張自然， 董志軍， 董微麗， 張鐵民， 賈璐瑤， 戴 慧， 邢 薇（承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院眼科，河北承德067000）

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中藥菩人丹對(duì)OLETF大鼠視網(wǎng)膜磷酸化c-Jun氨基末端激酶和半胱氨酸天冬氨酸激酶-3表達(dá)的干預(yù)作用

張自然， 董志軍*， 董微麗， 張鐵民， 賈璐瑤， 戴 慧， 邢 薇
（承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院眼科，河北承德067000）

目的 探討菩人丹超微粉 （PRD）對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜磷酸化c-Jun氨基末端激酶 （p-JNK）和半胱氨酸天冬氨酸激酶-3（Caspase-3）表達(dá)的影響。方法 以自發(fā)性雄性2型糖尿病大鼠模型OLETF大鼠和其同系非糖尿病對(duì)照鼠LETO雄性大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，血糖峰值＞16.7mmo1/L和負(fù)荷后120min血糖＞11.1mmo1/L作為成模標(biāo)準(zhǔn)，將24只成模雄性O(shè)LETF大鼠隨機(jī)分為模型組、菩人丹超微粉治療組，每組12只，同周齡12只雄性LETO大鼠為空白對(duì)照組。模型成功建立后，菩人丹超微粉治療組大鼠給予菩人丹超微粉 ［1.8 g·（kg·d）-1］灌胃2個(gè)月。HE染色觀察視網(wǎng)膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化；采用脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法 （TUNEL）檢測大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的凋亡情況；SP免疫組織化學(xué)染色法和Western b1ot法檢測視網(wǎng)膜磷酸化JNK（p-JNK）、Caspase-3蛋白的表達(dá)；采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈法（RT-PCR）檢測大鼠視網(wǎng)膜Jnk、caspase-3 mRNA的表達(dá)。結(jié)果 糖尿病模型組大鼠視網(wǎng)膜出現(xiàn)明顯的病理變化，神經(jīng)細(xì)胞凋亡指數(shù)p-JNK、Caspase-3蛋白及mRNA的表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組大鼠（P＜0.01）。菩人丹超微粉治療組大鼠視網(wǎng)膜的病理變化明顯減輕，神經(jīng)細(xì)胞凋亡指數(shù)、p-JNK、Caspase-3蛋白及mRNA的表達(dá)明顯低于模型組大鼠 （P＜0.01）。結(jié)論 菩人丹超微粉可以改善糖尿病視網(wǎng)膜病變中神經(jīng)組織的損傷，表現(xiàn)為神經(jīng)細(xì)胞凋亡的減少，這可能與下調(diào)p-JNK、Caspase-3的表達(dá)相關(guān)。

菩人丹超微粉；OLETF大鼠；糖尿病視網(wǎng)膜病變；細(xì)胞凋亡；磷酸化c-Jun氨基末端激酶；半胱氨酸天冬氨酸激酶-3

糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）的患病率、致盲率逐年升高，是目前工作年齡人群第一位的致盲性疾?。?］。關(guān)于DR發(fā)病機(jī)制至今尚不明確。近年的研究表明，細(xì)胞凋亡是DR早期最主要的病理表現(xiàn)形式，參與DR的發(fā)生發(fā)展［2-3］。c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-termina1 kinase，JNK）和半胱氨酸天冬氨酸激酶-3（cysteine aspartic acid specific protease-3，Caspase-3）作為參與細(xì)胞凋亡的兩個(gè)重要因子與DR關(guān)系密切［4-5］。JNK是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它的活化（磷酸化JNK，p-JNK）能介導(dǎo)多種胞外刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［6-7］，Caspase-3作為細(xì)胞凋亡途徑下游的關(guān)鍵執(zhí)行者，在JNK細(xì)胞凋亡通路中起著最終執(zhí)行作用［8］。菩人丹超微粉（Purendan superfine powder，PRD）是針對(duì)糖尿病病機(jī)關(guān)鍵— “熱、虛、瘀”而設(shè)，根據(jù)中醫(yī) “因虛致瘀久病入絡(luò)”理論，在臨床觀察及預(yù)實(shí)驗(yàn)并結(jié)合現(xiàn)代藥理學(xué)研究成果的基礎(chǔ)上加減組成的中藥復(fù)方。臨床研究已證實(shí)菩人丹超微粉具有降血糖功效，并可有效改善2型糖尿病患者脂質(zhì)代謝的紊亂［9］。前期實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步表明，菩人丹超微粉可修復(fù)胰島β細(xì)胞損傷，改善胰島功能，并保護(hù)糖尿病時(shí)腎臟和大血管損傷［10-11］。為拓展菩人丹超微粉治療糖尿病并發(fā)癥的研究，本課題組擬通過觀察菩人丹超微粉是否可通過調(diào)節(jié)自發(fā)性2型糖尿病大鼠模型視網(wǎng)膜JNK和Caspase-3的表達(dá)，發(fā)揮對(duì)DR神經(jīng)組織損傷的保護(hù)作用。

