曹 波， 尹海波， 賈曉晴， 邵 飛（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧大連116600）

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HPLC法同時(shí)測(cè)定3種老鸛草中7種成分

曹 波， 尹海波*， 賈曉晴， 邵 飛
（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧大連116600）

目的 建立HPLC法同時(shí)測(cè)定老鸛草Geranium wilfordii Maxim.、牻牛兒苗Erodium stephanianum W i11d.和野老鸛草Geranium carolinianum L.中沒食子酸、原兒茶酸、柯里拉京、老鸛草素、鞣花酸、金絲桃苷和槲皮素的含有量。方法 分析采用Agi1ent 5TC-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相乙腈-0.1%磷酸，梯度洗脫；體積流量1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm（0～32 min）、360 nm（32～62 min）；柱溫30℃。SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果3種老鸛草中7種成分含有量均依次為老鸛草素＞柯里拉京＞鞣花酸＞沒食子酸＞原兒茶酸＞金絲桃苷＞槲皮素。其中，沒食子酸、槲皮素含有量呈顯著性差異 （P＜0.05）。結(jié)論 7種成分含有量在牻牛兒苗和野老鸛草中相近，而在老鸛草中較低。

老鸛草；牻牛兒苗；野老鸛草；化學(xué)成分；HPLC

老鸛草藥材始見于 《滇南本草》［1］，《中國(guó)藥典》2015版規(guī)定其有3種不同來源，分別為牻牛兒苗Erodium stephanianum Wi11d.、老鸛草Geranium wilfordii Maxim.和野老鸛草Geranium carolinianum L.［2］，其主要化學(xué)成分包括黃酮、鞣質(zhì)、有機(jī)酸和揮發(fā)油［3-4］。目前，對(duì)老鸛草藥材進(jìn)行含有量測(cè)定的報(bào)道很多［5-10］，但鮮有對(duì)這3種老鸛草多指標(biāo)成分測(cè)定及比較的研究［11］。為了能夠更加全面有效地評(píng)價(jià)三者的質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法同時(shí)測(cè)定老鸛草藥材中7種活性成分沒食子酸、原兒茶酸、柯里拉京、老鸛草素、鞣花酸、金絲桃苷和槲皮素的含有量。

1　儀器與試藥

Agi1ent1100色譜儀，包括Chemstation化學(xué)工作站（美國(guó)Agi1ent公司）；電子天平（德國(guó)Sartorius公司）；超聲清洗器 （昆山市超聲儀器有限公司）。沒食子酸、原兒茶酸、槲皮素 （中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為 110831-200302、110809-200604、100081-200406）；柯里拉京、金絲桃苷 （上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)分別為PM0529SA14、RA0504FA14）；老鸛草素、鞣花酸 （上海融禾醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)分別為100503、091227）。乙腈、磷酸為色譜純 （天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；其他試劑均為分析純；水為市售哇哈哈純凈水。21批藥材均為野生，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)尹海波教授鑒定分別為老鸛草G.wilfordii、牻牛兒苗E.stephanianum、野老鸛草G.carolinianum，樣品信息見表1。

表1　樣品信息Tab.1 Information of sam p les

2　方法與結(jié)果

2.1試樣的制備及色譜條件

2.1.1對(duì)照品溶液的制備［12］稱取沒食子酸、原兒茶酸、柯里拉京、老鸛草素、金絲桃苷、槲皮素對(duì)照品1.25、0.59、8.95、11.8、0.65、0.13mg，置于10 m L棕色量瓶中，甲醇溶解并定容，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液。另稱取干燥至恒重的鞣花酸對(duì)照品7.25 mg，置于5 mL棕色量瓶中，二甲基亞砜溶解并定容［13］，搖勻，即得。

