張榮　章淑杰　陳君毅　何杰　吳繼紅

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·基礎研究·

神經(jīng)干細胞標志物nestin在成人Müller細胞中表達特征的初步研究△

張榮章淑杰陳君毅＊何杰＊＊吳繼紅

目的研究神經(jīng)干細胞標志物巢蛋白(nestin)在原位和體外培養(yǎng)成人Müller細胞中的表達特征。方法取正常成人眼球，制備冷凍切片，采用免疫熒光方法對谷氨酸合成酶(GS)和nestin進行雙標檢測；采用免疫熒光方法檢測原代和傳代培養(yǎng)的Müller細胞nestin表達；取原代培養(yǎng)的成人Müller細胞給予過氧化氫(H2O2)刺激，采用免疫熒光方法檢測膠質纖維酸性蛋白(GFAP)和nestin的表達，并計數(shù)分析。結果在成人眼球切片中，原位成人Müller細胞GS免疫熒光染色陽性，但nestin染色陰性。原代培養(yǎng)的Müller細胞中檢測到部分nestin陽性表達的細胞，10代以內細胞nestin陽性比例為(15.16%±5.07%)～(22.42%±4.6%)，且代次間無顯著差異。H2O2刺激原代培養(yǎng)的Müller細胞后，GFAP陽性細胞數(shù)增加，是對照組的1.30～2.08倍，但nestin陽性細胞比例未見顯著變化。結論正常成人Müller細胞原位時呈靜息狀態(tài)，不表達干細胞標志物nestin；體外培養(yǎng)條件可能作為一種刺激因素使部分Müller細胞離開靜息狀態(tài)呈現(xiàn)干細胞特性；人Müller細胞在體外傳代及H2O2刺激后nestin陽性細胞數(shù)未見顯著變化，提示并非全部Müller細胞均具有干細胞潛能，成人Müller細胞可能存在不同的亞型。(中國眼耳鼻喉科雜志，2016，16：305-308)

成人Müller細胞；巢蛋白；干細胞潛能；亞型

視網(wǎng)膜Müller細胞是哺乳動物視網(wǎng)膜內最主要的神經(jīng)膠質細胞，占視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質細胞的90%以上。Müller細胞不僅在視網(wǎng)膜的病理生理方面起著重要作用，而且在視網(wǎng)膜受損后，還可以成為修復視網(wǎng)膜的干細胞來源[1-2]。成人Müller細胞被認為是視網(wǎng)膜中唯一具有干細胞潛能的一類神經(jīng)細胞，并且Müller細胞在很多病理條件下可以被激活。然而，是否全部成人Müller細胞均具有干細胞潛能，尚未見報道。因此，本實驗對比研究了成人Müller細胞在視網(wǎng)膜原位和體外原代培養(yǎng)及氧化損傷刺激后Müller干細胞特性表達的特征。

1　材料與方法

1.1材料DMEM/F12培養(yǎng)基：Thermo；胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)：Thermo；谷氨酸合成酶(glutamine synthetase,GS)抗體：abcam，ab16802；波形蛋白(vimentin)抗體：abcam，ab8978；nestin抗體：abcam；膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)抗體：cell signaling technology，12389；hoechst33258：Thermo，H3569；共聚焦熒光顯微鏡(SP8，Leica，德國)。

1.2方法

1.2.1成人Müller細胞在視網(wǎng)膜原位nestin的檢測成人眼球經(jīng)4%多聚甲醛固定，蔗糖脫水后，制成10 μm的冷凍切片；磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)沖洗3次，每次3 min;0.1%Triton X-100 (PBS配制 )室溫通透20 min；PBS沖洗玻片3次，每次3 min；3%牛血清白蛋白(BSA)室溫封閉30 min，吸棄BSA；無需沖洗，加GS(1∶200)和nestin(1∶200)混合一抗并放入濕盒，4 ℃孵育過夜。第2天，PBS沖洗3次，每次5 min；加488和555標記的混合熒光二抗，濕盒中置室溫孵育1 h；PBS沖洗3次，每次5 min。hoechst染核，2～3 min；PBS沖洗3次，每次5 min；用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.2.2成人Müller細胞的原代培養(yǎng)和鑒定取離體6 h內、角膜移植后的眼杯，自鋸齒緣后1～2 mm處環(huán)形剖開眼球，去除眼前部組織及玻璃體，留后半眼球壁于PBS中；輕輕剝離視網(wǎng)膜組織，將其放于含PBS的培養(yǎng)皿中進行漂洗，洗去組織上粘連的色素上皮，吸去PBS；將視網(wǎng)膜組織剪碎，加入5倍組織塊體積的0.25%胰酶于細胞培養(yǎng)箱中消化；20 min后取出，加入等體積含15%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液，用移液器吹打至看不到明顯組織，1 200轉/min離心5 min，棄上清液；加入含15%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液制成細胞懸液接種于培養(yǎng)瓶中，置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱(37 ℃，體積分數(shù)5%CO2)中培養(yǎng)，待細胞生長近80%～90%匯合時，以1∶2方式傳代。將Müller細胞接種于細胞爬片上，在培養(yǎng)板中將已爬好細胞的玻片用PBS浸洗3次，每次3 min；用4%多聚甲醛固定爬片15 min，PBS浸洗玻片3次，每次3 min；0.1%Triton X-100(PBS配制)室溫通透20 min,PBS浸洗玻片3次，每次3 min；3%BSA室溫封閉30 min，吸棄BSA，無需沖洗，加GS(1∶200)和vimentin(1∶200)一抗并放入濕盒，4 ℃孵育過夜。第2天，PBS沖洗3次，每次5 min；加488和555標記的熒光二抗，濕盒中室溫孵育1 h；PBS沖洗3次，每次5 min；hoechst染核，2～3 min，PBS沖洗3次，每次5 min；用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.2.3成人Müller細胞傳代培養(yǎng)后nestin的檢測原代成人Müller細胞在體外傳代培養(yǎng)到第10代，每一代都用免疫熒光方法雙標GS和nestin。