1　材料

1.1藥物與試劑 菩人丹超微粉，藥物組成比例為苦瓜10，人參1，丹參3，制首烏1，葛根1，水蛭0.3，由河北以嶺藥業(yè)集團(tuán)有限公司按藥物制備工藝代加工生產(chǎn)。TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（瑞士Roche公司）；p-JNK兔抗多克隆抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；Caspase-3兔抗多克隆抗體 （武漢博士德生物技術(shù)有限公司）；SP免疫組化試劑盒 （北京四正柏生物科技有限公司）；BCA蛋白定量試劑盒 （碧云天生物科技有限公司）；Jnk、caspase-3引物（美國Invitrogen公司）；RT-PCR試劑盒（日本Taka1a公司）。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔雄性自發(fā)性2型糖尿病大鼠Otsuka 1ong-evans tokushima fatty（OLETF）大鼠和其同系非糖尿病對(duì)照鼠Long evanstokushima otsuk（LETO）大鼠（日本大冢制藥公司，許可證編號(hào)：DCE0000910）。

2　方法

2.1動(dòng)物分組、模型制備與給藥 以自發(fā)性2型糖尿病大鼠模型OLETF大鼠和其同系非糖尿病對(duì)照鼠LETO大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。OLETF大鼠（雄性，24只），LETO大鼠（雄性，12只），4周齡，初始體質(zhì)量為 （150±10）g。SPF級(jí)條件下單籠、標(biāo)準(zhǔn)飼料飼養(yǎng)。環(huán)境溫度22～25℃，濕度50%～60%，12/12 h光照黑暗循環(huán)，自由進(jìn)食。大鼠定期行口服葡萄糖耐量試驗(yàn) （OGTT），以血糖峰值 ＞16.7 mmo1/L和負(fù)荷后120 min血糖＞11.1 mmo1/L作為成模標(biāo)準(zhǔn)［11］。至32周齡造模成功后將OLETF大鼠隨機(jī)分為模型組、菩人丹超微粉治療組，同周齡12只雄性LETO大鼠為正常對(duì)照組。菩人丹超微粉治療組給予菩人丹超微粉1.8 g/（kg·d）（前期研究確定的最佳藥物劑量）灌胃2個(gè)月；正常對(duì)照組及糖尿病模型組給予同體積蒸餾水灌胃2個(gè)月。

2.2標(biāo)本制備 大鼠經(jīng)菩人丹超微粉治療結(jié)束后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉 （0.5 g/kg）。雙側(cè)眼球用眼科剪及彎鑷迅速摘除，一側(cè)眼球浸于4%多聚甲醛固定液中，取出后常規(guī)酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，分別備用于蘇木素-伊紅（HE）染色法觀察視網(wǎng)膜形態(tài)變化、TUNEL法原位檢測細(xì)胞凋亡及SP免疫組織化學(xué)染色法觀察p-JNK及Caspase-3蛋白的表達(dá)；另一側(cè)眼球迅速在冰面上分離視網(wǎng)膜組織，投入液氮中后轉(zhuǎn)存至-80℃冰箱保存，備用于Western b1ot法檢測p-JNK及Caspase-3蛋白的表達(dá)及RTPCR法檢測Jnk、caspase-3 mRNA的表達(dá)。

