nèi)酯醇治療9 d后，低、中、高劑量治療組熱痛閾均高于模型組 （P＜0.05，P＜0.01）；且中劑量治療組療效較低劑量治療組明顯 （P＜0.05），高劑量治療組與低、中劑量治療組相比，熱痛閾提高更為顯著 （P＜0.01）。由此可以推測低、中、高劑量的雷公藤內(nèi)酯醇治療AA大鼠9 d后，均可顯著提高熱AA大鼠的痛閾，且呈一定的量效關(guān)系。

表1　雷公藤內(nèi)酯醇對各組大鼠熱痛閾變化的影響 （±s，n=10）

表1　雷公藤內(nèi)酯醇對各組大鼠熱痛閾變化的影響 （±s，n=10）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與TP低劑量治療組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與TP中劑量治療組比較，△△P＜0.01

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3.2不同劑量雷公藤內(nèi)酯醇對AA大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織病理學(xué)影響 圖1所示為各組大鼠踝關(guān)節(jié)的HE染色圖片，其中正常組大鼠踝關(guān)節(jié)腔邊緣清晰，關(guān)節(jié)軟骨表面光滑，未見滑膜組織增生以及炎性細(xì)胞浸潤，結(jié)構(gòu)正常；模型組大鼠踝關(guān)節(jié)出現(xiàn)滑膜增生，滑膜細(xì)胞數(shù)量增多，同時伴有大量炎性細(xì)胞浸潤；經(jīng)雷公藤內(nèi)酯醇治療后，治療組大鼠滑膜組織的炎性細(xì)胞浸潤較模型組有明顯減少，炎癥反應(yīng)程度逐漸減輕，隨著雷公藤內(nèi)酯醇治療劑量增加，效果愈加明顯。

3.3不同劑量雷公藤內(nèi)酯醇對AA大鼠DRG中MCP-1及其受體CCR2的影響 雷公藤內(nèi)酯醇治療9 d后，大鼠L5DRG中模型組MCP-1及CCR2免疫陽性積分光密度顯著高于正常組（P＜0.01），低劑量治療組MCP-1免疫組化陽性產(chǎn)物積分光密度較模型組顯著降低 （P＜0.01），而中、高劑量治療組MCP-1及CCR2免疫組化陽性產(chǎn)物積分光密度均較模型組顯著下降 （P＜0.01），趨勢呈一定的量效關(guān)系。結(jié)果見表2～3。

表2　各組大鼠L5 DRG中MCP-1的表達(dá)（±s）

表2　各組大鼠L5 DRG中MCP-1的表達(dá)（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.01

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4　討論

谷氨酸參與痛覺信息的傳遞，是介導(dǎo)痛覺信息傳遞最主要的神經(jīng)遞質(zhì)之一，NO是谷氨酸興奮作用的細(xì)胞內(nèi)信使，介導(dǎo)谷氨酸的神經(jīng)毒性，同時又與多種遞質(zhì)相互作用，加強疼痛信號在脊髓后角的調(diào)制，產(chǎn)生病理性疼痛［8］，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶 （iNOS）是一種生成NO的限速酶，但iNOS基因一般不表達(dá)，只有在如腫瘤壞死因子、白介素-1等內(nèi)毒素和多種細(xì)胞因子刺激下，才會轉(zhuǎn)錄翻譯和表達(dá)。NMDAR是谷氨酸受體的一個類型，屬于離子型受體。關(guān)節(jié)炎患者的外周損傷釋放緩激肽等物質(zhì)使感受器激活，膜去極化，而炎性介質(zhì)如NO、PG等進(jìn)一步加強外周感受器的敏化狀態(tài)，使感受器持續(xù)產(chǎn)生傷害性沖動傳入脊髓，致使脊髓神經(jīng)元興奮，大量釋放P物質(zhì) （SP）和谷氨酸。谷氨酸可直接激活突觸后膜的NMDAR導(dǎo)致Ca2+內(nèi)流激活蛋白激酶C（PKC），激活的PKC使細(xì)胞膜磷酸化NMDAR，提高NMDAR興奮性并增加Ca2+內(nèi)流；而NMDAR的激活與Ca2+濃度的升高又會使PKC活性增強，從而形成正反饋使疼痛持續(xù)存在。NMDAR1激活后還可調(diào)節(jié)SP、谷氨酸等神經(jīng)遞質(zhì)的突觸前釋放，表明NMDAR1可能參與了中樞敏化的形成［9］。