2.1.2供試品溶液的制備［12］精密稱取3種老鸛草藥材粉末 （40目）2 g，置于圓底燒瓶中，并加入200 mL甲醇，回流提取1 h，共2次，合并濾液蒸干，甲醇定容至25 m L棕色量瓶中，0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3色譜條件 Agi1ent 5TC-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相為乙腈 （A）-0.1%磷酸水溶液 （B），梯度洗脫 （0～10 min，4%～5%A；10～15 min，5%～12%A；15～20 min，12%～14%A；20～30 min，14%～15%A；30～40 min，15%～21%A；40～50 min，21%A；50～60 min，21%～45%A；60～62 min，45%A）；柱溫30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm（0～32min）和360 nm（32～62 min）；體積流量1 mL/min；進(jìn)樣量10μL。色譜圖見圖1。

圖1　HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

2.2方法學(xué)考察

2.2.1線性關(guān)系 精密量取混合和鞣花酸對(duì)照品溶液各2.5 mL，置于5 mL棕色量瓶中，甲醇和二甲基亞砜稀釋至刻度，搖勻，連續(xù)稀釋4次，即得一系列質(zhì)量濃度溶液，在“2.1.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣10μL分析。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo) （Y）進(jìn)行回歸，結(jié)果見表2。

表2　7種成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線Tab.2 Standard curves of seven constituents

2.2.2精密度試驗(yàn) 分別取同一混合及鞣花酸對(duì)照品溶液，在 “2.1.3”項(xiàng)條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)得沒食子酸、原兒茶酸、柯里拉京、老鸛草素、鞣花酸、金絲桃苷、槲皮素峰面積RSD分別為1.66%、 1.83%、 1.74%、1.55%、1.28%、1.69%、1.77%，表明儀器精密度良好。

2.2.3穩(wěn)定性試驗(yàn) 將供試品溶液 （S20）置于室溫下，于0、2、4、6、8、10 h進(jìn)樣檢測(cè)，測(cè)得沒食子酸、原兒茶酸、柯里拉京、老鸛草素、鞣花酸、金絲桃苷、槲皮素峰面積RSD分別為1.59%、1.70%、 1.29%、 1.54%、1.12%、1.88%、1.59%，表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.4重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取藥材粉末 （S20）6份，按 “2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1.3”項(xiàng)條件下測(cè)定，測(cè)得沒食子酸、原兒茶酸、柯里拉京、老鸛草素、鞣花酸、金絲桃苷、槲皮素峰面積RSD分別為1.47%、1.70%、1.20%、1.56%、1.04%、1.62%、1.53%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.5加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取含有量已知的樣品藥材 （S20）9份，每份1 g，每3份為1組，每組按低、中、高質(zhì)量濃度分別加入相當(dāng)于藥材含有量50%、100%、150%的對(duì)照品，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在 “2.1.3”項(xiàng)色譜條件下分析，結(jié)果見表3。

2.3結(jié)果與分析

2.3.1含有量測(cè)定 精密吸取供試品溶液10μL，在“2.1.3”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定，結(jié)果見表4和圖2。

表3　加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Results of recovery tests

表4　含有量測(cè)定結(jié)果（mg/g）Tab.4 Results of content determ ination（mg/g）

2.3.2各成分含有量及總含有量平均值的比較

見圖3～4，采用SPSS 17.0軟件，對(duì)3種老鸛草中7種成分含有量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果表明，僅原兒茶酸（P=0.433＞0.05）、鞣花酸（P=0.374＞0.05）、槲皮素 （P=0.063＞0.05）符合正態(tài)分布。將三者進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)原兒茶酸（P=0.269＞0.05）、鞣花酸 （P=0.804＞0.05）、槲皮素 （P=0.698＞0.05）均滿足，再進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表5～6。將不符合正態(tài)分布的其他4種成分進(jìn)行Kruska1-Wa11is檢驗(yàn)，結(jié)果見表7。

圖2　各成分含有量折線圖Fig.2 Line graphs of contents of various constituents

圖3　各成分含有量平均值直觀圖Fig.3 Visual diagram s of average contents of various constituen ts

圖4　各成分總含有量平均值直觀圖Fig.4 Visual diagram s of average total conten ts of various constituen ts

