張高菊， 楊生超， 沈 勇， 孟珍貴， 張廣輝（.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南昆明6500；.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，云南省優(yōu)勢(shì)中藥材規(guī)范化種植工程研究中心，云南昆明6500）

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云南栽培燈盞花指紋圖譜建立及4個(gè)成分測(cè)定

張高菊1， 楊生超2*， 沈 勇1， 孟珍貴1， 張廣輝2
（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南昆明650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，云南省優(yōu)勢(shì)中藥材規(guī)范化種植工程研究中心，云南昆明650201）

目的 采用HPLC法建立云南（大理、紅河、曲靖）栽培燈盞花Erigeron breviscapus（Vant.）Hand-Mazz.的指

紋圖譜，并測(cè)定綠原酸、3，5-二咖啡?？鼘幩?、飛蓬酯乙、燈盞乙素的含有量。方法 分析采用Agi1ent ZORBAX SBC18色譜柱 （250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相為0.3%磷酸 （A）-甲醇 （B），梯度洗脫；體積流量1.0 mL/min；檢

測(cè)波長(zhǎng)335 nm；柱溫20℃。結(jié)果 HPLC指紋圖譜中有17個(gè)共有峰，相似度大于0.971。紅河栽培燈盞花中燈盞乙

素和4個(gè)成分的總含有量明顯高于大理，但3，5-二咖啡?？鼘幩犸@著低于大理，兩地綠原酸和飛蓬酯乙相近。結(jié)論紅河栽培燈盞花質(zhì)量更穩(wěn)定，更有利于質(zhì)量控制。

燈盞花；云南；綠原酸；3，5-二咖啡?？鼘幩幔伙w蓬酯乙；燈盞乙素；指紋圖譜；HPLC

燈盞花又名燈盞細(xì)辛，為菊科飛蓬屬植物短葶飛蓬Erigeron breviscapus（vant.）Hand.Mazz.的干燥全草，為傳統(tǒng)苗藥，具有活血通絡(luò)止痛，祛風(fēng)散寒功效［1］。現(xiàn)代藥理研究證明，燈盞花的主要活性成分為黃酮 （苷）及酚類成分，包括燈盞乙素（野黃芩苷）、綠原酸、3，5-二咖啡?？鼘幩?、4，5-二咖啡酰奎寧酸、飛蓬酯乙等［2］，對(duì)中風(fēng)偏癱、老年癡呆、腦缺血等心腦血管疾病有較好的療效［3-5］。

燈盞花廣泛分布于我國(guó)西南各省，但由于市場(chǎng)需求量大，野生資源已無(wú)法滿足市場(chǎng)［6］。云南作為栽培燈盞花的主產(chǎn)區(qū)，由于不同栽培條件、采收季節(jié)等原因?qū)е缕滟|(zhì)量參差不齊，因此有必要采取相應(yīng)手段對(duì)該藥材質(zhì)量進(jìn)行控制。前人對(duì)栽培燈盞花進(jìn)行過(guò)大量的指紋圖譜研究［7-10］，或只對(duì)其主要成分進(jìn)行定性定量分析［11-12］，本實(shí)驗(yàn)擬建立栽培燈盞花HPLC指紋圖譜，確定指紋峰，同時(shí)測(cè)定綠原酸、3，5-二咖啡?？鼘幩?、飛蓬酯乙、燈盞乙素4個(gè)化合物含有量，為其質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。

1　材料

燈盞花地上部分于2014年10月采自云南大理、曲靖和紅河3個(gè)州 （市），共22批 （S1～S20），經(jīng)云南農(nóng)業(yè)大學(xué)楊生超教授鑒定為燈盞花E.breviscapus。

2　儀器與試藥

Agi1ent 1260系列高效液相色譜儀，包括G1311C四元泵、G1329B自動(dòng)進(jìn)樣儀、G1315D光電二極管陣列檢測(cè)器和Agi1ent Chem Station工作站（美國(guó)Agi1ent公司）；NewC1assic MS半微量型電子天平 （瑞士梅特勒-托利多公司）。

綠原酸、3，5-二咖啡?？鼘幩帷w蓬酯乙和燈盞乙素對(duì)照品 （北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司，含有量均大于98%）。甲醇為色譜純；磷酸為分析純；水為超純水 （18.2ΩPa）。