2.3空腹血糖 （FBG）測定 分別于造模前、成模時(shí)、用藥后尾靜脈取血，使用血糖儀測定空腹血糖。

2.4HE染色觀察大鼠視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)變化 平行視軸矢狀位切片，片厚4μm，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，蘇木素初染6 min，流水沖洗10 min，1%鹽酸酒精分化10 s，流水沖洗10 m in，伊紅復(fù)染2 min，脫水，透明，封片。400倍光學(xué)顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜的形態(tài)變化。

2.5TUNEL法原位檢測大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡 按TUNEL試劑盒說明書步驟操作，400倍光學(xué)顯微鏡下觀察。凋亡指（apoptotic index，AI）的計(jì)算：AI=陽性細(xì)胞數(shù)目/同一視野神經(jīng)細(xì)胞總數(shù)。每只動(dòng)物隨機(jī)抽取3張切片，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，取其平均值。

2.6SP免疫組織化學(xué)染色法檢測視網(wǎng)膜中p-JNK、Caspase-3蛋白表達(dá) 眼球平行視神經(jīng)連續(xù)矢狀切片，片厚4μm，常規(guī)脫蠟至水，枸櫞酸鹽高壓修復(fù)。Ⅰ抗分別為p-JNK多克隆抗體，稀釋濃度為1∶150，Caspase-3多克隆抗體，稀釋濃度1∶100，4℃濕盒過夜，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片。以0.01 mmo1/L PBS替代Ⅰ抗作陰性對(duì)照。陽性結(jié)果為在Ag定位處染棕黃或棕褐色。400光學(xué)顯微鏡下觀察并攝片，陽性率=陽性結(jié)果面積/視野總面積。每只動(dòng)物隨機(jī)抽取3張切片，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，取其平均值。

2.7Western b1ot法檢測大鼠視網(wǎng)膜中p-JNK、Caspase-3蛋白表達(dá) 取低溫凍存的視網(wǎng)膜組織，提蛋白，BCA試劑盒測蛋白濃度。各組蛋白上樣量為50μg，12%聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉TBST室溫封閉2 h，分別加入p-JNK（1∶200）、Caspase-3（1∶200）抗體，4℃孵育過夜，洗膜后加入二抗室溫孵育1 h，ECL發(fā)光液顯影。掃描膠片后分別計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量：以β-Actin作為內(nèi)參計(jì)算p-JNK、Caspase-3條帶與β-Actin條帶的灰度比值。

2.8RT-PCR法檢測大鼠視網(wǎng)膜Jnk、caspase-3 mRNA表達(dá)

取-80℃冰箱中保存的視網(wǎng)膜組織置于勻漿器中，將細(xì)胞裂解液加入勻漿器內(nèi)，冰盒中研磨至細(xì)膩顆粒狀，用Takara RNA提取試劑盒提取總RNA。取4μL RAN進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，可見清晰的28、18、5 s條帶，說明無RNA降解。用紫外分光光度計(jì)檢測提取RNA的純度及濃度。以RNA為模板反轉(zhuǎn)錄成cDNA，所取RNA的量根據(jù)測出的濃度計(jì)算，反轉(zhuǎn)錄條件為：30℃，10 min；42℃，30 min；95℃，5 m in；5℃，5 min。取2μL cDNA產(chǎn)物進(jìn)行PCR，引物序列及循環(huán)數(shù)及產(chǎn)物長度 （表1），Jnk反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性，5min；94℃變性，30 s；56℃退火，30 s；72℃延伸，45 s，第二步起循環(huán)。caspase-3反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性，5 min；94℃變性，30 s；53℃退火，30 s；72℃延伸，45 s，第二步起循環(huán)。取8μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%的瓊脂糖凝膠電泳，100 V，60 min。圖像用紫外投射反射分析儀進(jìn)行攝像，Quantity-Oen軟件進(jìn)行分析，以β-actin作為內(nèi)參計(jì)算Jnk mRNA條帶與β-actin條帶的灰度比值。

表1　PCR引物序列及擴(kuò)增條件

3　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)及方差齊性分析符合單因素方差分析的條件，數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差 （±s）表示，不同組間比較采用單因素方差分析，同組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4　結(jié)果

4.1大鼠空腹血糖 造模前各組大鼠空腹血糖無明顯差距（P＞0.05），成模時(shí)除正常組外，各模型組空腹血糖顯著升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.01）。用藥后，與模型組比較，菩人丹超微粉組空腹血糖水平顯著降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.01，表2）。