1.2.4H2O2刺激成人Müller細胞后nestin表達的檢測取第4代成人Müller細胞接種于24孔板，每孔接種104個細胞。分為對照組和H2O2處理組，其中H2O2處理組再依據(jù)濃度不同分為5個組，濃度分別為1、10、100、200、500 μmol/L。每組2孔，4 h后用免疫熒光方法檢測GFAP和nestin的表達。

1.2.5細胞免疫熒光圖像分析每個細胞爬片計數(shù)全部GFAP陽性細胞。每個細胞爬片任選3個視野，對nestin陽性細胞進行計數(shù)。

1.3統(tǒng)計學處理實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差表示，應用SPSS統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1人視網(wǎng)膜冷凍切片免疫熒光結果成人Müller細胞在視網(wǎng)膜原位表達其特異性標志物GS，但nestin染色為陰性(圖1)。

圖1.　人視網(wǎng)膜冷凍切片GS和nestin免疫熒光染色　成人視網(wǎng)膜中Müller細胞GS表達陽性，nestin表達為陰性(×400)

2.2體外培養(yǎng)人視網(wǎng)膜Müller細胞形態(tài)和免疫熒光鑒定相差顯微鏡下觀察原代人視網(wǎng)膜Müller細胞，胞體較大，呈雙極形態(tài)(圖2A)。融合后，細胞變得細長，呈成纖維細胞形態(tài)(圖2B)。免疫熒光結果顯示，絕大多數(shù)細胞表達Müller細胞特異性標志GS (圖2C)和vimentin(圖2D)。

圖2.　人視網(wǎng)膜Müller細胞的形態(tài)和鑒定　A.原代人視網(wǎng)膜Müller細胞，胞體較大，呈雙極形態(tài)(×100)；B.融合后，細胞變得細長，呈成纖維細胞形態(tài)(×100)；C，D.免疫熒光染色，絕大多數(shù)細胞表達Müller細胞特異性標志蛋白GS和vimentin(×200)

2.3部分原代培養(yǎng)的Müller細胞表達nestin免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)部分原代培養(yǎng)的Müller細胞呈現(xiàn)GS與nestin共染(圖3)。計數(shù)分析結果顯示nestin陽性率在10代內穩(wěn)定在(15.16%±5.07%)～(22.42%±4.6%)，且代次間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖4)。

圖3.　原代人Müller細胞GS和nestin免疫熒光染色部分原代培養(yǎng)的Müller細胞同時表達GS與nestin(×200)

圖4.　體外培養(yǎng)成人Müller細胞p0-p10nestin陽性細胞比例　nestin陽性率在10代內穩(wěn)定在(15.16%±5.07%)～(22.42%±4.6%)，且代次間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)

2.4H2O2刺激體外培養(yǎng)成人Müller細胞結果500 μmol/L H2O2處理組細胞出現(xiàn)明顯損傷死亡，大量細胞漂浮，其余各組GFAP陽性細胞數(shù)量是對照組的1.30～2.08倍，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)(圖5)；但nestin陽性細胞未見顯著變化(P>0.05)(圖6)，陽性細胞穩(wěn)定在(19.32%±1.49%)～(22.17%±5.69%)，且未觀察到GFAP和nestin同時表達在相同細胞上(圖7)。

圖5.　H2O2刺激體外培養(yǎng)成人Müller細胞后GFAP陽性細胞數(shù)500 μmol/L H2O2處理組細胞出現(xiàn)明顯損傷死亡，大量細胞漂浮，H2O2處理組GFAP陽性細胞數(shù)量與對照組相比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)

圖6.　H2O2刺激原代成人Müller細胞后nestin陽性細胞百分比變化各H2O2處理組較對照組nestin陽性細胞未見顯著變化(P>0.05)，陽性細胞百分比穩(wěn)定在(19.32%±1.49%)～(22.17%±5.69%)

圖7.　H2O2刺激原代成人Müller細胞后GFAP和nestin的表達　H2O2刺激后未觀察到GFAP和nestin同時表達在相同細胞中(×100)

