程振玉， 楊英杰， 成樂琴， 于麗穎， 沈啟慧， 張 儉（吉林化工學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林吉林132022）

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Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化組織破碎提取龍膽苦苷

程振玉， 楊英杰*， 成樂琴， 于麗穎， 沈啟慧， 張 儉
（吉林化工學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林吉林132022）

目的 采用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化組織破碎提取龍膽苦苷。方法 以龍膽苦苷提取率為指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過Box-Behnken響應(yīng)面法對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果 最佳條件為藥材粒徑80目，料液比1∶30，電壓150 V，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，提取時(shí)間35 s，龍膽苦苷提取率達(dá)到5.37%。結(jié)論 該方法快速高效，可顯著縮短提取時(shí)間，增加龍膽苦苷的提取率。

龍膽苦苷；組織破碎；提取工藝；Box-Behnken響應(yīng)面法

龍膽草Gentiana scabra Bge.又名龍膽或地膽草，為龍膽科龍膽屬植物龍膽的根或莖部［1］，主要分布在吉林、遼寧、黑龍江和內(nèi)蒙古等東北地區(qū)。藥理研究表明，其生物藥效物質(zhì)基礎(chǔ)主要為龍膽苦苷，該成分在抑制惡性腫瘤形成、消除炎癥、促進(jìn)健胃消食、抗病原微生物、抗氧化和鎮(zhèn)痛等方面發(fā)揮了重要作用，顯示出明顯的藥理活性［2-4］。因此，研究龍膽苦苷的提取方法，使其提取率最大程度增加，對(duì)相關(guān)新藥研發(fā)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

龍膽苦苷的傳統(tǒng)提取技術(shù)大多采用回流法或連續(xù)回流法［5-6］，耗時(shí)長(zhǎng)，溫度高，而且提取率低，嚴(yán)重影響了這一藥用資源的充分利用。近幾年隨著提取技術(shù)的不斷發(fā)展與完善，組織破碎法［7-8］等新方法已逐步應(yīng)用到天然產(chǎn)物化學(xué)研究領(lǐng)域，在中藥藥理成分提取和樣品前處理中發(fā)揮了顯著作用，可大幅縮短提取時(shí)間，減少溶劑用量，而且目標(biāo)產(chǎn)物提取率明顯增加［9］，但迄今鮮有運(yùn)用該方法對(duì)龍膽草中龍膽苦苷進(jìn)行提取的研究報(bào)道。響應(yīng)面法是一種對(duì)工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化的有力手段和技術(shù)，在改善精度、提高預(yù)測(cè)性、簡(jiǎn)便準(zhǔn)確處理大量數(shù)據(jù)方面，具有正交試驗(yàn)等一般方法無法比擬的優(yōu)點(diǎn)，在中草藥、食品、化學(xué)化工等領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛［10-11］。本實(shí)驗(yàn)在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken響應(yīng)面法進(jìn)行設(shè)計(jì)，并對(duì)組織破碎法提取龍膽苦苷的工藝進(jìn)行優(yōu)化，為工業(yè)化進(jìn)一步生產(chǎn)該成分提供新的數(shù)據(jù)支撐。

1　材料與方法

1.1材料與試劑 龍膽苦苷對(duì)照品 （批號(hào)MUST-14052205，四川成都曼斯特生物科技有限公司）。甲醇、乙腈均為色譜純；乙醇為分析純；水為去離子水。龍膽草購(gòu)自吉林省通化市 （產(chǎn)地長(zhǎng)白山），由本校環(huán)境與生物工程學(xué)院隋新副教授鑒定為正品。

1.2儀器與設(shè)備 P230型高效液相色譜儀，配有UV-230紫外檢測(cè)器 （大連依利特分析儀器有限公司）；FA1004型電子天平 （上海舜宇恒科儀器有限公司）；SY-800超聲波清洗器 （上海寧商超生儀器有限公司）；JHBE-50S型閃式提取器（河南金鼎科技發(fā)展有限公司）；RT-08型多功能粉粹機(jī) （榮聰精密科技有限公司）；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；SHZ-D型循環(huán)水式真空泵 （河南省鞏義市英峪儀器一廠）。