3　討論與結(jié)論

由圖2可知，3種老鸛草中7種成分含有量由高到低，依次為老鸛草素、柯里拉京、鞣花酸、沒食子酸、原兒茶酸、金絲桃苷、槲皮素。其中，金絲桃苷和槲皮素為黃酮類成分，其他均為鞣質(zhì)類成分。由圖3和圖4可知，不同產(chǎn)地老鸛草中各成分含有量平均值低于牻牛兒苗和野老鸛草，其總含有量平均值差異更明顯，而牻牛兒苗和野老鸛草基本相近。因此，老鸛草的質(zhì)量可能不如其他2種。

表5　方差分析Tab.5 Analysis of variance

表6　多重比較結(jié)果Tab.6 Results of multip le com parisons

表7　非參數(shù)檢驗(yàn)結(jié)果Tab.7 Results of non-parametric tests

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，對(duì)3種老鸛草中7種成分含有量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)三者沒食子酸 （P= 0.039＜0.05，表7）、槲皮素 （P=0.038＜0.05，表5）存在明顯差異。再對(duì)槲皮素成分進(jìn)行多重比較分析，發(fā)現(xiàn)野老鸛草與老鸛草 （P=0.021＜0.05，表6）、牻牛兒苗 （P=0.032＜0.05，表6）組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)合槲皮素含有量平均值（野老鸛草0.150 mg/g、老鸛草0.077 mg/g、牻牛兒苗0.083 mg/g）可知，野老鸛草中槲皮素成分含有量高于其他2種。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)以7種成分含有量為指標(biāo)，采用HPLC法對(duì)3種老鸛草進(jìn)行定量比較研究，可為 《中國(guó)藥典》中該藥材用藥的準(zhǔn)確性以及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供一定參考依據(jù)。

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Simultaneous determ ination of seven constituents in three kinds of cranesbill by HPLC

CAO Bo， YIN Hai-bo*， JIA Xiao-qing， SHAO Fei
（School of Pharmacy，Liaoning University of Traditional ChineseMedicine，Dalian 116600，China）

AIM To estab1ish an HPLCmethod for simu1taneous determining the contents of ga11ic acid，protocatechuic acid，cori1agin，geraniin，e11agic acid，hyperoside and quercetin in Geranium wilfordii Maxim.，Erodium stephanianum Wi11d.and Geranium carolinianum L..METHODS The ana1ysiswas performed on an Agi1ent C18co1umn（4.6 mm×250 mm，5μm），mobi1e phase was acetonitri1e-0.1%H3PO4with gradient e1ution，f1ow rate was 1 mL/min，detection wave1engths were set at 280 nm（0-32 min）and 360 nm（32-62 min），and co1-umn temperature wasmaintaned at30℃.SPSS17.0 software was used for data ana1ysis.RESULTS The contents of seven constituents in three kinds of cranesbi11were a11 in sequence of geraniin＞cori1agin＞e11agic acid＞ga11ic acid＞protocatechuic acid＞hyperoside＞quercetin.Among them，the contents of ga11ic acid and quercetin showed significant differeces（P＜0.05）.CONCLUSION The contents of seven constituents are simi1ar in E. stephanianum and G.carolinianum，which are 1ower in G.wilfordii.

Geranium wilfordii Maxim.；Erodium stephanianum Wi11d.；Geranium carolinianum L.；chemica1 constituents；HPLC

R284.1

A

1001-1528（2016）06-1338-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2016.06.027

2015-10-25

中醫(yī)藥行業(yè)科研專項(xiàng) （201407002）

曹 波 （1990—），女，碩士生，研究方向?yàn)榉N質(zhì)資源鑒定及中藥品質(zhì)評(píng)價(jià)。Te1：13998416323，E-mai1：1156034502@ qq.com

尹海波 （1973—），男，博士，教授，研究方向?yàn)榉N質(zhì)資源鑒定及中藥品質(zhì)評(píng)價(jià)。Te1：（0411）87586003，E-mai1：yhb0528@sina.com