3　討論

視網(wǎng)膜Müller細胞是一種特殊的神經(jīng)膠質細胞，在視網(wǎng)膜中發(fā)揮重要的生理作用。2001年Fischer等[3]首次提出Müller細胞可成為神經(jīng)元再生的潛在資源后，Das等[4]進一步證實哺乳動物的Müller細胞具有神經(jīng)源性多能干細胞潛能。近年的研究表明，人的視網(wǎng)膜Müller細胞經(jīng)成纖維細胞生長因子2或維A酸刺激表現(xiàn)為干細胞分化的多能性[5]，并且人的視網(wǎng)膜Müller細胞能在體外誘導分化為神經(jīng)節(jié)前體細胞和光感受器[6-7]。Müller細胞是神經(jīng)元再生的安全、可靠潛在來源，因此研究成人Müller細胞的干細胞特性表達特征十分重要。

本文建立了原代成人Müller細胞系，該系在體外長期傳代并能保持屬性的穩(wěn)定，表達Müller細胞特異性標記GS和vimentin。nestin是神經(jīng)干細胞的重要標記，本實驗結果表明Müller細胞在視網(wǎng)膜原位時不表達nestin，提示Müller細胞在正常視網(wǎng)膜中處于靜息狀態(tài)，不表現(xiàn)出干細胞的性質。而體外培養(yǎng)的原代Müller細胞除了表達GS和vimentin之外，部分Müller細胞同時表達神經(jīng)干細胞標記nestin。因此，體外分離培養(yǎng)條件可能是一種刺激因素，使部分Müller細胞離開靜息狀態(tài)表現(xiàn)出干細胞特性。隨著傳代次數(shù)的增加，表達nestin的Müller細胞比例沒有顯著變化。H2O2產(chǎn)生的活性氧可以刺激Müller細胞激活，使其表達激活標記物GFAP。本實驗中，Müller細胞激活后，GFAP顯著增加，但nestin沒有顯著變化，并且被激活的細胞不同時表達nestin。以上實驗結果說明了只有一定比例的Müller細胞可以被刺激而表現(xiàn)出干細胞特性，這群細胞可能是Müller細胞的一種亞型。

人的視網(wǎng)膜Müller細胞能在體外誘導分化為神經(jīng)節(jié)前體細胞和光感受器，但是誘導分化效率并不是很高。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，人Müller細胞可能存在不同亞型，將具有干細胞特性的細胞分開培養(yǎng)，有利于我們更好地研究認識Müller細胞，也可能是提高Müller細胞分化效率的新方法。

[1]Nickerson PE，Da SN，Myers T，et al．Neural progenitor potential in cultured Müller glia：effects of passaging and exogenous growth factor exposure[J].Brain Res，2008，1230：1-12.

[2]Bemardos RL，Barthel LK，Meyers JR，et al．Late-stage neuronal progenitors in the retina are radial Müller glia that function as retinal stem cells[J].J Neurosci，2007,27(26)：7028-7040.

[3]Fischer DJ，Reh TA．Mailer glia are a potential source of neural regeneration in the postnatal chicken retina[J].Nat Neurosci，2001，4(3)：247-252.

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(本文編輯諸靜英)

Preliminary study on the expression of the neural stem cell marker nestin in human Müller cells

ZHANGRong,ZHANGShu-jie,CHENJun-yi＊,HEJie＊＊,WUJi-hong.

ResearchCenter,EyeEarNoseandTroatHospitalofFudanUniversity,Shanghai200031,China

WU Ji-hong， Email： jihongwu@fudan.edu.cn

ObjectiveTo study the stem cell properties of human retinal Müller cellsinsituandinvitro. MethodsThe expression of glutamate synthase (GS) and nestin in the crynosections of human eyes, the expression of nestin in the primary Müller cell culture, and the expression of glial fibrillary acidic protein (GFAP) and nestin with the treatment of H2O2were examined by using immunofluorescence staining. ResultsIn the human eye section, Müller cells were positive in GS but negative in nestin. In contrast, in the primary culture, nestin was expressed in a small set of Müller cells, which constituted from 15.16%±5.07% to 22.42%±4.6% of the total Müller cell population. And such proportion was invariable within ten generations.Upon H2O2treatment, the GFAP-positive cells increased while the nestin-expressing cell population remained unchanged. ConclusionsIn adult human eye, Müller cells were in the resting state and nestin was absent. However, soon after culturedinvitro, a subset of Müller cells started to express nestin, a maker for stem cells, suggesting that the culture condition probably facilitated a portion of the Müller cells to leave the resting state. Upon H2O2treatment, the number of the nestin-positive cells which potentially have the characteristics of stem cells did not change significantly, suggesting the existence of distinct subtypes of human Müller cells. (Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2016,16: 305-308)

Human Müller cells；Nestin；Stem cell potential；Subtype

國家自然科學基金(81470624)；上海市衛(wèi)生局局級科研項目(20124073)；上海市科委醫(yī)學引導項目(134119a880)

復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院實驗中心＊眼科上海200031；＊＊中國科學院神經(jīng)科學研究所上海200031

吳繼紅(Email: jihongwu@fudan.edu.cn)

10.14166/j.issn.1671-2420.2016.05.001

2016-06-13)