1.3方法

1.3.1HPLC條件 Hypersi1ODS C18色譜柱（4.6 mm× 250mm，5μm）；進(jìn)樣量20μL；體積流量1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm；柱溫25℃；流動(dòng)相乙腈 （A）-0.4%磷酸 （B），梯度洗脫 （0～10 min，5% ～28%A；10～16 min，28%～30%A；16～16.1 min，30%～100%A，保持14min；30～30.1min，100%～5%A，保持15min）。

1.3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取置于干燥器中48 h以上的龍膽苦苷標(biāo)準(zhǔn)品，精密稱取11.40 mg，甲醇溶解，搖勻，定容到25 mL量瓶中，得到456.0μg/mL標(biāo)準(zhǔn)品貯備液。吸取適量，連續(xù)稀釋，得到456.0、342.0、228.0、114.0、57.0、28.5、9.12μg/m L溶液，在 “1.3.1”項(xiàng)條件下進(jìn)行分析。

1.3.3單因素試驗(yàn) 將干燥龍膽苦苷粉碎，過不同孔徑篩子。精密稱取5.0 g，平行3份，按照一定料液比加入不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇，置于閃式提取器中，在一定的電壓下提取一段時(shí)間。提取結(jié)束后，將所得混合液進(jìn)行抽濾，除去龍膽藥渣，濾液置于500 m L量瓶中，適量提取溶劑清洗提取器刀頭和藥渣，洗滌液繼續(xù)抽濾，濾液轉(zhuǎn)移到量瓶中，適量提取劑定容，搖勻，得到一定質(zhì)量濃度的龍膽苦苷提取液。吸取少量，過0.45μm尼龍微孔濾膜，進(jìn)樣，HPLC法分析含有量，考察料液比、提取電壓、乙醇體積分?jǐn)?shù)、藥材粒徑、提取時(shí)間等因素對(duì)龍膽苦苷提取率的影響。

1.3.4組織破碎法提取龍膽苦苷的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken響應(yīng)面法，對(duì)提取工藝作進(jìn)一步優(yōu)化。因素水平見表1。

表1　因素水平

2　結(jié)果與分析

2.1HPLC色譜圖與標(biāo)準(zhǔn)曲線 在“1.3.1”項(xiàng)條件下，基線無漂移現(xiàn)象，峰形不擴(kuò)張、不拖尾，目標(biāo)組分龍膽苦苷與共存雜質(zhì)得到了良好的分離，而且出峰相對(duì)較早，分析時(shí)間適宜，見圖1。以龍膽苦苷峰面積 （Y）對(duì)其質(zhì)量濃度（μg/mL，X）回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程 Y= 15.451 X+117.62，R2=0.999 9，表明龍膽苦苷在9.12～456.0mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

圖1　HPLC色譜圖

2.2單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1電壓對(duì)龍膽苦苷提取率的影響 固定藥材粒徑100目、料液比1∶20、乙醇體積分?jǐn)?shù)100%、提取時(shí)間30 s，電壓對(duì)龍膽苦苷提取率的影響見圖2。由圖可知，電壓從90 V變化到150 V時(shí)，提取率急劇增加；超過150 V后，提取率增加趨勢(shì)變緩，可能是因?yàn)殡妷涸礁?，閃式提取器內(nèi)刃轉(zhuǎn)速越高，顯著增加內(nèi)刃與外刃間的切割作用，促進(jìn)藥材的破碎，同時(shí)切割作用會(huì)使內(nèi)刃中心產(chǎn)生強(qiáng)力渦流，促進(jìn)整個(gè)體系處于劇烈攪拌之中，從而加速目標(biāo)成分在從細(xì)胞組織擴(kuò)散到提取劑中的速率［12］。但電壓過高會(huì)嚴(yán)重影響電機(jī)，故從降低能耗和保護(hù)設(shè)備的角度綜合考慮，選擇150 V作為最佳電壓。