表2　大鼠空腹血糖值 （±s，n=12）

表2　大鼠空腹血糖值 （±s，n=12）

注：與正常組比較，#P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.01

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4.2大鼠視網(wǎng)膜HE染色結(jié)果 正常組大鼠視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)完整、內(nèi)界膜光滑、分層清晰；節(jié)細(xì)胞圓形、橢圓形，染色淺，排列整齊；內(nèi)網(wǎng)狀層較厚、疏松；內(nèi)核層染色稍深，由3～5層細(xì)胞構(gòu)成；外網(wǎng)狀層較內(nèi)網(wǎng)狀層明顯變??；外核層染色深，由8～10層細(xì)胞組成，排列較緊密；外界膜邊界清楚、整齊 （圖1A）。模型組可見視網(wǎng)膜內(nèi)界膜明顯腫脹、增厚，部分內(nèi)界膜破裂，內(nèi)界膜界線不清晰，部分細(xì)胞空泡樣變、細(xì)胞核固縮、溶解 （圖1B）。菩人丹超微粉組視網(wǎng)膜分層較為清晰，內(nèi)界膜輕度腫脹，可見少量空泡樣變細(xì)胞 （圖1C）。

圖1　大鼠視網(wǎng)膜HE染色結(jié)果 （×400）

4.3大鼠視網(wǎng)膜TUNEL染色 正常對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜切片未見明顯TUNEL染色陽性細(xì)胞（圖2A）；糖尿病模型組及菩人丹超微粉治療組陽性細(xì)胞分布范圍擴(kuò)大，TUNEL染色陽性產(chǎn)物表現(xiàn)為褐色、顆粒狀，位于胞核中，主要分布部位為視網(wǎng)膜內(nèi)核層和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（retina1 gang1ion ce11s，RGCs）層 （圖2B、C）。3組大鼠視網(wǎng)膜中AI的總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與正常組相比，模型組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞AI明顯升高 （P＜0.01）；與模型組相比，菩人丹超微粉治療組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞AI明顯降低 （P＜0.01，表3）。

4.4大鼠視網(wǎng)膜p-JNK蛋白的表達(dá) 免疫組織化學(xué)顯色結(jié)果顯示，p-JNK免疫陽性產(chǎn)物表現(xiàn)為棕黃色、細(xì)顆粒狀，位于胞核和胞質(zhì)中，陽性細(xì)胞主要分布部位為RGCs層及內(nèi)核層 （圖3）。免疫印跡法結(jié)果顯示，p-JNK蛋白條帶位于42 kDa處；β-Actin條帶位于43 kDa處（圖4）。與正常組相比，模型組大鼠視網(wǎng)膜組織p-JNK蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.01）；與模型組相比，菩人丹超微粉治療組大鼠視網(wǎng)膜組織p-JNK蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.01，表4）。

圖2　大鼠視網(wǎng)膜組織TUNEL染色結(jié)果（×400）

表3　各組大鼠視網(wǎng)膜凋亡指數(shù) （±s）

表3　各組大鼠視網(wǎng)膜凋亡指數(shù) （±s）

注：與模型組比較，*P＜0.01

凋亡指數(shù)正常組　12　0.027 7±0.002 9組別　　動(dòng)物數(shù)/只*模型組　12　0.214 5±0.002 6菩人丹超微粉治療組　12　0.101 1±0.002 0*

圖3　免疫組織化學(xué)檢測大鼠視網(wǎng)膜組織p-JNK蛋白的表達(dá) （×400）

圖4　W estern blot檢測視網(wǎng)膜組織p-JNK蛋白表達(dá)

表4　各組大鼠視網(wǎng)膜組織p-JNK蛋白的表達(dá)（±s）

表4　各組大鼠視網(wǎng)膜組織p-JNK蛋白的表達(dá)（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.01

Western b1ot正常組　12　0.054 8±0.029 8*0.275 0±0.016組別　　動(dòng)物數(shù)/只　　免疫組織化學(xué)*模型組　12　0.303 8±0.002 7　0.754 6±0.022 5菩人丹超微粉治療組　12　0.101 8±0.002 7*0.513 3±0.020*