3　方法與結(jié)果

3.1溶液的制備

3.1.1對(duì)照品溶液 精密稱取燈盞乙素、綠原酸、飛蓬酯乙和3，5-二咖啡?？鼘幩釋?duì)照品適量，甲醇定容到10 mL量瓶中，搖勻，制得分別含4種成分410.0、300.0、432.0和223.0μg/m L的混合對(duì)照品溶液，4℃下保存，備用。

3.1.2供試品溶液 精密稱取燈盞花樣品粉末0.5 g，精密加入70%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，浸泡過(guò)夜，超聲提取30min，70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，即得［13］。

3.2方法學(xué)建立

3.2.1色譜條件 Agi1ent ZORBAX SB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相為0.3%磷酸水 （A）-甲醇 （B），梯度洗脫 （0～20 min，10%→20%B；20～34 min，20%→31%B；34～45 min，31%→80%B）；體積流量1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)335 nm；柱溫20℃；進(jìn)樣量5μL。

3.2.2線性關(guān)系考察 精密吸取 “3.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.5、1、2、5、10μL，依次注入HPLC色譜儀，在“3.2.1”項(xiàng)色譜條件下分析，以色譜峰峰面積為縱坐標(biāo) （y），進(jìn)樣量為橫坐標(biāo) （x）繪制回歸方程 （表1），對(duì)照品圖譜見(jiàn)圖1。

表1　4種成分回歸方程Tab.1 Regression equations of four constituents

圖1　對(duì)照品HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of reference substance

3.2.3精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液5μL，在 “3.2.1”項(xiàng)色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)得燈盞乙素、綠原酸、飛蓬酯乙和3，5-二咖啡?？鼘幩岱迕娣e和保留時(shí)間RSD均小于1.0%，表明儀器精密度良好。

3.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液 （S20）適量，在 “3.2.1”項(xiàng)色譜條件下于0、2、4、6、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得燈盞乙素、綠原酸、飛蓬酯乙和3，5-二咖啡?？鼘幩岱迕娣eRSD均小于1.2%，保留時(shí)間RSD均小于0.8%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.2.5重復(fù)性試驗(yàn) 按 “3.1.2”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液 （S20）5份，每份進(jìn)樣5μL，在“3.2.1”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定，測(cè)得燈盞乙素、綠原酸、飛蓬酯乙和3，5-二咖啡酰奎寧酸平均含有量分別為13.212、1.397、3.662、1.215 mg，峰面積RSD均小于1.1%，保留時(shí)間RSD均小于0.1%，表明該方法重復(fù)性良好。

3.2.6加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取各成分含有量已知的燈盞花 （S20）0.25 g，平行5份，分別加入1.203、0.165、0.340和0.114 mg/mL燈盞乙素、綠原酸、飛蓬酯乙和3，5-二咖啡?？鼘幩釋?duì)照品5 mL，70%甲醇定容至50 mL，按“3.1.2”項(xiàng)下方法制得供試品溶液，在 “3.2.1”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of recovery tests

3.3指紋圖譜相似性評(píng)價(jià) 以燈盞花 （S20）為參照譜，利用中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004A）軟件對(duì)采集的22批樣品進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，得到指紋圖譜。匹配結(jié)果顯示，有17個(gè)共有峰 （圖2～3），相似度見(jiàn)表3。

圖2　樣品典型HPLC色譜圖Fig.2 Typical HPLC chromatogram of sam ple

圖3　HPLC指紋圖譜Fig.3 HPLC fingerprints

表3　22批樣品相似度Tab.3 Sim ilarities of twenty-tw o batches of sam p les

3.4樣品測(cè)定 外標(biāo)法計(jì)算22批樣品中綠原酸、3，5-二咖啡?？鼘幩帷w蓬酯乙和燈盞乙素的含有量。結(jié)果見(jiàn)表4，統(tǒng)計(jì)分析見(jiàn)表5。

表4　含有量測(cè)定結(jié)果Tab.4 Resultsofcontentdetermination

表5　統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果 （±s）Tab.5 Resultsofstatisticalanalysis（±s）

表5　統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果 （±s）Tab.5 Resultsofstatisticalanalysis（±s）

注：與大理比較，*P＜0.05。由于曲靖僅采集到2批樣品，故未進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析

采集地　　綠原酸/%　3，5-二咖啡?？鼘幩?%　　飛蓬酯乙/%　　燈盞乙素/%　　總含有量/%大理　0.311±0.063　0.386±0.177*0.524±0.063　1.976±0.146　3.196±0.337紅河　0.344±0.075　0.268±0.028　0.693±0.044　2.640±0.050*　3.945±0.143*