圖2　電壓對(duì)龍膽苦苷提取率的影響

2.2.2藥材粒徑對(duì)龍膽苦苷提取率的影響 固定電壓150 V、料液比1∶20、乙醇體積分?jǐn)?shù)100%、提取時(shí)間30 s，藥材粒徑對(duì)龍膽苦苷提取率的影響見圖3。由圖可知，在粒徑小于80目時(shí)，提取率隨藥材粒徑的減小而急劇增加，但粒徑進(jìn)一步減小后無明顯變化，這可能是由于閃式提取器的破碎刀頭在設(shè)計(jì)時(shí)把破碎粒徑控制在一定范圍。目數(shù)越大，粒徑越小，與適當(dāng)溶劑混合后，在劇烈攪拌和和振動(dòng)作用下，藥材中的目標(biāo)成分能快速轉(zhuǎn)移到提取劑中，但粒徑過小時(shí)會(huì)增加后續(xù)的過濾的難度。因此，選擇80作為最佳粒徑。

圖3　藥材粒徑對(duì)龍膽苦苷提取率的影響

2.2.3乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)龍膽苦苷提取率的影響 固定電壓150 V、料液比1∶20、藥材粒徑80目、提取時(shí)間30 s，乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)龍膽苦苷提取率的影響見圖4。由圖可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)低于80%時(shí)，提取率隨著其增大而逐漸上升；進(jìn)一步增加乙醇體積分?jǐn)?shù)，提取率反而降低，這可能是由于乙醇滲透能力強(qiáng)于水，故乙醇體積分?jǐn)?shù)提高能加速目標(biāo)成分在提取劑和細(xì)胞基質(zhì)之間的溶解平衡；乙醇體積分?jǐn)?shù)越高，提取劑極性越小，而龍膽苦苷是極性分子，根據(jù)相似相溶原理，其溶解度將會(huì)減小，從而降低提取率。因此，選擇80%～100%作為乙醇最佳體積分?jǐn)?shù)。

圖4　乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)龍膽苦苷提取率的影響

2.2.4提取時(shí)間對(duì)龍膽苦苷提取率的影響 固定電壓150 V、料液比1∶20、藥材粒徑為80目、乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，提取時(shí)間對(duì)龍膽苦苷提取率的影響見圖5。由圖可知，在40 s前，提取率逐漸增加；40 s后，提取率反而急劇減小，這可能是由于經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間提取后，提取器破碎刀頭內(nèi)外刀刃間產(chǎn)生許多熱量，溶液溫度逐漸升高，超過一定溫度后龍膽苦苷被氧化，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)改變。因此，選擇20～40 s作為最佳提取時(shí)間。

圖5　提取時(shí)間對(duì)龍膽苦苷提取率的影響

2.2.5料液比對(duì)龍膽苦苷提取率的影響 固定電壓150 V、提取時(shí)間40 s、藥材粒徑80目、乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，料液比對(duì)龍膽苦苷提取率的影響見圖6。由圖可知，當(dāng)料液比由1∶10增加到1∶30時(shí)，提取率逐漸增加；進(jìn)一步增加溶劑用量，提取率反而急劇降低，這可能是因?yàn)殡S著提取劑用量不斷增加，小粒徑藥材與提取器破碎刀頭相互接觸的概率越來越小，從而引起刀頭剪切幾率下降，最終導(dǎo)致龍膽苦苷提取不完全。因此，選擇1∶20～1∶40作為最佳料液比。

2.3Box-Behnken響應(yīng)面分析

2.3.1模型建立及顯著性檢驗(yàn) 采用Design-Expert 8.0軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，結(jié)果見表2。

圖6　料液比對(duì)龍膽苦苷提取率的影響

表2　試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到回歸方程：Y=5.48+5× 10-3A-0.055B-0.020C+0.070AB-0.015AC-0.060BC-0.29A2-0.11B2-0.30C2。方差分析見表3。