4.5大鼠視網(wǎng)膜Caspase-3蛋白的表達(dá) 免疫組織化學(xué)顯色結(jié)果顯示，Caspase-3免疫陽性產(chǎn)物表現(xiàn)為棕黃色、細(xì)顆粒狀，位于胞核中，陽性細(xì)胞主要分布部位為內(nèi)核層和RGCs層（圖5）。免疫印跡法結(jié)果顯示，Caspase-3蛋白條帶位于34 kDa處；β-Actin條帶位于43 kDa處（圖6）。正常組相比，模型組大鼠視網(wǎng)膜組織Caspase-3蛋白表達(dá)明顯升高 （P＜0.01）；與模型組相比，菩人丹超微粉治療組大鼠視網(wǎng)膜組織Caspase-3蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.01，表5）。

圖5　免疫組織化學(xué)檢測大鼠視網(wǎng)膜組織Caspase-3蛋白的表達(dá) （×400）

圖6　W estern blot檢測視網(wǎng)膜組織Caspase-3蛋白表達(dá)

表5　各組大鼠視網(wǎng)膜組織Caspase-3蛋白的表達(dá)（±s）

表5　各組大鼠視網(wǎng)膜組織Caspase-3蛋白的表達(dá)（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.01

Western b1ot正常組　12　0.100 3±0.002 7*　0.643 6±0.0410組別　　動(dòng)物數(shù)/只　　免疫組織化學(xué)*模型組　12　0.303 8±0.002 7　1.421 0±0.069 2菩人丹超微粉治療組　12　0.158 1±0.003 2*　0.866 0±0.053 3*

4.6大鼠視網(wǎng)膜Jnk、caspase-3 mRNA的表達(dá) Jnk mRNA條帶位于422 bp處；caspase-3 mRNA條帶位于329 bp處；β-actin條帶位于425 bp處 （圖7）。與正常組相比，DM組大鼠視網(wǎng)膜組織Jnk及caspase-3 mRNA表達(dá)明顯升高（P＜0.01）；與DM組相比，菩人丹超微粉治療組大鼠視網(wǎng)膜組織Jnk及caspase-3 mRNA表達(dá)明顯降低（P＜0.01，表6）。

圖7　RT-PCR檢測大鼠視網(wǎng)膜組織Jnk、caspase-3mRNA表達(dá)

表6　各組大鼠視網(wǎng)膜Jnk和caspase-3 mRNA的表達(dá)（±s）

表6　各組大鼠視網(wǎng)膜Jnk和caspase-3 mRNA的表達(dá)（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.01

Jnk　caspase-3正常組　12　0.071 6±0.014 6*0.381 1±0.012 7組別　　動(dòng)物數(shù)/只*模型組　12　0.514 2±0.013 8　0.766 6±0.015 4菩人丹超微粉治療組　12　0.454 9±0.015 0*0.515 1±0.014 4*

5　討論

研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病時(shí)慢性高血糖可導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡，神經(jīng)細(xì)胞退行性變是早期糖尿病視網(wǎng)膜病變的主要特征之一，甚至是糖尿病視網(wǎng)膜病變的啟動(dòng)因素［2-3］。細(xì)胞凋亡的發(fā)生是在凋亡相關(guān)基因的調(diào)控下進(jìn)行的，JNK及Caspase-3作為參與細(xì)胞凋亡的一類因子，與凋亡調(diào)控的關(guān)系非常密切［4-5］。本實(shí)驗(yàn)成功建立了自發(fā)性2型糖尿病大鼠模型OLETF大鼠，這類大鼠的特點(diǎn)是：為在自然情況下所發(fā)生糖尿病的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，未經(jīng)如胰腺切除、藥物破壞胰島功能或高脂飼料誘導(dǎo)等有意識(shí)的人工處置，隨著周齡的增加，逐漸出現(xiàn)以肥胖、脂代謝異常為主要特征的2型糖尿病，是一類與人類T2DM發(fā)病過程極為相似的動(dòng)物模型，確切應(yīng)用于T2DM及其并發(fā)癥發(fā)病機(jī)制和防治的研究領(lǐng)域［12］。本研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病模型組大鼠視網(wǎng)膜形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯改變，內(nèi)界膜明顯腫脹、增厚，細(xì)胞部分空泡樣變、核固縮，細(xì)胞數(shù)量減少、排列紊亂稀疏，視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的AI較正常對(duì)照組大鼠明顯增高，并且發(fā)現(xiàn)糖尿病模型組大鼠視網(wǎng)膜p-JNK及Caspase-3的蛋白表達(dá)較正常組均有明顯升高，且表達(dá)部位與凋亡的神經(jīng)細(xì)胞分布部位一致，均位于RGCs層和內(nèi)核層，p-Jnk及caspase-3基因的表達(dá)較正常組明顯升高，提示細(xì)胞凋亡是糖尿病視網(wǎng)膜病變時(shí)視網(wǎng)膜神經(jīng)組織損傷的重要病理形式，p-JNK及Caspase-3在此過程中發(fā)揮了重要作用。已有研究也發(fā)現(xiàn)在糖尿病動(dòng)物模型視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡的過程中JNK2、JNK3和Caspase-3的表達(dá)均有上調(diào)，本研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道相一致［13-15］。