4　討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)22批云南栽培燈盞花樣品進(jìn)行指紋圖譜分析，結(jié)果顯示所有樣品相似度都大于0.971，共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD在0.01%～0.25%之間，峰面積RSD在11.99%～72.46%之間，其含有量差異顯著，但化學(xué)成分組成不顯著。大理地區(qū)相似系數(shù)大于0.957，RSD為1%；紅河地區(qū)相似系數(shù)大于0.996，RSD為0.002%，說(shuō)明紅河產(chǎn)燈盞花質(zhì)量更穩(wěn)定。對(duì)2個(gè)地區(qū)4種成分含有量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)紅河產(chǎn)燈盞花中燈盞乙素和4種成分總含有量顯著高于大理，但3，5-二咖啡酰奎寧酸顯著低于大理；2個(gè)地區(qū)燈盞乙素含有量均在1.67%以上，遠(yuǎn)高于藥典標(biāo)準(zhǔn)的0.3%；綠原酸和飛蓬酯乙差異不顯著，這可能與地理環(huán)境差異和栽培管理技術(shù)有關(guān)。

燈盞花具有活血通絡(luò)止痛，祛風(fēng)散寒功效，以其中燈盞花素為原料的制劑有燈盞花素注射液、燈盞花素片等，已廣泛用于治療心腦血管疾病。孫漢董等［2］研究發(fā)現(xiàn)，燈盞花中的酚性成分 （3，5-二咖啡?？鼘幩?、4，5-二咖啡?？鼘幩?、1，5-二咖啡酰奎寧酸、飛蓬酯乙等）具有與燈盞乙素相當(dāng)?shù)目寡āU(kuò)張血管活性，這為燈盞花綜合開(kāi)發(fā)利用提供了依據(jù)。上述指紋圖譜分析及含有量測(cè)定結(jié)果表明，云南產(chǎn)栽培燈盞花質(zhì)量穩(wěn)定，有效成分含有量高，尤以瀘西產(chǎn)燈盞花質(zhì)量更穩(wěn)定均一，更有利于質(zhì)量控制，可作為各種以燈盞花為原料藥制劑的首選。

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Establishment of fingerprints of Erigeron breνiscapus cultivated in Yunnan and determ ination of four constituents

ZHANG Gao-ju1， YANG Sheng-chao2*， SHEN Yong1， MENG Zhen-gui1， ZHANG Guang-hui2
（1.College of Agriculture and Biotechnology，Yunnan Agricultural University，Kunming 650201，China；2.Yunnan Provincial Research Center of Good Agriculture Practice for Dominant Chinese Medicinal Materials，Yunnan Agriculture University，Kunming 650201，China）

AIM To estab1ish the fingerprints of Erigeron breviscapus（Vant.）Hand-Mazz.cu1tivated in Yunnan（Da1i，Honghe and Qujing）and to determine the contentsof ch1orogenic acid，3，5-dicaffey1quinic acid，erigoster B and scute11arin by HPLC.METHODS The ana1ysiswas carried out on an Agi1ent ZORBAX SB-C18co1-umn（250 mm×4.6mm，5μm），mobi1e phase was0.3%phosphoric acid（A）-acetonitri1e（B）with gradient e1ution，f1ow rate was 1.0 mL/min，detection wave1ength was set at 335 nm，and co1umn temperature was maintained at20℃.RESULTS There were seventeen common peaks in the HPLC fingerprints，whose simi1aritiesweremore than 0.971.The contents of scute11arin and tota1contentof four constituents in E.Breviscapus cu1tivated in Honghe were significant higher than those cu1tivated in Da1i，but 3，5-dicaffey1quinic acid content was 1ower，and the contents of ch1orogenic acid and erigoster B in these two districtswere simi1ar.CONCLUSION The qua1ity of E.Breviscapus cu1tivated in Honghe ismore stab1e，which ismore beneficia1 for qua1ity contro1.

Erigeron breviscapus（Vant.）Hand-Mazz.；Yunnan；ch1orogenic acid；3，5-dicaffey1quinicacid；erigoster B；scute11arin；fingerprints；HPLC

R284.1

A

1001-1528（2016）06-1315-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2016.06.023

2015-08-03

國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目 （2011BAI13B05）

張高菊（1988—），女，碩士生，研究方向?yàn)樗幱弥参镔Y源化學(xué)與開(kāi)發(fā)利用。E-mai1：zhanggaoju2665@163.com

楊生超 （1972—），男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)樗幱弥参镔Y源與規(guī)范化種植。Te1：（0871）5227059，E-mai1：shengchaoyang@163.com