圖1　各組大鼠踝關(guān)節(jié)HE染色圖 （×100）

表3　各組大鼠L5 DRG中CCR2的表達(dá)（±s）

表3　各組大鼠L5 DRG中CCR2的表達(dá)（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.01

陽性產(chǎn)物積分光密度正常組　10　30.9±9.49組別　n *模型組　10　49.2±16.01 TP低劑量治療組　10　41.1±21.07 TP中劑量治療組　10　31.3±9.85*TP高劑量治療組　10　19.0±6.99*

本實驗室既往的研究［10-11］表明 AA大鼠脊髓背角和DRG中iNOS、SP、IL-1β、TNF-α、NMDAR1表達(dá)較正常對照組顯著上調(diào)，而雷公藤內(nèi)酯醇對這些細(xì)胞因子表達(dá)的抑制作用可能是雷公藤內(nèi)酯醇的鎮(zhèn)痛作用機制之一。這顯示雷公藤內(nèi)酯醇具有多靶點作用的特點。

MCP-1及其受體CCR2是近年來較為熱門的趨化因子，周圍組織炎癥或神經(jīng)損傷后DRG中神經(jīng)元可大量分泌MCP-1，而周圍小膠質(zhì)細(xì)胞上的CCR2受體與之結(jié)合后通過信號傳遞傳導(dǎo)通路刺激小膠質(zhì)細(xì)胞迅速活化增殖并釋放出大量細(xì)胞因子，進(jìn)一步引發(fā)星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化。小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞活化后相互激活進(jìn)而產(chǎn)生協(xié)同作用，釋放多種致痛物質(zhì)如iNOS、SP引發(fā)神經(jīng)元興奮性升高的同時，又降低神經(jīng)元的興奮閾值，以至于正常時不能產(chǎn)生疼痛的低強度刺激也可致痛從而形成中樞敏化現(xiàn)象，加上疼痛的正反饋的共同作用使慢性痛持續(xù)存在［3，12-14］。

本實驗結(jié)果顯示，造模14 d時，正常組大鼠熱痛閾顯著高于模型組；而免疫組化結(jié)果顯示模型組大鼠DRG中MCP-1及CCR2陽性產(chǎn)物表達(dá)水平均顯著高于正常組，提示在AA大鼠造模時，關(guān)節(jié)的炎癥反應(yīng)使感受器受到外界刺激后疼痛信息傳入增加，導(dǎo)致DRG神經(jīng)元內(nèi)MCP-1及CCR2表達(dá)增加，可能參與了AA大鼠關(guān)節(jié)痛的發(fā)生。經(jīng)雷公藤內(nèi)酯醇治療后，低、中、高劑量治療組大鼠MCP-1及CCR2的陽性表達(dá)均有顯著下降，且呈一定的量效關(guān)系的趨勢。分析這一結(jié)果產(chǎn)生的可能原因為：在關(guān)節(jié)炎形成后，雷公藤內(nèi)酯醇抑制了關(guān)節(jié)局部炎癥反應(yīng)及DRG中MCP-1、CCR2的表達(dá)，使外界刺激后疼痛信息傳入也相應(yīng)減少而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。

綜上所述，雷公藤內(nèi)酯醇的鎮(zhèn)痛機制可能與其抑制背根神經(jīng)節(jié)DRG中MCP-1及CCR2的表達(dá)有關(guān)，具體的分子機制還有待進(jìn)一步探究加以明確。

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R285.5

B

1001-1528（2016）06-1390-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2016.06.040

2015-09-08

寧波市自然科學(xué)基金項目 （2014A610247）；寧波大學(xué)學(xué)科項目 （XKL14D2102）

張旭東（1991—），男，碩士生，從事類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎防治機理的研究。E-mai1：zhangxudong9134@sina.cn

林 榮 （1978—），男，實驗師，從事類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎防治機理的研究。Te1：（0574）87609590，E-mai1：1inrong@nbu. edu.cn