JNK作為一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬絲裂原活化蛋白激酶超家族的一員。編碼JNK的基因JNK1、JNK2在生物體內(nèi)廣泛表達(dá)，而JNK3而僅在腦、心臟、睪丸、眼等器官中特異性表達(dá)［7］。高血糖、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)等胞外刺激都可使JNK發(fā)生磷酸化形成p-JNK進(jìn)而啟動(dòng)JNK凋亡信號(hào)通路，激活下游的Caspase［16］。Caspase為一類特異性切割天門冬氨酸的半胱氨酸蛋白酶，又稱為半胱天冬氨酸酶，共有14個(gè)家族成員，按其功能可分為兩類：一類是凋亡啟動(dòng)蛋白酶，如Caspase-2、-8、-9；另一類則是凋亡效應(yīng)蛋白酶，如Caspase-3、-6、-7，未被激活時(shí)每一成員均以無活性的酶原形式存在于細(xì)胞漿中，其中某一成員的激活都會(huì)引起其他成員的一系列酶聯(lián)反應(yīng)，而后逐級(jí)水解活化，作用于各自的底物，最終引起細(xì)胞凋亡。其中Caspase-3的表達(dá)與活化代表了細(xì)胞凋亡的不可逆轉(zhuǎn)，在細(xì)胞凋亡的過程中起著最終執(zhí)行作用［17-18］。研究發(fā)現(xiàn)，p-JNK可以激活死亡受體途徑和線粒體途徑，引起Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終使細(xì)胞死亡執(zhí)行者Caspase-3活化，在JNK凋亡信號(hào)通路中發(fā)揮最終執(zhí)行作用，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［19-20］。

菩人丹超微粉是由苦瓜、人參、丹參、葛根、制首烏、水蛭組成的中藥復(fù)方。方中苦瓜清解郁熱；人參、丹參、葛根益氣生津，活血化瘀；制何首烏補(bǔ)益精血，固腎益陰；水蛭祛瘀消癥，剔邪搜絡(luò)，諸藥合用，共奏養(yǎng)陰清熱、活血化瘀、祛痰化濕之功效［21］。本研究發(fā)現(xiàn)，菩人丹超微粉能有效改善大鼠視網(wǎng)膜的形態(tài)結(jié)構(gòu)，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量，下調(diào)p-JNK和Caspase-3在大鼠視網(wǎng)膜中的表達(dá)，表明菩人丹超微粉可使p-JNK和Caspase-3活化受阻，抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡從而發(fā)揮對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜損傷的保護(hù)作用，但菩人丹超微粉抑制p-JNK和Caspase-3的機(jī)制尚需進(jìn)一步探討。

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R285.5

B

1001-1528（2016）06-1397-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2016.06.042

2015-07-27

河北省中醫(yī)藥管理局資助課題 （2014066）

張自然（1989—），女，碩士生，研究方向?yàn)樘悄虿∫暰W(wǎng)膜病變。Te1：13383161223，E-mai1：zhangziran1223@163.com

董志軍 （1978—），男，碩士，副主任醫(yī)師，研究方向?yàn)樘悄虿∫暰W(wǎng)膜病變。Te1：13103145678，E-mai1：dongzj1978@ 126.com

網(wǎng)絡(luò)出版日期：2015-12-17

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detai1/31.1368.R.20151217.1000.002.htm1