表3　方差分析

由表3可知，該模型的F值為6.15，P值為0.012 8（小于0.05），表明該模型顯著。A2和C2項(xiàng)均表現(xiàn)出了非常顯著的作用 （P＜0.05），但其他因素影響不明顯 （P＞0.05），故料液比、提取時(shí)間與乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響未呈現(xiàn)一般線性相關(guān)性，相互影響作用非常小，可不予考慮［13］。失擬項(xiàng)F值為3.24，P值大于0.05，表明不存在異常點(diǎn)，模型無誤，不必引入更高次數(shù)的項(xiàng)進(jìn)行研究。R2=88.78%，表明試驗(yàn)中88.78%的數(shù)據(jù)可以用該模型來解釋［14］。綜上所述，該模型可靠性與準(zhǔn)確性較高。

2.3.2提取工藝的響應(yīng)曲面分析與優(yōu)化 為了更簡(jiǎn)明地表現(xiàn)2個(gè)考察因素同時(shí)對(duì)目標(biāo)成分提取率的影響，可令其它因素水平值為零［15］，將3個(gè)因素中的1個(gè)取零水平，分析另2個(gè)因素對(duì)響應(yīng)值的影響。結(jié)果見圖7。

圖7　響應(yīng)面圖

由圖可知，料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間對(duì)龍膽苦苷的提取率都有影響。但是，圖中曲線坡度均較小，變化緩慢，說明三者對(duì)龍膽苦苷提取率的影響不顯著。

采用Design-Expert軟件對(duì)參數(shù)作進(jìn)一步優(yōu)化，得到最優(yōu)條件為料液比1∶29.77，提取時(shí)間34.73 s，乙醇體積分?jǐn)?shù)69.93%。在此條件下，龍膽苦苷提取率達(dá)到5.49%。考慮操作可行性和簡(jiǎn)便性，最終確定為料液比1∶30，加入70%乙醇150 mL，在150 V電壓下提取35 s。

2.4最佳試驗(yàn)條件的結(jié)果驗(yàn)證 精密稱取樣品5.0 g，在最佳工藝下進(jìn)行提取，平行3次。結(jié)果，龍膽苦苷提取率達(dá)到5.37%，與響應(yīng)面預(yù)測(cè)值 （5.49%）相當(dāng)，表明該模型合理，試驗(yàn)結(jié)果理想。

2.5不同方法提取龍膽苦苷的比較 為了進(jìn)一步對(duì)該工藝進(jìn)行驗(yàn)證，本實(shí)驗(yàn)將其與傳統(tǒng)回流法［16］進(jìn)行比較，文獻(xiàn)報(bào)道的最佳工藝為稱取樣品5.0 g，加入50 mL 70%乙醇，71.5℃下提取3 h，龍膽苦苷提取率為4.96%。由此可知，本實(shí)驗(yàn)建立的方法耗時(shí)更短，能耗更低，而且提取率明顯增加。

3　結(jié)論

組織破碎法作為一種新型提取工藝，因具有操作簡(jiǎn)便、時(shí)間短、能耗低、提取率高等特點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于中草藥活性成分提取，本實(shí)驗(yàn)采用該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了龍膽草中有效成分龍膽苦苷的高效提取，確定最佳工藝條件為按照1∶30料液比加入70%乙醇，在150 V電壓下提取35 s，龍膽苦苷提取率達(dá)到5.37%。與傳統(tǒng)回流法相比，不僅提取時(shí)間明顯減少，而且提取率顯著提高，故該技術(shù)為工業(yè)生產(chǎn)中龍膽苦苷的提取提供了新的數(shù)據(jù)支撐和理論依據(jù)。

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R284.2

B

1001-1528（2016）06-1408-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2016.06.045

2015-04-10

吉林省教育廳科技計(jì)劃項(xiàng)目 （吉教科合字 ［2006］88號(hào)）

程振玉 （1986—），男，碩士生，助教，從事天然產(chǎn)物化學(xué)和有機(jī)分析研究。Te1：15843289508，E-mai1：chengzhenyu0633@ 126.com

楊英杰 （1955—），男，教授，從事精細(xì)有機(jī)化學(xué)合成與應(yīng)用研究。Te1：13843228673，E-mai1：yanghjm@163.com